СПОСОБ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА НА КРЫСАХ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано в гистологии, эмбриологии, микробиологии, фармакологии, физиологии, лабораторной диагностике.

Известен способ моделирования воспалительных заболеваний женских половых органов [6]. Однако этот способ предполагает использование микроорганизмов в виде St. aureus и введение микроорганизмов с помощью туберкулинового шприца под слизистую заднебоковой стенки средней трети влагалища. Недостатком этого способа моделирования является метод введения микроорганизмов, не имеющий аналогии с реальными путями проникновения микроорганизмов в женские половые органы.

Задача изобретения - разработать способ моделирования инфекционно-воспалительного процесса у крыс.

Выполнение поставленной задачи осуществляют путем введения на 2-4 или 11-13 дни беременности через уретру в мочевой пузырь белых крыс серовара кишечной палочки Е. coli О₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл по 0,1 мл на 100 грамм массы животного и при высевании кишечной палочки в конце беременности из почки судят о наличии воспалительно-инфекционного процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве подопытных животных используют белых крыс половозрелого возраста, потому что они являются одними из наиболее распространенных лабораторных животных, которые позволяют достичь желаемой аналогии в эксперименте при воспроизведении инфекционно-воспалительного процесса.

Для его моделирования в качестве инфекционного агента используют кишечную палочку - Escherichia coli (E. coli) на том основании, что, во-первых, она не относится к возбудителям, вызывающим развитие инфекционно-воспалительного процесса в крайней степени его проявления - в виде инфекционной болезни, во-вторых, она является наиболее частой этиологической причиной формирования осложненной инфекции мочевыводящих путей вообще [1]. Среди большой разновидности эшерихий выбор был остановлен на сероваре кишечной палочки О₆, потому что этот серовар E. coli наблюдается при обструктивных и необструктивных формах урогенитальной инфекции, имея при этом высокий процент высеваемости [2]. Следовательно, использование кишечной палочки серотипа О₆ с точки зрения вероятности воспроизведения инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях представляется оправданным.

С этой целью штамм E. coli О₆, производимый Государственным НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича, культивируют на питательных средах в условиях термостата [4]. Стерильным физиологическим раствором готовят смыв колоний E. coli О₆ суточного возраста. Для заражения животных используют взвесь E. coli О₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл, приготовленную методом последовательных серийных десятикратных разведении. Для введения инфекционного агента крысу под легким эфирным наркозом иммобилизируют на спине. Соблюдая правила асептики и антисептики, катетер через уретру вводят в мочевой пузырь, затем через катетер с помощью шприца в мочевой пузырь вводят взвесь микроорганизмов. На каждые 100 гр массы животного вводят 0,1 мл взвеси микроорганизмов в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл. Сразу после введения через катетер взвеси микроорганизмов или стерильного физиологического раствора в полость мочевого пузыря катетер извлекают, а животное освобождают от иммобилизации.

Все подопытные животные по объему воздействия были разделены на 4 группы (табл. 1.).

I группа животных - это контрольная группа животных. Животным этой группы иммобилизацию и катетеризацию не проводят. II, III и IV группы животных - это опытные группы. Каждому животному из этих групп один раз в сутки и три дня подряд производят катетеризацию мочевого пузыря. Животным второй группы в мочевой пузырь вводят стерильный физиологический раствор в расчете 0,1 мл физиологического раствора/100 грамм массы животного. Животным третьей и четвертой групп вводят взвесь Е. coli О₆ в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл стерильного физиологического раствора в расчете 0,1 мл взвеси/100 грамм массы крысы. Катетеризацию мочевого пузыря с введением в его полость взвеси микроорганизмов осуществляют: для животных III группы - на 2-4-й дни беременности, для животных IV группы - на 11-13-й дни беременности. Такая структура эксперимента позволяет: на примере второй группы выявить негативное влияние иммобилизации и катетеризации на процессы гестации; на примере третьей и четвертой групп животных установить возникновение наличие инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях в различные сроки беременности. Создание инфекционно-воспалительного процесса во время беременности выбрано на том основании, что гормональный фон беременности является благоприятным фоном для реализации инфекционно-воспалительного процесса, а мочевыводящие пути доступны для инфицирования. Для оценки наличия инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей к исходу беременности, длящейся у крыс в среднем 21-22 дня, животных всех четырех групп накануне родов - на 20-й день беременности - подвергают эвтаназии. При этом проводят ряд объективных наблюдений, гематологических и микробиологических исследований, позволяющих выявить наличие инфекционно-воспалительного процесса и произвести сопоставление с данными морфометрических исследований.

В табл. 2 приведены объективные данные хода беременности на 20-й день беременности.

Из табличных данных следует, что 100%-я выживаемость самок к 20-у дню беременности и примерно равная сохранность беременности свидетельствует об отсутствии очевидных признаков сепсиса. В группах III и IV отмечается тенденция к снижению количества вынашиваемых плодов в абсолютных и относительных величинах по сравнению с группами I и II, что отражает наличие нарушенного хода беременности на фоне введения микроорганизмов в мочевыводящие пути беременной самке.

В табл. 3 приведены данные гематологических исследований.

Гематологические данные групп I и II практически совпадают. Это означает, что проведение иммобилизации и катетеризации не приводит к появлению признаков воспалительной реакции со стороны системы крови.

Характер изменения гематологических величин в группах III и IV по сравнению с контролем имеет особенности. Для этих экспериментальных групп характерна тенденция: снижения количества эритроцитов, уровня гемоглобина и увеличения числа лейкоцитов. Изменение лейкоцитарной формулы в этих группах характеризуется тенденцией к нейтрофилии, моноцитозу, лимфопении. Выявляемые изменения лейкоцитарной формулы отражают наличие воспалительной реакции в организме крыс этих групп. Увеличение индекса интоксикации в группах III и IV также подтверждает проявление инфекционно-воспалительной реакции в организме беременных крыс-самок. Таким образом, введение инфекционного агента беременным крысам отражается в гематологических параметрах в виде воспалительной реакции с интоксикационным синдромом.

Для выявления инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях производят посев материнской почки методом отпечатка. Процедуру забора биоматериала для микробиологического исследования осуществляют с соблюдением всех правил асептики в течение ближайших минут с момента эвтаназии животного. Культивирование, идентификацию выделенных культур осуществляют согласно Приказа 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 года [4]. С целью выявления любого возможного инфекционного агента посевы проводят на неселективные среды - отдельно для выделения аэробов, отдельно для анаэробов. Роста колоний на анаэробных средах не наблюдали ни в одном случае. На аэробных средах наблюдали рост колоний только одного вида микроорганизмов, которые были подвергнуты дальнейший идентификации на питательных средах [4]. В табл. 4 приведены данные идентификации и частоты высеваемости микроорганизмов. Табличные данные свидетельствуют, что вводимая в мочевыводящие пути во время беременности кишечная палочка высевалась в конце беременности из почки. С учетом способа инфицирования это свидетельствует о наличии инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях. Совпадение серовара кишечной палочки, вводимой в мочевой пузырь, и серовара кишечной палочки, высеваемой из почки, доказывает материальную и причинно-следственную взаимосвязь этих процессов. Таким образом, введение Е. coli О₆ в мочевыводящие пути в различные сроки беременности приводит к возникновению инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей.

Для проведения морфометрического исследования проводят забор почки, мочеточника и стенки мочевого пузыря. Материал фиксируют в 10%-м нейтральном формалине, проводят по спиртам и заливают в парафин. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивают гематоксилинэозином и по Ван-Гизону [3].

Готовые микропрепараты подвергают световой микроскопии при 600-кратном увеличении с целью выявления микроочагов воспаления. При определении такового в поле зрения в нем подсчитывают количество лимфоцитов, гистиоцитов и нейтрофилов на том основании, что скопления этих клеток, во-первых, отражают наличие воспалительной реакции в ткани, во-вторых, указывают на точную локализацию инфекционного агента [5]. Выбор 600-кратного увеличения обоснован тем, что использование такого увеличения позволяет достаточно быстро просматривать микропрепарат, выявлять очаги воспаления, дифференцировать клеточные элементы в очаге воспаления и иметь достаточное количество полей зрения одновременно.

В табл. 5 приведены данные морфометрических исследований почек по признакам, позволяющим судить о наличии инфекционно-воспалительного процесса.

В микропрепаратах почек, полученных от животных групп III и IV, по сравнению с контрольной группой наблюдают достоверное увеличение количества лимфоцитов и гистиоцитов в выявленных микроочагах воспаления.

В табл. 6 приведены данные морфометрических исследований стенки мочеточника по признакам, позволяющим судить о наличии инфекционно-воспалительного процесса. В микропрепаратах, полученных от животных групп III и IV, по сравнению с контрольной группой, наблюдают достоверное увеличение количества лимфоцитов в выявленных микроочагах воспаления.

В табл. 7 приведены данные морфометрических исследований стенки мочевого пузыря по признакам, позволяющим судить о наличии инфекционно-воспалительного процесса.

В микропрепаратах стенки мочевого пузыря, полученных от животных групп III и IV, также наблюдают достоверное увеличение количества лимфоцитов в выявленных микроочагах воспаления.

Таким образом, из данных морфометрических исследований следует, что количество лимфоцитов в микроочаге воспаления у животных III и IV групп статистически достоверно (р<0,05) по сравнению с группой I (контрольной группой) отражает наличие инфекционно-воспалительного процесса, выявляемого по данным объективного наблюдения и данным гематологических и микробиологических исследований.

При этом установлено, что количественная мера одного из возможных морфометрических критериев описания инфекционно-воспалительного процесса - лимфоцитов - является статистически достоверной в отражении существования такового. Следовательно, подсчет числа лимфоцитов в микроочаге воспаления может использоваться для количественного учета воспалительной реакции и применяться для проведения количественного сравнительного анализа при проведении морфометрических исследований.

Из достоинств предлагаемого способа количественной оценки инфекционно-воспалительного процесса при морфометрическом исследовании органов крыс можно выделить следующие моменты: 1) возможность проведения количественной оценки воспаления параллельно с общепринятым качественным описанием микропрепарата, 2) отсутствие изменения технологии приготовления и микроскопирования микропрепарата, 3) простота учета лимфоцитов, позволяющая говорить о наличии экспресс-свойств у предлагаемого способа.

Таким образом, упоминаемые достоинства предлагаемого способа позволяют считать его простым и удобным методом количественного учета воспалительной реакции организма, переводящим качественное описание микропрепаратов в рамки количественного учета, что открывает собой возможность проведения сравнительного анализа в рамках одного эксперимента или сопоставления данных различных экспериментов.

Источники информации
1. Идентификация возбудителей инфекций мочевыводящих путей у детей /В.И. Кириллов, Л.Т. Теблоева, Е.Б. Алексеев и соавт. //Педиатрия. -1997.- 6. -С. 8-13.

2. Лопаткин Н. А., Деревянко И.И. Неосложненные и осложненные инфекции мочеполовых путей. Принципы антибактериальной терапии //Русский медицинский журнал. - 1997, Т.5. - 24. - С. 1579-1588.

3. Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Медгиз, 1954. - 718 с.

4. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях, лечебно-профилактических учреждениях /Приказ 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 г. - М., 1985. - 127 с.

5. Чернух А. Н. Воспаление. - М.: Медицина, 1979. - 448 с.

6. Старкова Е.В., Дергачева Т.И., Асташов В.В. Способ моделирования воспалительных заболеваний женских половых органов /Патент РФ 2142163 С1, 27.11.1999. Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано в гистологии, эмбриологии, микробиологии, фармакологии, физиологии, лабораторной диагностике. Изобретение характеризуется тем, что вводят на 2-4 или 11-13 дни беременности через уретру в мочевой пузырь белых крыс серовара кишечной палочки Е. coli O₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл по 0,1 мл на 100 г массы животного и при высевании кишечной палочки в конце беременности из почки судят о наличии воспалительно-инфекционного процесса. Изобретение обеспечивает быстроту и достоверность при осуществлении способа. 7 табл.

Способ воспроизведения инфекционно-воспалительного процесса на крысах осуществляют путем введения на 2-4 или 11-13 дни беременности через уретру в мочевой пузырь белых крыс серовара кишечной палочки Е. coli O₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл по 0,1 мл на 100 г массы животного и при высевании кишечной палочки в конце беременности из почки судят о наличии воспалительно-инфекционного процесса.