СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ИММУНОДИАГНОСТИКУМА И СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА Российский патент 1999 года по МПК A61K35/18 G01N33/53 

Известен способ приготовления антитоксического эритроцитарного диагностикума путем сенсибилизации анатоксином таннизированных эритроцитов в солевой среде с последующей формалинизацией (см. А.С. СССР, N 552086, 1977 г.).

Известен способ приготовления эритроцитов путем отмывания формалинизированных эритроцитов двукратно боратно-фосфатным буферным раствором хлористого натрия и однократно фосфатным буферным раствором хлористого натрия (см. А.С. СССР, N 649435).

Наиболее близким является способ приготовления эритроцитарного белкового диагностикума путем фиксации и танизации эритроцитов, сенсибилизации с последующим отмыванием и консервацией (см. А.С. СССР N 648228, 1979 г.).

Известен способ ускоренной оценки иммунного статуса человека путем тест-системы "возраст-НА-лейкоциты" (см. Метод. рекомендации, Вильнюс, 1986, с. 13).

Наиболее близким является способ определения иммунореактивности животных путем постановки реакции пассивной гемагглютинации с использованием шигеллезного и коринебактериального эритроцитарного диагностикума, с учетом результатов реакции по титру антител (см. А.С. СССР N 1534401, 1990 г.).

Техническим результатом способа приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума является повышение чувствительности препарата за счет усиления связывания белковых компонентов.

Новым в осуществлении способа приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума является то, что сенсибилизацию эритроцитов осуществляют в растворе, содержащем взвесь эритроцитов, дифтерийный микробный антиген (64 КД) и раствор гидрохинона (N-диоксибензола), что усиливает связывание белковых компонентов и повышает чувствительность препарата.

Новым является и то, что использование раствора гидрохинона (N-диоксибензола) при сенсибилизации эритроцитов дифтерийным микробным антигеном повышает чувствительность и активность препарата. Повышение чувствительности было определено авторами способа опытным путем.

Новым является также то, что соотношение взвеси эритроцитов, дифтерийного микробного антигена и раствора гидрохинона (N-диоксибензола) выбрано соответственно 2: 1:1 опытным путем, что повышает чувствительность препарата и является оптимальным.

Техническим результатом предлагаемого способа определения иммунореактивности организма является ускорение определения иммунореактивности организма.

Новым в достижении поставленного технического результата является то, что в качестве диагностического препарата используют эритроцитарный иммунодиагностикум, что ускоряет определение иммунореактивности, повышает точность определения нарушения иммунной системы, сокращает трудо- и времязатраты на проведение исследования.

Сопоставительный анализ показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что сенсибилизацию осуществляют в растворе, содержащем взвесь эритроцитов, дифтерийный микробный антиген и раствор гидрохинона (N-диоксибензола) в соотношении 2:1:1, а при определении иммунорезистентности организма в качестве диагностического препарата используют приготовленный эритроцитарный иммунодиагностикум, что соответствует критерию изобретения "новизна".

Новые существенные признаки сообщают заявленному техническому решению новые свойства, проявляющиеся в повышении чувствительности эритроцитарного иммунодиагностикума и ускорение определения иммунореактивности организма, что соответствует критерию "промышленная применимость".

При анализе известных решений было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии существенных признаков заявленного способа на достижение технического результата, поэтому решение соответствует "изобретательскому уровню".

Способ приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума осуществляют следующим образом.

Взятие крови у барана проводят из яремной вены по 300 мл в антикоагулянт (5%-ный раствор цитрата натрия). Эритроциты сразу отмывают охлажденным физиологическим раствором 3 раза при 15000 - 20000 G. Формалинизацию эритроцитов барана проводят по методу Weinbach. Из отмытых эритроцитов готовят 8%-ную взвесь клеток на физиологическом растворе. К родному объему 8%-ной взвеси эритроцитов добавляют такой же объем фиксирующего раствора (3%-ный раствор формальдегида на физиологическом растворе с pH 7,0 - 7,2, профильтрованный через бумажный фильтр), смесь помещают в термостат при +37^oC на 20 часов, периодически перемешивая. После этого эритроциты отмывают физиологическим раствором 3 раза при 15000 - 20000 G и хранят в консерванте (0,03%-ный формальдегид) в виде 20%-ной взвеси клеток.

Перед сенсибилизацией эритроциты отмывают 1 раз при 15000 - 20000 G охлажденным физиологическим раствором и определяют отсутствие агглютинации клеток. В лунки пластины микротитратора "Такачи" вносят по 0,1 мл 0,2%-ной взвеси отмытых эритроцитов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. В случае отсутствия спонтанной агглютинации клетки оседают через 1-1,5 час в виде точки с резко очерченными краями. Такие эритроциты используют для приготовления иммунодиагностикума.

Условия сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана с помощью гидрохинона (N-диоксибензол) были следующие:
- 2 объема 20%-ной взвеси эритроцитов, отмытых от формалина;
- 1 объем дифтерийного микробного антигена (белок 64КД) - 250 мкг/мл;
- 1 объем 0,43%-ного водного свежеприготовленного раствора гидрохинона (N-диоксибензола). Смесь встряхивают и выдерживают 25-30 минут на водяной бане при t + 55-56^oC, периодически перемешивая. Отмывание эритроцитов проводят физиологическим раствором pH 7,0 с нормальной кроличьей сывороткой (НКС) 3 раза при 15000 - 20000 G в течение 5 минут. Готовят 0,8%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов на физиологическом растворе. В течение первых 6 часов к взвеси с НКС, для исключения обсеменения микроорганизмами добавляют 0,5%-ный раствор азида натрия.

Готовый иммунодиагностикум в жидком виде сохраняет свою активность в течение 2,5 - 3-х лет при температуре +4-6^oC.

Контроль на чувствительность реакции проводят с иммунной кроличьей сывороткой, содержащей дифтерийные микробные антитела. Сыворотку разводят так же, как и испытуемые сыворотки, и добавляют сенсибилизированные эритроциты (в рабочем разведении).

Контроль сенсибилизированных эритроцитов проводят с пулом нормальных кроличьих сывороток и добавлением сенсибилизированных эритроцитов (в рабочем разведении).

Учет результатов реакции проводят через 1,5 - 2 часа. Эритроциты оседают в виде точки на дно лунок в отрицательном варианте и в виде "зонтика" - в положительном варианте.

Активность подготовленного иммунодиагностикума характеризовали показатели титра дифтерийных антител, который давал хорошо видимую агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов барабана.

Приготовленный иммунодиагностикум сравнивают с иммунодиагностикумом, приготовленным на таннизированных эритроцитах барабана. Сравнительная характеристика активности иммунодиагностикумов с применением гидрохинона (N-диоксибензол) и таннина установлена в параллельных опытах, результаты приведены в таблице 1.

Во всех проведенных авторами опытах чувствительность иммунодиагностикума с использованием гидрохинона была выше.

Анализ полученных результатов показал, что с помощью гидрохинона возможна эффективная сенсибилизация эритроцитов барабана дифтерийным микробным антигеном, что повышает чувствительность диагностикума.

Разработанный иммунодиагностикум для РПГА с дифтерийным микробным антигеном использовали для выявления дифтерийных противомикробных антител у здоровых лиц: детское население - 158 сывороток, взрослые доноры - 400 сывороток. Также определяли напряженность специфического иммунитета у вакцинированных коров и телят - 140 сывороток. Напряженность специфического иммунитета у телят и коров наблюдали в динамике. В группе телят 5-6-месячного возраста после полного цикла вакцинации 75% голов были защищены высокими титрами противодифтерийных бактериальных антител; в группе коров этот процент был ниже - 45%.

Способ определения иммунорезистентности организма осуществляют с использованием приготовленного эритроцитарного диагностикума.

Коринебактерии дифтерии (КД) являются неотъемлемой частью симбионтной микрофлоры человека. Для человека главное значение имеют следующие виды:
1. C.diphtheriae - вызывают острое токсинемическое заболевание;
2. C. pseudodiphtheriae - токсины не продуцируют. Оба вида локализуются на слизистой оболочке носоглотки человека;
3. C. xerosis - непатогенный вид, нормальный обитатель кожи и слизистых оболочек глаз, носоглотки человека. Токсин не продуцируют.

Берут кровь из вены, отделяют от нее сыворотку и ставят реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с приготовленным эритроцитарным иммунодиагностикумом на основе дифтерийного микробного антигена, выделенного из нетоксигенного штамма коринебактерий дифтерии (НКД).

Для постановки РПГА используют набор микротитратора "Такачи". Реакцию проводят в пластинах с U-образным профилем дна лунок. При постановке РПГА используют 0,8%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов барана. Сыворотки титруют, для этого в лунки панелей вносят по 25 мкл раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС) (1:100). В первую и во вторую лунку вносят по 25 мкл испытуемой сыворотки. Затем из второй лунки 25 мкл разведенной сыворотки переносят в третью, а из третьей в четвертую и т.д.

В лунки с серийными разведениями сывороток калиброванной пипеткой из набора "Такачи" вносят по 25 мкл сенсибилизированных эритроцитов (в рабочем разведении - 0,8%). Панели энергично, не допуская расплескивания, встряхивают и накрывают крышкой. В целях экономии диагностикума и времени постановки реакции, исследуемые сыворотки можно титровать на 3 лунки, в случае положительного ответа - сыворотки необходимо довести до титра.

Результаты реакции учитывают по 4-х плюсовой системе в зависимости от формы осадка в лунке. За титр сыворотки обычно принимают последнее разведение сыворотки, в котором имеется положительная реакция на 2 плюса.

В каждый опыт вводят три контроля:
1. Контроль диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации: в 3 лунки вносят по 25 мкл 1%-ной НКС и по 25 мкл 0,8%-ной взвеси диагностикума. Эритроциты во всех лунках должны осесть в виде диска.

2. Контроль активности диагностикума проводят гомологичной иммунной сывороткой, либо гипериммунной сывороткой кролика, так же как при титровании анализируемой сыворотки.

3. Контроль специфичности результатов реакции. В 1-ю и 2-ю лунки вносят по 25 мкл каждой из анализируемых сывороток, а в остальные (с 3-й по 8-ю) по 25 мкл 1%-ного раствора НКС. Затем делают двукратные разведения, начиная со второй лунки. После этого приливают во все лунки по 25 мкл раствора дифтерийного микробного антигена (250 мкг), панели встряхивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре, после этого во все лунки добавляют по 25 мкл 0,8%-ной взвеси диагностикума.

Панели встряхивают им оставляют при комнатной температуре. Эритроциты должны осесть в виде диска. Контроль специфичности проводят при анализе одиночных сывороток.

Авторами заявляемого способа установлено, что в городах с повышенным радиационным фоном (от 100 до 1500 мкр/ч дозами ионизирующего излучения) выявлена существенная разница в средних уровнях антител к коринебактериям дифтерии в сравнении с благополучными в этом отношении городами.

Популяционный уровень нормальных антител к КД в городах с высоким радиационным фоном составил в среднем = 0,9 в log₂ единицах, аналогичные показатели у здоровых детей, посещающих детские учреждения - 2,4 - 2,5 в log₂. Исследования проводились в детских организованных коллективах (сады, интернаты) и на взрослом населении (нештатные доноры) в возрасте от 20 до 40 лет.

Авторами установлена зависимость между повышением радиационного фона с одновременным понижением титра нормальных антител у населения. Результаты исследования сведены в таблицы 1-4, чертеж.

Из чертежа (см. приложение) видно, что в условиях нормального уровня радиации титры антител к КД составляют в среднем 2,4 log₂. Тогда как в условиях высокой радиации титры антител к КД в среднем снижены в 8 раз и составляют 0,3 log₂. Эти обследуемые отнесены в группу с пониженной иммунореактивностью организма. У них же были отклонения в системе клеточного и гуморального иммунитета. Как видно из таблицы 2 (см. приложение), только у 46,5% детей отсутствовали изменения лейкоцитарной формулы. Равнозначными были группы с выраженной эозинофилией (27,3%) и наличием незрелых форм лейкоцитов (26,2%).

Анализируя данные внутри этих групп, следует отметить, что у детей из детского сада II группы отсутствовали изменения лейкоцитарной формулы только в 39%, а группа с выраженной эозинофилией составила 36%.

Также отмечалась разница в возрастных группах детей: у дошкольников в формуле крови преобладают изменения, выраженные наличием незрелых форм (33%), в то время как среди школьников эти изменения составили только 18,7%. Выраженная эозинофилия отмечена у школьников в 31%, против 9,5% у дошкольников.

Из таблицы 3 видно, что увеличение числа эозинофилов сопровождалось увеличением палочкоядерных нейтрофилов во всех группах и уменьшением числа зрелых сегментоядерных нейтрофилов.

Значимые изменения в формуле крови у детей представлены в таблице 4.

Изменения лейкоцитарной формулы проявлялись наличием незрелых форм гранулоцитов (эозинофилов и нейтрофилов) у детей дошкольного возраста и незрелых форм лимфоцитов во всех группах. Одновременно характерным было уменьшение у большинства детей сегментоядерных нейтрофилов и увеличение палочкоядерных элементов, а также лимфоцитов.

Большинство иммунологических показателей у детей в районе с повышенным радиационным фоном отличалось от показателей, принятых за норму. Зарегистрированы низкий уровень общих T-лимфоцитов во всех районах города, сниженная фагоцитарная активность нейтрофилов, низкий уровень иммуноглобулинов. Отмечена значительная разбалансировка соотношения Тф - резистентных и Тф - чувствительных Т - лимфоцитов, резко повышенный уровень B - лимфоцитов (до 35%).

На этом фоне у детей отмечалось очень низкое среднее содержание иммуноглобулинов: IgM - 0,5; IgG - 5,3; IgA - 0,7 мг/мл. По результатам первичного иммунообследования детей в районе наиболее радиоактивного загрязнения тип коллективного иммунного статуса оценивается как супрессивный. Наиболее выраженный тип коллективной иммуносупрессии характерен для детей 5-6-летнего возраста.

Таким образом отмечается четкая взаимосвязь с низким содержанием антител к КД в крови и изменениями гематологических показателей.

Известно, что распределение показателей антибактериальных антител к КД в сыворотке крови здоровых лиц близки к нормальному биноминальному, что соответствует проявлению любых биологических признаков в популяции. Такое распределение показателей гуморального иммунитета на антигены КД соответствует эволюционно закрепленным изменениям в генетическом наследственном составе человеческой популяции.

Таким образом наличие высокого процента лиц с низким содержанием антимикробных антител к КД, равно как и другое асимметричное распределение показателей антимикробного иммунитета дифтерии, могут служить критериями иммунонедостаточности организма.

Предлагаемый способ позволяет ускорить оценку иммунорезистентности организма с высокой точностью определения.

Сущность изобретения состоит в том, что при оценке иммунорезистентности организма используют эритроцитарный иммунодиагностикум. При его приготовлении сенсибилизацию эритроцитов осуществляют в растворе, содержащем взвесь эритроцитов, дифтерийный микробный антиген и раствор гидрохинона (N-диоксибензола) в соотношении 2:1:1. Технический результат: изобретение обеспечивает повышение чувствительности препарата и ускорение определения иммунореактивности организма. 2 с.п.ф-лы, 4 табл., 1 ил.

1. Способ приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума путем сенсибилизации анатоксином таннизированных эритроцитов с последующей формалинизацией, отличающийся тем, что сенсибилизацию осуществляют в растворе, содержащем взвесь эритроцитов, дифтерийный микробный антиген и раствор гидрохинона (N-диоксибензола) в соотношении 2:1:1. 2. Способ определения имммунорезистентности организма путем приготовления сыворотки, постановки реакции пассивной гемагглютинации с использованием диагностикума в качестве антигена и учета результатов реакции по титру антител, отличающийся тем, что в качестве диагностического препарата используют эритроцитарный иммунодиагностикум по п.1 и при значении титра антител ниже 1,0 log₂ определяют снижение иммунорезистентности организма.