СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУКОПОЛИСАХАРИДОЗОВ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для диагностики заболеваний, связанных с нарушением обмена соединительной ткани врожденной и приобретенной этиологии.

Известен способ определения вида гликозаминогликанов путем хроматографии (Pеnnock С.A. "A review and selection of simple laboratory methods used for the study of glucosaminoglycan excretion and the diagnosis of the mucopolysaccharidoses". J. Clin. Path., 1976, 29, 111-123).

Данный способ недостаточно специфичный за счет того, что заряд гликозаминогликанов определяется степенью его полимерности и количеством сульфатированных групп; многоэтапный, трудоемкий, для его осуществления необходимы дорогостоящее оборудование и реактивы.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения гиперэкскреции и видов гликозаминогликанов методом электрофореза (Philip P. Dеmburе and R. August Roesel "Screening for Mucopolysaccharidoses by Analysis of Urinary Glucosaminoglycans." Techniques in Diagnostic Human Biochemical Genetics: A Laboratory Manual, p.p.77-86, 1991, Wiley - Liss, Inc.), который осуществляется следующим образом: выделяются гликозаминогликаны из мочи методом Pennock С. А. (1976) в модификации. Изолированные гликозаминогликаны и стандарты растворяются в дистиллированной воде в концентрации 0,5 мг/мл.

Электрофорез проводится на приборе горизонтального электрофореза фирмы Bio-Rad. Гликозаминогликаны и стандарты в количестве 5-10 мкг наносятся на ацетатцеллюлезную мембрану Optiphor-10. Проводится 1 этап электрофореза в течение 10 мин при напряжении 25В/CM. Затем мембрана помещается в 15% раствор этанола в 0,1 М барийацетатном буфере на 2 мин. Проводится II этап электрофореза в течение 20 мин. Мембраны окрашиваются в 0,25% растворе Алцианового голубого, а затем окраска фиксируется 5% раствором уксусной кислоты.

Способ недостаточно специфичный за счет того, что не учитывает микрогетерогенность гликозаминогликанов, трудоемкий (многоэтапный), требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Задача изобретения предложить выкокоспецифичный, простой способ для диагностики мукополисахаридозов.

Поставленная задача решается за счет того, что проводят разрушение отдельных видов гликозаминогликанов, воздействуя специфическими ферментами хондроитиназами АС и АВС, затем проводят одноэтапный одномерный электрофорез.

При использовании способа имеет место положительный медицинский эффект, который заключается в диагностике заболевания в высокой степени специфичности. Высокая специфичность достигается за счет того, что применяемые ферменты специфичны для отдельных видов гликозаминогликанов независимо от молекулярной массы, тканевой специфичности, заряда гликозаминогликанов и, разрушая, удаляют отдельные виды гликозаминогликанов на этапе подготовки к электрофорезу.

Использование имеет социальную значимость. Специфическая диагностика дает возможность проведения пренатальной диагностики для предотвращения рождения ребенка с такой патологией в семье. При использовании способа имеет место экономический эффект: для верификации диагноза сужается диапазон дорогостоящих исследований.

Способ прост, высокоспецифичен, надежен, проводится на отечественном оборудовании.

Способ осуществляется следующим образом.

Гликозаминогликаны, выделенные из 5 мл случайной порции мочи методом Pеnnock С.А. (1976), растворяются в 50 мкл дистиллированной воды. К 10 мкл растворенных в воде гликозаминогликанов мочи добавляется хондроитиназа АС (ЕС. 4.2.2.5) или хондроитиназа АВС (ЕС.4.2.2.4) (Sigma, США), растворенная в 0,2 М трис-НСl буфере, содержащем 0,2 М натрийацетат, рН 8,0, в объеме 5 мкл, таким образом, чтобы конечная активность фермента в инкубационной смеси составляла не менее 0,025 ЕД/мкл. Инкубируется 3 ч при 37⁰С. Останавливают реакцию охлажденным спиртом 96^o, 200 мкл. Через 30 мин цетрифугируется 10 мин, 3 тыс оборотов, надосадочная жидкость сливается, осадок высушивается на воздухе, растворяется в 10 мкл дистиллированной воды.

Электрофорез проводится на приборе для изотахофореза на пленке ИТФ-П2 27. Ацетатцеллюлезная мембрана "Владипор МФА-МА 5" производства "Тасма", предварительно замоченная в 0,1 М барийацетатном буфере, рН 4,8, высушивается промокательной бумагой. Пробы и стандарт (смесь гепарансульфата и хондроитинсульфата А, Sigma, США, в концентрации 1 мг/мл, водный раствор) наносятся на ацетатцеллюлезную мембрану в количестве 1 мкл полоской длиной около 5 мм. На "шероховатой" поверхности мембраны от края отступают 2 см (направление движения электрофореза вдоль волокон мембраны) и проводят линию простым карандашом без нажима (это линия старта). Затем делают разметку для нанесения проб. От края и между пробами отступают по 7-10 мм. Электрофорез проводится в 0,1 М барийацетатном буфере, рН 4,8, при напряжении 70 В в течение 90 мин, от катода к аноду. Мембрана окрашивается в 0,1% растворе Алцианового голубого в 2,5% растворе уксусной кислоты в течение 10 мин, затем окраска фиксируется 2,5% раствором уксусной кислоты.

Примеры практического использования
Пример 1
Пациенту Л. , 9 лет 9 мес с клиникой мукополисахаридоза проведено обследование. Выявлена гиперэкскреция гликозаминогликанов (36,0 мг/мМ креатинина (норма 3,2-5,6)). При проведении электрофореза выявлена гиперэкскреция ГАГ за счет хондроитинсульфатов А и С, дерматансульфат (линия 1), но нельзя исключить присутствие гепарансульфата. После обработки ГАГ хондроитиназой АС были удалены хондроитинсульфаты А и С (линия 2), после обработки ГАГ хондроитиназой АВС были удалены хондроитинсульфаты А и С, а также дерматансульфат (хондроитинсульфат В) (линия 3). Линия 4: стандарт (ГС - гепарансульфат; ХС - хондроитинсульфатов А и С; ДС - дерматансульфат). Заключение: Гиперсекреция ГАГ обусловлена преимущественно за счет дерматансульфата, хондроитинсульфатов А и С, что характерно для мукополисахаридоза. В дальнейшем у пациента необходимо исследование активности ферментов для дифферренциальной диагностики типа мукополисахаридоза I, VI и VII.

Пример 2
Пациенту К. , 3 года 10 мес, с клиникой мукополисахаридоза проведено обследование. Выявлена гиперэкскреция гликозаминогликанов (20,7 мг/мМ креатинина (норма 4,4-8,0)). При проведении электрофореза выявлена гиперэкскреция ГАГ за счет хондроитинсульфатов А и С (линия 1), но нельзя исключить присутствие кератансульфата. После обработки ГАГ хондроитиназой АС были удалены хондроитинсульфаты А и С (линия 2), после обработки ГАГ хондроитиназой АВС были удалены хондроитинсульфаты А и С, а также дерматансульфат (хондроитинсульфат В) (линия 3). Линия 4: стандарт (ГС - гепарансульфат; ХС - хондроитинсульфатов А и С; ДС - дерматансульфат). Заключение: Гиперсекреция ГАГ обусловлена за счет хондроитинсульфатов А и С. В дальнейшем у пациента определено отсутствие активности арилсульфатазы А и В, выставлен диагноз мукосульфатидоза. Это заболевание не относится к мукополисахаридозам.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для диагностики заболеваний, связанных с нарушением обмена соединительной ткани врожденной и приобретенной этиологии. Сущность способа в том, что проводят разрушение отдельных видов гликозаминогликанов, воздействуя специфическими ферментами хондроитиназами АС и АВС, затем проводят одноэтапный одномерный электрофорез. Изобретение обеспечивает высокоспецифичность и простоту способа. 2 ил.

Способ диагностики мукополисахаридозов путем определения гиперэкскреции и видов гликозаминогликанов (ГАГ), отличающийся тем, что проводят разрушение отдельных видов ГАГ, воздействуя специфическими ферментами хондроитиназами АС и АВС, затем проводят одноэтапный одномерный электрофорез, и при выявлении гиперэкскреции ГАГ, обусловленной дерматансульфатом и хондроитинсульфатом А и С, диагностируют мукополисахаридоз.