Способ выявления антител к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3 Echovirus 30 Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицинской вирусологии, в частности к области клинической лабораторной диагностики вирусных инфекций, касается способа выявления специфических антител к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3 энтеровируса Echovirus 30 методом иммуноферментного анализа, и может быть использовано при оценке эффективности прототипов вакцин и создании тест-систем для сероэпидемиологического исследования энтеровирусной инфекции у человека.

Энтеровирусы (семейство Picornaviridae, род Enterovirus) - это безоболочечные РНК-содержащие вирусы, представленные 106 патогенными для человека типами, объединенными в 4 вида - Enterovirus А (ЭВА), Enterovirus В (ЭВВ), Enterovirus С (ЭВС), Enterovirus D (3BD) [Brouwer L., Moreni G., Wolthers K.C., Pajkrt D. World-wide prevalence and genotype distribution of enteroviruses// Viruses - 2021. Vol.13, №3 - P. 434.; Simmonds P., Gorbalenya A.E., Harvala H., Hovi Т., Knowles N.J., Lindberg A.M., Oberste M.S., Palmen-berg A.C., Reuter G., Skem Т., Tapparel C, Wolthers K.C., Woo P.C.Y., Zell R. Re-commendations for the nomenclature of enteroviruses and rhinoviruses// Arch. Virol-2020, Vol.165, №3 - P. 793-797]. Наибольшей распространенностью обладают энтеровирусы видов ЭВА и ЭВВ [Новикова Н.А., Голицына Л.Н., Фомина С.Г., Ефимов Е.И. Молекулярный мониторинг неполиомиелитных энтеровирусов на территории России в 2008 - 2011 гг.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2013. - №1 - С 75-78]. Энтеровирусная инфекция (ЭВИ) характеризуется полиморфизмом клинических проявлений и может протекать как в форме бессимптомного носительства, так и острого лихорадочного состояния с тяжелыми осложнениями, включая полиомиелит, полиомиелитоподобное заболевание, менингит, менингоэнцефалит, миокардит, гепатит и др. [Канаева О.И. Энтеровирусная инфекция: многообразие возбудителей и клинических форм // Инфекция и иммунитет.- 2014 - Т. 4 - №1- С. 27-36.; Новиков Д.В., Мелентьев Д.А. Энтеровирусные (Picornaviridae: Enterovirus) (неполно) вакцины // Вопросы вирусологии-2022. - Т. 67.- №3. - С. 185-192.; Liu S.L., Pan Н., Liu P., Amer S., Chan T.C., Zhan J., Huo X., Liu Y., Teng Z., Wang L., Zhuang H. Comparative epidemiology and virology of fatal and nonfatal cases of hand, foot and mouth disease in mainland China from 2008 to 2014// Rev. Med. Virol. - 2015, Vol. 25, №2. - P. 115-128.; Pons-Salort M., Parker E.P.K., Grassly N.C. The epidemiology of non-polio enteroviruses: Recent advances and outstanding questions// Curr. Opin. Infect. Dis - 2015, Vol. 28, №5. - P. 479-487]. В настоящее время ЭВИ рассматриваются в качестве фактора, провоцирующего развитие сахарного диабета 1 типа у детей [Magloire P.N., Enagnon К.A., Didier Н. Persistent coxsackievirus В infection and pathogenesis of type 1 diabetes mellitus // Nature Reviews Endocrinology. - 2022. - Vol. 18, №8. - P. 503-516].

Молекулярный мониторинг циркуляции неполиомиелитных энтеровирусов (НПЭВ) на территории Российской Федерации позволил идентифицировать более 52 типов с различной частотой обнаружения энтеровирусов в зависимости от сезона и региона [Лукашев А.Н., Голицына Л.Н., Вакуленко Ю.А., Ахмадишина Л.В., Романенкова Н.И., Сапега Е.Ю., Морозова Н.С., Новикова Н.А., Троценко О.Е., Иванова О.Е. Современные возможности и направления развития молекулярно-эпидемиологического мониторинга в надзоре за энтеровирусными инфекциями. Опыт Российской Федерации // Инфекция и иммунитет - 2018 - Т. 8 - №4. - С. 452-464]. Из всех заболевших ЭВИ, поступивших в инфекционные стационары, доля детей, в среднем по России, составила 97%, наиболее тяжелые формы инфекции регистрировались у детей в возрасте до 17 лет [Михайлова Ю.М., Черепанова Е.А. Энтеровирусная (неполно) инфекция в Российской Федерации в 2022 г. // Заболеваемость, этиологическая структура и вопросы профилактики энтеровирусной (неполно) инфекции: электронный ресурс.2023. №10. С. 3-5].

Echovirus 30 (Е30, ЕСНО30) - представитель вида Enterovirus В на протяжении многих лет является причиной вспышек серозного менингита во всем мире, в том числе и в России [Лукашев А.Н., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Лашкевич В.А., Черненко К.Е. Молекулярная эпидемиология вируса ECHO 30 на территории России и стран СНГ // Вопросы вирусологии. -2004. - №5. - С.12-16.; Lukashev A.N., Ivanova О.Е., Eremeeva T.P., Gmyl L.V. Analysis of echovirus 30 isolates from Russia and new independent states revealing frequent recombination and reemergence of ancient lineages // J. Clin. Microbiol. - 2008, Vol. 46, №2 - P. 665-670]. По данным Роспотребнадзора, в 2017 году основной клинической формой (84%) при энтеровирусной инфекции, вызванной Echovirus 30, является энтеровирусный менингит.В возрастной структуре заболевших дети от 3 до 6 лет составляют 51,5%, от 7-14 лет - 42,1% [http://riaami.ru/2017/08/rospotrebnadzor-rasprostranil-svedeniya-o-viruse-esno30/]. Для Echovirus 30 менингитов, в отличие от менингитов, вызванных другими неполимиелитными вирусами, характерны более тяжелое течение, яркая неврологическая симптоматика и выраженные воспалительные изменения в ликворе [Штейнберг А.В. Клиниколабораторная диагностика и этиотропная терапия энтеровирусного менингита у детей: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Саратов, 2009. - 24 с.]. Длительная циркуляция близкородственных штаммов вируса Echovirus 30 на одной территории может быть связана с низкой скоростью их трансмиссии, из-за чего замедляется процесс формирования иммунной прослойки населения.

Структурные и неструктурные белки энтеровирусов различных типов содержат консервативные аминокислотные последовательности, формирующие общие В-клеточные эпитопы [Aw-Yong K.L., NikNadia N.M.N., Tan C.W., Sam I., Chan Y.F. Immune responses against enterovirus A71 infection: Implications for vaccine success // Rev. Med. Virol - 2019, Vol. 29, №5, e2073]. Консервативные области используются в качестве общего эпитопа для определения антител к широкому спектру энтеровирусов [Cello J., Samuelson А., Stalhandske P., Svennerholm В., Jeansson S., Forsgren M. Identification of group-common linear epitopes in structural and nonstructural proteins of enteroviruses by using synthetic peptides // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol. 31- P. 911-916]. При ЭВИ IgM - антитела против энтеровирусов образуются в первые дни инфекции и сохраняются в течение 2-3 месяцев. Это позволяет, как диагностировать ЭВИ, так и оценивать их распространенность по частоте обнаружения IgM - антител в исследуемый период. IgG - антитела против НПЭВ сохраняются в течение трех и более лет и отражают состояние длительного иммунитета. Наличие IgA- антител к энтеровирусам указывает на недавнее или продолжительное инфицирование слизистой оболочки кишечника [Nekoua М.Р., Alidjinou Е.К., Hober D. Persistent coxsackievirus В infection and pathogenesis of type 1 diabetes mellitus // Nature Reviews Endocrinolog - 2022, Vol. 18, №8 - P. 503-516].

Вирионы энтеровирусов имеют диаметр около 30 нм. Центральная часть занята свернутой молекулой РНК, окруженной капсидом из 60 полипептидных субъединиц [Ray C.G. Enteroviruses. In: Sherris Medical Microbioil-ogy. 4^th edition. Ed.Ryan K.J, Ray C.G. The McGraw-Hill-Companies, 2004, P. 531-541.]. Его общая молекулярная масса составляет 8,5 мегадальтон. Белки капсида представлены четырьмя полипептидами: VP1, VP2, VP3, VP4 (пронумерованы согласно убыванию молекулярной массы). Белки VP 1-3 находятся на поверхности капсида, VP4 формирует внутреннюю часть. Структурные белки определяют круг хозяев и играют очень важную роль в доставке генома РНК в цитоплазму новых клеток-хозяев. Антитела, нейтрализующие энтеровирусы, распознают эпитопы, расположенные на структурных белках VP1, VP2 и VP3 [Демина А.В., Маркович Н.А., Нетесов СВ. Энтеровирусы. Часть 1: история открытия, таксономия, строение генома, эпидемиология // Сибирский научный медицинский журнал. -2008. - №1.- С. 92-100]. Основной пул нейтрализующих антител вырабатывается к поверхностному белку VP1.

Анализ аминокислотных последовательностей поверхностных белков VP1, VP2 и VP3 энтеровирусов показал, что в их аминокислотных последовательностях присутствуют В-клеточные эпитопы, общие для энтеровирусов. Эпитоп Е2, присутствующий в VP1, является общим для многих энтеровирусов видов А, В или С, включая poliovirus 1 и poliovirus 3. Эпитоп Е9, присутствующий у VP2, обнаружен в основном у энтеровирусов вида В, а эпитоп Е14, имеющийся у VP3, характерен для энтеровирусов видов А, В и С, включая poliovirus 2. Наличие антител против белков, содержащих эпитопы, общие для многих энтеровирусов, отражает инфицирование организма разными энтеровирусами. [Soo-Youn Shin, Ki-Soon Kim, Yoon-Sung Lee, Yoon-Seok Chung, Kwi-Sung Park, Doo-Sung Cheon, Byoung-Kuk Na, Yoonsung Kang, Hyang-Min Cheong, Youngjoon Moon, Jee-Hye Choi, Hang-Eui Cho, Na-Young Min, Jin-Sook Son, Young-Hoon Park, Youngmee Jee, Jae-Deuk Yoon, Chul-Yong Song, and Kwang-Ho Lee. Identification of enteroviruses by using monoclonal antibodies against a putative common epitope// J Clin Microbiol. - 2003 Jul. - Vol. 41. №7.- Р.3028-3034].Так, в качестве антигенного компонента при создании диагностических тест-систем в отношении энтеровирусных инфекций использовали рекомбинантный полипептид СЕ/Е6. Для экспрессии рекомбинантного полипептида в клетках E.coli использовали вектор рЕТ-24b(+), позволяющий экспрессировать клонированный полипептид, несущий полигистидиновый «хвост» (His6Tag), а также содержащий многочисленные сайты клонирования и ген устойчивости к канамицину. Вектор рЕТ-24b(+)/СЕ/Е6 содержал участок, кодирующий 89 аминокислот N-терминальной части капсидного белка VP1[Дедюля К.Л., Поклонская Н.В., Амвросьева Т.В., Безручко А.А., Богуш З.Ф., Казинец О.Н. Использование рекомбинантного энтеровирусспецифического полипептида в качестве антигена при разработке диагностической тест-системы //Военная медицина. - 2010. - №3. - С. 87-91].

В Российской Федерации подавляющее большинство исследований по мониторингу НПЭВ проводят среди госпитализированных в инфекционные больницы и анализу сточных вод вирусологическим методом в культуре клеток или ОТ-ПЦР [Лукашев А.Н., Голицына Л.Н., Вакуленко Ю.А., Ахмадишина Л.В., Романенкова Н.И., Сапега Е.Ю., Морозова Н.С., Новикова Н.А., Троценко О.Е., Иванова О.Е. Современные возможности и направления развития молекулярно-эпидемиологического мониторинга в надзоре за энтеровирусными инфекциями. Опыт Российской Федерации // Инфекция и иммунитет.- 2018.-Т. 8. - №4.- С. 452-464].

Задача заявляемого изобретения - разработка способа выявления антител к рекомбинантным поверхностным белкам Echovirus 30.

Техническим результатом изобретения является простой и надежный способ выявления специфических антител к рекомбинантным поверхностным белкам Echovirus 30 для оценки динамики группового иммунитета к энтеровирусам, для оценки способности создаваемых вакцин формировать иммунитет и устойчивости поствакцинального иммунитета.

Технический результат достигается способом выявления антител к рекомбинантным белкам Echovirus 30 VP1 (содержит эпитоп Е2, общий для многих энтеровирусов видов А, В и С, включая poliovirus 1 и poliovirus 3), VP2 (содержит эпитоп Е9, общий для многих энтеровирусов вида В) и VP3 (содержит эпитоп Е14, характерный для энтеровирусов видов А, В и С, включая poliovirus 2) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA).

Выбранный вариант твердофазного ИФА в микропланшетном варианте получил наибольшее распространение в тест-системах для клинических лабораторных исследований, что делает тест на его основе доступным и не требует ни специфического оборудования, ни обучения сотрудников существующих лабораторий. В качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистирольного микропланшета, которые сенсибилизируют рекомбинантными белками Echovirus 30 с последующим внесением в них биологического образца (сыворотка крови). В качестве антигенов используют рекомбинантные поверхностные белки VP1, VP2 и VP3 Echovirus 30. В ходе специфической реакции антигенах определяемыми в исследуемом образце антителами образуются иммунные комплексы. Субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов удаляются при многократной промывке. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве антигенов используют:

рекомбинантный белок Echovirus 30 VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1

рекомбинантный белок Echovirus 30 VP2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2

рекомбинантный белок Echovirus 30 VP3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3

Очищенные рекомбинантные поверхностные белки разводят физиологическим раствором (0,9% NaCl) до концентрации 0,25 мкг/мл и вносят в объеме 100 мкл в лунки 96-луночного планшета с последующей инкубацией в течение 24 часов при температуре +4°С. Затем планшет отмывают 5 раз раствором ФСБ-Т (0,01 М натрий-фосфатный буферный раствор, содержащий 0,9% NaCl и ОД % Твин-20) и в лунки вносят по 100 мкл плазмы крови, разведенной 1:10 с помощью ФСБ-Т. Планшет инкубируют в термостатируе-мом шейкере при температуре 37°С в течение 60 минут. После инкубации планшет промывают 5 раз ФСБ-Т и вносят раствор вторичных антител, меченных пероксидазой хрена в разведении 1:5000. Для выявления IgG-антител используют моноклональные антитела клона 3D3cc, для выявления IgM-антител - моноклональные антитела клона 2 В9 сс, для выявления IgA-антител - поликлональные антитела GAHIaa. Инкубируют при температуре 37°С в течение 60 минут в шейкере и отмывают пятикратно несвязавшийся конъюгат ФСБ-Т. Во все лунки вносят по 100 мкл 0,04% раствора ТМБ (Appli-Chem, ЕС) и 0,02% перекиси водорода в натрий-цитратном буферном растворе рН5,0 и инкубируют в течение 5-10 минут. Реакцию останавливают добавлением в лунки 50 мкл 1N серной кислоты и измеряют величину оптической плотности на спектрофотометре Infinite М200 Pro (Tecan, Austria) в двухвол-новом режиме: при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм.

Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1, 2, 3, 4 и 5:

- на фиг. 1 показана электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков VP1, VP2 и VP3 ЕЗО в 10% ПААГ;

- на фиг. 2 показана оптическая плотность иммуноферментной реакции при разной концентрации сорбируемого белка и разном разведении анти-IgG конъюгата;

- на фиг. 3 показана оптическая плотность реакции при инкубации плазмы крови с рекомбинантным белком VP 1 в разных концентрациях;

- на фиг. 4 показана частота обнаружения антител разных классов к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3;

- на фиг. 5 показана частота обнаружения антител к рекомбинантным белкам ЕЗО в крови детей разного возраста.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Получение рекомбинантных поверхностных белков VP1, VP2 и VP3

После оптимизации кодонов ДНК VP1, VP2 и VP3 синтезироали в ООО "Люмипроб РУС" (Россия) ДНК размером 888 п. о., 798 п. о. и 744 п. о. соответствующей VP1, VP2 и VP3 области энтеровирусного генома, клонировали в составе вектора pET22b (Novagen, США), рекомбинантные белки экспрессировали в клетках E.coli штамм Rosetta 2 (DE3). Отчистку белков проводили в денатурирующих условиях в присутствии 6М гуанидина с использованием сефарозы Ni-NTA Superflow (GE Healthcare). Рекомбинантный VP1 ренатурировали диализом против градиента концентраций мочевины, для ренатурации VP2 и VP3 использовали диализ против градиента концентраций сахарозы. Полученные белки анализировали с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле с окрашиванием Coomassie briliant blue R250. Электрофоретический анализ белков продемонстрировал, что их молекулярная масса соответствовала расчетной: VP 1 - 33,5 кДа, VP2 - 29,6 кДа, VP3 - 27,5 кДа.

Пример 2. Обоснование параметров способа

Для подбора условий сорбции белок VP1 в концентрации 1 мкг/мл сорбировали в физрастворе и в физрастворе с добавлением 4М мочевины. Конъюгат разводили в растворе ФСБ-Т в соотношении 1:5000. В качестве контроля использовали разведенную в 10 раз сыворотку КРС.При тестировании 96 образцов плазмы крови больных хроническим гастритом положительная реакция регистрировалась в 83% случаев при сорбции белка в растворе с 4М мочевиной и в 74% случаев при сорбции белка в физрастворе без добавления мочевины. Достоверных различий между группами не наблюдалось. При этом отрицательный контроль (сыворотка крупного рогатого скота) давал более высокие фоновые значения при постановке реакции в присутствии 4М мочевины. В дальнейшем белок VP1 сорбировали в физрастворе. Концентрация белка, сорбируемого в лунки, варьировала в диапазоне от 0,0625 мкг/мл до 1 мкг/мл. Установлено, что с увеличением концентрации сорбируемого белка нарастала оптическая плотность реакции. Оптимальная концентрация белка для сорбции составила 0,25 мкг/мл. В этих условиях регистрировали максимальную разницу между образцами плазмы крови с максимальным и минимальным значением оптической плотности. Интенсивность реакции тестировали при разных разведениях анти-TgG конъюгата (1:5000 и 1:2500). При разведении конъюгата 1:2500 наряду с увеличением оптической плотности реакции возрастали и фоновые значения. Так, при проведении реакции с использованием анти-IgG конъюгата в разведении 1:2500 и концентрацией сорбируемого белка, равной 0,25 мкг/мл, соотношение величин оптической плотности реакции для образцов с максимальным и минимальным значением равнялось 5,7 единицам, а при использовании аяти-IgG конъюгата в разведении 1:5000 оно составило 9,0 единицы, что подтвердило целесообразность использования конъюгата в разведении 1:5000.

Пример 3. Предотвращение неспецифических реакций Образцы плазмы крови инкубировали при постановке реакции в ФСБ-Т с добавлением лизата клеток Е. coli Rosetta 2 (DE3) в соотношении 100:1. Добавление лизата клеток Е. coli во всех случаях приводило к снижению величины оптической плотности, что свидетельствовало о падении уровня неспецифических реакций в присутствие лизата. Последующее тестирование 95 образцов плазмы крови с использованием лизата клеток Е. coli показало, что положительную реакцию регистрировали только в 41 образце против 71 образцов крови при проведении реакции без использования лизата. Различие между двумя тестированными группами составило 31% и было статистически достоверным (р<0,05).

Пример 4. Подтверждение специфичности

Специфичность подтверждали путем нейтрализации антител к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3 в плазме крови. Перед проведением иммуноферментной реакции тестируемые образцы плазмы крови инкубировали в течение 1 часа при 37°С в присутствии рекомбинантного белка в концентрациях от 0,001 мкг/мл до 10 мкг/мл. Установили, что с повышением концентрации добавляемого в плазму белка VP1 VP2 или VP3 интенсивность реакции падала и достигала минимальных значений при концентрации, равной 10 мкг/мл, что свидетельствовало о нейтрализации присутствующих в плазме специфических антител к данным белкам.

Пример 5. Исследование частоты обнаружения IgA-, IgM- и IgG-антител к рекомбинантным поверхностным белкам VP1, VP2 и VP3 Echovirus 30.

Использовали образцы сыворотки крови 331 человека в возрасте от 2 месяцев до 61 года, полученные в первой половине 2022 года из диагностического центра «Гемохелп» («Централизованная лаборатория «АВК-Мед») от проживающих на территории Нижегородской области лиц, обратившихся для проведения диагностических исследований и давших письменное согласие на использование их биоматериала в исследовании. Тестируемые образцы сыворотки крови были разделены на группы согласно рекомендациям ВОЗ в соответствии с возрастом. В первую группу вошли образцы сыворотки крови детей в возрасте от 2 месяцев до 18 лет (n=128), во вторую группу - образцы сыворотки крови от лиц возрастом от 19 до 44 лет (n=102) и в третью группу - образцы, полученные от лиц возрастом от 45 до 60 лет (n=101). Образцы, полученные от детей, дополнительно были разделены на три подгруппы в соответствии с возрастом: дошкольники от 0,2 до 6 лет (n=34), дети от 7 до 11 лет (n=19, начальная школа), дети от 12 до 18 лет (n=75, старшеклассники). IgM-антитела против VP1, VP2 и VP3 обнаружили в образцах сыворотки крови тестированных лиц в 9,3% случаев. Частота встречаемости антител против каждого из трех рекомбинантных белков различалась. IgM-антитела против только VP1 не обнаруживали ни в одном из 331 тестированных образцов. IgM- антитела против VP2 и VP3 выявляли в 3,3 и 1,2% случаев. Одновременное присутствие IgM-антител против VP1 и VP2 регистрировали в 1,8% случаев, против VP1 и VP3 в 0,3%) случаев). IgM-антитела к VP2 и VP3 в одном и том же образце сыворотки крови не выявляли ни в одном случае, но 2,7%) образцов содержали IgM-антитела против всех трех тестированных белков, что составило 29,0% от всех IgM положительных проб. TgG-антитела обнаружили в 29,6% случаев. При этом в 20,3% образцах присутствовали антитела к одному из тестированных белков, в 5,4%) образцов - антитела к двум рекомбинантным белкам и в 4,2%) случаев выявляли IgG-антитела против всех трех белков. В общем массиве TgG-положительных образцов крови такие образцы составили 14,0%. IgA- антитела суммарно выявляли в 16,5% тестированных образцов. Чаще всего обнаруживали антитела к отдельным рекомбинантным белкам (13,2%). IgA-антитела одновременно к двум рекомбинантным белкам выявили в 3,0%) образцов. Образцы, содержавшие IgA- антител сразу к трем белкам, составили лишь 0,3%) от общего числа тестированных образцов сыворотки крови, что составило всего 1,8% от всех IgA-положительных проб. Суммарно антитела против рекомбинантных белков Echovirus 30 обнаружили в 43,2% случаев (143 из 331 образца сыворотки крови). Из них антитела против одного рекомбинантного белка выявляли в 24,2%) случаев (80 из 331 образца), антитела против двух из трех белков Echovirus 30 - в 11,5% случаев (38 из 331 образца), а антитела разных классов против всех трех рекомбинантных белков - в 7,5% случаев (25 из 331 образца). Частота обнаружения антител представлена в таблице.

Как видно из таблицы, IgM-антитела, взаимодействующие с рекомбинантными белками, чаще всего обнаруживались в образцах сыворотки крови лиц в возрасте 19-40 лет, что обусловлено повышенной встречаемостью IgA-антител против рекомбинантного VP2 (13,7%). Встречаемость IgA-антител статистически значимо не изменялась в разных возрастных группах. Частота обнаружения IgG-антител демонстрировала выраженную возрастную зависимость. IgG-антитела выявляли, преимущественно, в образцах сыворотки крови детей. Каждый второй образец сыворотки крови лиц до 18 лет содержал IgG-антитела к рекомбинантным белкам. В более старших возрастных группах этот показатель кратно понижался. Динамика изменения частоты встречаемости IgG-антител носила сходный характер для всех трех рекомбинантных белков.

Исследования образцов крови детей показали, что с повышением возраста частота обнаружения IgM- антител против белков Е30 повышалась от нуля до 12,0%. Частота выявления IgG- антител нарастала с возрастом и достигала 57,3%. Наибольшую частоту выявления IgA-антител регистрировали в образцах сыворотки крови от детей 7-11 лет (36,8%). Отмечали статистически значимое превышение частоты в 4,2 раза обнаружения антител в крови детей до 6 лет (р=0,013).

Способ апробирован на достаточном клиническом материале. Результаты проведенных исследований позволяют рассматривать возможность и целесообразность использования разработанного способа в качестве простого, доступного для клинической практики способа для оценки эффективности прототипа вакцины и создания тест-систем для сероэпидемиологического исследования энтеровирусной инфекции у человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу выявления антител к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3 Echovirus 30. Указанный способ включает проведение иммуноферментного анализа на IgA-, IgM- и IgG-антитела в присутствии рекомбинантных антигенов, представляющих собой поверхностные белки VP1, VP2 и VP3 Echovirus 30, причем о наличии антител к каждому из белков VP1, VP2 или VP3 судят по нарастанию оптической плотности реакции относительно контроля - сыворотки крупного рогатого скота в разведении 1:10. Настоящее изобретение обеспечивает выявление специфических антител к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3 энтеровируса Echovirus 30 методом иммуноферментного анализа. 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Способ выявления антител к рекомбинантным белкам VP1, VP2 и VP3 Eсhovirus 30, характеризующийся проведением иммуноферментного анализа на IgG-, IgM- и IgG-антитела в присутствии рекомбинантных антигенов, представляющих собой поверхностные белки VP1, VP2 и VP3 Echovirus 30, которые разводят физиологическим раствором до концентрации 0,25-1,0 мкг/мл и вносят в объёме 100 мкл в лунки 96-луночного планшета с последующей инкубацией в течение 24 часов при температуре +4°С, пятикратной отмывкой раствором ФСБ-Т, внесением по 100 мкл плазмы крови в разведении 1:10 ФСБ-Т, инкубацией в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 60 минут, пятикратной промывкой ФСБ-Т и внесением в раствор вторичных антител, меченных пероксидазой хрена, в разведении 1:5000, инкубацией при температуре 37°С в течение 60 минут в шейкере и пятикратной отмывкой несвязавшегося конъюгата ФСБ-Т, внесением по 100 мкл 0,04% раствора ТМБ и 0,02% перекиси водорода в натрий-цитратном буферном растворе pH 5,0, инкубацией в течение 5-10 минут, остановкой реакции, добавлением в лунки 50 мкл 1N серной кислоты и проведением учёта результатов спектрофотометрически с регистрацией оптической плотности реакции в двухволновом режиме: при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм, а о наличии антител к каждому из белков VP1, VP2 или VP3 судят по нарастанию оптической плотности реакции относительно контроля - сыворотки крупного рогатого скота в разведении 1:10, причём образцы плазмы крови инкубируют при постановке реакции в ФСБ-Т с добавлением лизата клеток Е. coli Rosetta 2 (DE3) в соотношении 100:1.

2. Способ по п. 1, в котором в качестве антигена используют рекомбинантный белок VP1 Echovirus 30, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

.

3. Способ по п. 1, в котором в качестве антигена используют рекомбинантный белок VP2 Echovirus 30, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2:

.

4. Способ по п. 1, в котором в качестве антигена используют рекомбинантный белок VP3 Echovirus 30, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3:

.

5. Способ по пп. 1-4, в котором для выявления gG-антител используют моноклональные антитела клона 3D3cc, для выявления IgM-антител - моноклональные антитела клона 2В9 сс, для выявления IgA-антител - поликлональные антитела клона GAHIaa.