СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К ДИФТЕРИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим и биохимическим методам исследования биологических жидкостей человека для оценки напряженности антибактериального иммунитета к дифтерии.

Наиболее близким является способ определения антибактериальных антител при дифтерийной инфекции (Кондрашина Н. Н., Шмелева Е.А., Берестень С.Ф. ЖМЭИ, 1987, N 9, c.115-117). По этому способу при оценке антибактериального иммунитета к коринебактериям дифтерии в сыворотке крови исследуют количество антител к белку клеточной стенки с Мм 64 кДа. Определение антител класса IgG проводят в сыворотке крови с использованием иммуноферментного анализа (ИФА).

Недостатком этого способа является то, что исследование уровня антибактериальных антител проводится в сыворотке крови, тогда как местом локализации возбудителя является слизистая носоглотки.

По этому способу определяют антитела класса IgG, в то время как специфическими, протективными антителами слизистых являются секреторные IgA (SIgA).

В прототипе в качестве антигена используется белок клеточной стенки коринебактерий, функциональное значение которого неизвестно, следовательно, протективная значимость антител к нему необоснованна.

Таким образом, этот способ является недостаточно информативным, специфичным и точным при оценке напряженности антибактериального противодифтерийного иммунитета.

Целью предлагаемого способа является повышение эффективности и специфичности оценки напряженности антибактериального иммунитета к дифтерии.

Нами предлагается исследование протективно значимых специфических секреторных антител изотипа IgA к коринебактериям дифтерии в слюне к корд-фактору (трегалозо-6,6'-димиколат) - фактору патогенности, играющему ведущую роль в адгезии и колонизации микроорганизмов на слизистых.

Для достижения этой цели проводят иммуноферментный анализ (ИФА) слюны лиц, подлежащих обследованию. Используют иммунологические планшеты, сорбированные в качестве антигена корд-фактором коринебактерий дифтерии. Определяют секреторные IgA к корд-фактору в слюне и по их наличию оценивают устойчивость организма к колонизации слизистых коринебактериями дифтерии.

Способ осуществляется следующим образом.

Суспензию высокочищенного корд-фактора (трегалозо-6,6'-димиколат) с концентрацией 1,0±0,5 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере рН 7,2±0,l (ФСБ) вносят в лунки иммунологического планшета по 0,1 мл и оставляют для сорбции в течение 18 ч при t=4±2^oC. Затем 4-кратно отмывают ФСБ, содержащим 0,05% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-БСА).

В лунки иммунологического планшета, сорбированного корд-фактором коринебактерий дифтерии вносят по 0,1 мл разведенной слюны. В одну лунку планшета добавляют 0,1 мл ФСБ-БСА (контроль фона). Во вторую лунку планшета вносят 0,1 мл пулированной слюны новорожденных (отрицательный контроль). В третью лунку планшета вносят 0,1 мл слюны с высоким уровнем антител к корд-фактору (возможно использование слюны реконвалесцентов).

Планшет закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 часа при t=37±1^oС, после чего 3-кратно промывают ФСБ-БСА. Остатки влаги удаляют постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. Затем в каждую лунку планшета вносят по 0,1 мл разведенного в рабочей концентрации ФСБ-БСА коньюгата к секреторному IgA. Планшет закрывают крышкой и инкубируют при t= 37±1^oC в течение 1 часа. После инкубации все лунки 3-кратно промывают ФСБ-БСА и вносят субстратно-индикаторный раствор, выдерживают в течение 30 мин при t=l8-26^oС в темном месте, добавляют по 0,05 мл стоп-реагента (2 н. серная кислота) и немедленно производят учет результатов исследования с помощью фотометрического устройства.

На основании полученных значений оптической плотности (ОП) определяют наличие противодифтерийных антибактериальных антител в условных единицах. Для этого ОП исследуемой слюны делят на ОП отрицательной контрольной слюны и сравнивают с аналогичными показателями, полученными для положительной контрольной слюны.

Пример конкретного осуществления способа.

У пациентов "А" и "В" натощак после тщательного полоскания полости рта кипяченой водой отбирают пробу смешанной нестимулированной слюны в количестве 3 мл в чистую сухую пробирку и замораживают. После размораживания образцы слюны центрифугируют (g=250) в течение 15 мин. Супернатант отделяют и используют для исследования.

В лунки иммунологического планшета, сорбированного корд-фактором коринебактерий дифтерии, вносят по 0,1 мл разведенной слюны пациентов "А" и "В".

В первую лунку планшета вносят 0,1 мл ФСБ-БСА (контроль фона), в другую - 0,1 мл пулированной слюны новорожденных (отрицательный контроль), в третью лунку планшета - 0,1 мл слюны реконвалеспентов (положительный контроль).

После 1-часовой инкубации при t=37±1^oС планшет 3-кратно промывают ФСБ-БСА, после чего в каждую лунку вносят по 0,1 мл разведенного в рабочей концентрации ФСБ-БСА коньюгата к секреторному IgA. Закрытый крышкой планшет инкубируют при t= 37±1^oC в течение 1 ч. После инкубации все лунки 3-кратно промывают ФСБ-БСА и вносят по 0,1 мл субстратного раствора, после 30-минутной инкубации при t=18-26^oC в темном месте добавляют по 0,05 мл стоп-реагента (2 н. серная кислота) и немедленно производят учет результатов исследования с помощью фотометрического устройства.

Были получены следующие значения оптической плотности (ОП):
- контроль фона (ФСБ-БСА) - 0,06;
- отрицательный контроль (слюна новорожденных) - 0,11;
- положительный контроль (слюна реконвалеспента) - 1,89;
- слюна пациента "А" - 0,39;
- слюна пациента "В" - 1,98.

Индекс антител к корд-фактору для положительной контрольной слюны (отношение величины ОП положительной контрольной слюны к ОП отрицательной контрольной слюны) составляет 1,89/0,11=17,2.

Затем определяют индекс уровня антител к корд-фактору в слюне пациента "А" (отношение величины ОП слюны пациента "А" к ОП отрицательной контрольной слюны (слюна новорожденного)) : 0,39/0,11=3,5.

Аналогичным образом определяют индекс антител в слюне пациента "В", у которого индекс антител к корд-фактору составил 1,98/0,11=18,0.

Таким образом, в слюне пациента "В" содержание антибактериальных противодифтерийных антител оказалась высоким, сопоставимым с их концентрацией в положительной контрольной слюне.

В слюне пациента "А" содержание антибактериальных противодифтерийных антител оказалось низким.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществлять более объективную оценку антибактериального иммунитета к дифтерии, так как основан на определении протективно значимых специфических антител в слюне к бактериальному антигену, фактору патогенности, ответственному за процессы адгезии и колонизации микроорганизмов на слизистых.

С эпидемиологической точки зрения важно, что исследование проводится с использованием неинвазивных методов.

Исследование уровня секреторных антител изотипа IgA, имеющих протективное значение, к патогенетически значимому антигену коринебактерий дифтерии корд-фактору обеспечивает высокую точность, надежность и специфичность диагностики напряженности антибактериального противодифтерийного иммунитета.

Использование с этой целью метода иммуноферментного анализа обеспечивает высокую методическую чувствительность, точность, воспроизводимость и быстродействие диагностики. Возможность широкого практического применения обеспечивается использованием широко распространенного в учреждениях практического здравоохранения типового оборудования для иммуноферментного анализа.

Высокое быстродействие при достаточной точности наряду с комплексной автоматизацией дает возможность эффективно использовать предлагаемый способ при массовых эпидемиологических и клинических обследованиях населения для исследования колонизационной резистентности, формировании носительства, эффективности вакцинопрофилактики, при конструировании и оценке различных вакцинных препаратов и так далее, а также для проведения научных исследований.

Метод разработан и апробирован в лаборатории иммунохимии и отделении микробиологии и биохимии бактерий Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной.

Разработаны и оформлены методические рекомендации "Комплекс методов оценки антибактериального и антитоксического популяционного иммунитета к коринебактериям дифтерии" (Немов В.В., Дегтева Г.К., Ивашкина С.Г., Никитина З.И. , Беляева Е.В., Ермолина Г.Б.).

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим и биохимическим методам оценки напряженности антибактериального иммунитета к возбудителю дифтерии. Сущностью способа является определение иммуноферментным анализом в слюне пациента уровня специфических секреторных IgА к корд-фактору коринебактерий дифтерии, по величине которого проводят оценку антибактериального иммунитета. Техническим результатом является повышение эффективности и специфичности оценки напряженности антибактериального иммунитета к дифтерии.

Способ оценки антибактериального иммунитета к дифтерии путем исследования биологической жидкости с помощью иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве объекта исследования используют слюну пациента, определяют в ней наличие специфических секреторных Ig А к корд-фактору в условных единицах и по величине указанного показателя оценивают антибактериальный иммунитет к дифтерии.