СПОСОБ ГЕНОТИПИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ ПРОСА (PANICUM MILIACEUM L.) Российский патент 2003 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию in vitro пыльников злаковых культур, преимущественно проса, и может быть использовано в генетике, селекции, физиологии применительно к представителям однодольных и двудольных видов культурных растений.

Метод культуры пыльников направлен на получение генотипически чистых линий культурных растений, происходящих из пыльцевых зерен. Вследствие того, что пыльник состоит из двух способных к делению типов клеток: соматических и пыльцевых зерен, оценка происхождения регенерантных растений имеет решающее значение. Для оценки происхождения регенерантных растений используют классический метод, основанный на подсчете числа хромосом [1] . Гаплоидный (одинарный) набор хромосом свидетельствует о происхождении регенерантов из пыльцевых зерен, диплоидный - из соматических клеток пыльника.

Этот метод не всегда дает адекватную оценку, потому что он не учитывает процессов, происходящих в период от первичных делений клеток пыльника до регенерации растений. Каллусные ткани, полученные в культуре пыльников, могут содержать клетки одного уровня плоидности, но происходящие из пыльцевых зерен или меристематически активных соматических клеток пыльника.

Клетки каллусной ткани с различными уровнями плоидности могут образовываться в результате слияния клеток пыльцевого зерна [2] или нетипичных митозов (эндомитозов), происходящих в процессе культивирования каллусной ткани [3, 4].

Цель изобретения состоит в определении с использованием генетических маркеров происхождения регенерантных растений из пыльцевых зерен или соматических клеток пыльника.

Предложенный способ оценки происхождения регенерантов, основанный на генотипических различиях пыльцевых зерен и соматических клеток пыльников гибридов с маркерными генами в гетерозиготном состоянии, позволяет дифференцировать регенеранты не только по соматическим половым клеткам-предшественникам, но и типам пыльцевых зерен. Способ применим как к регенерантам с гаплоидным набором хромосом (оценка R₀), так и с более высокими уровнями плоидности - оценка R₀, R₁ (таблица).

Оценка регенерантных растений R₀ позволяет сделать вывод о происхождении растений из пыльцевых зерен, если фенотип регенерантов отличается от фенотипа растения-донора пыльников. Учитывая одинаковое фенотипическое проявление доминантных маркерных генов в гетерозиготном и гомозиготном состоянии в R₀, требуется анализ по маркерным признакам семей R₁.

Оценка семей регенерантов R₁ позволяет по наличию или отсутствию расщепления делать выводы об их происхождении. Расщепляющиеся семьи указывают на происхождение из соматических клеток пыльника. Нерасщепляющиеся семьи с различными наборами маркерных признаков свидетельствуют о происхождении регенерантных растений из пыльцевых зерен. Использование нескольких (более 2-х) маркерных генов позволяет определять происхождение регенерантных растений из различных типов пыльцевых зерен. При этом, чем больше маркерных генов используется в эксперименте, тем более полно выявляется генотипическое разнообразие регенерантов.

Число возможных типов гамет и, следовательно, генотипов регенерантных растений вычисляется по формуле n=2^х, где х - число маркерных генов [5].

В качестве растений-доноров пыльников можно использовать не только гибриды F₁, но и последующие гибридные поколения. При этом во всех опытах по оценке происхождения вместе с семьями регенерантов R₁ рекомендуется выращивать семенное потомство растений-доноров для определения гетерозиготности маркерных генов. Во всех опытах необходимо иметь описание фенотипа растения-донора пыльников по маркерным признакам. Это важно, когда используется донор с несколькими маркерными генами (признаками). В случае, когда нерасщепляющиеся семьи имеют набор признаков, отличный по фенотипу от растения-донора, то отмечается их происхождение из пыльцевых зерен. Задача оценки происхождения при отсутствии семенного потомства растения-донора значительно облегчается, если среди регенерантов R₁ есть расщепляющиеся семьи. По характеру их расщепления легко можно восстановить генотип растения-донора.

Таким образом, способ генотипической оценки регенерантов позволил выделить и направить в селекционный процесс генотипически однородные линии проса.

Пример. Изучали регенеранты 5 каллусных клонов: gml, am26, am129, 2084/34, 2085/26, полученные в культуре пыльников гибридов F₃ от скрещивания форм проса с маркерными признаками. Каждый клон происходил из единственного пыльника. Растения-доноры пыльников клонов gml, am26 были гетерозиготными по 4 маркерным генам (окраска зерна, антоциан, сорго-образная и могарообразная формы метелки), am129 и 2085/26 - по 2 генам (окраска зерна и соргообразная форма метелки), 2084/34 - по 1 маркерному гену (окраска зерна).

Гетерозиготность определялась в результате анализа семей, ведущих происхождение из соматических клеток пыльника. Изучены 37 семей R₁ клона gml, 18 - am26, 13 - am129, 20 - 2084/34 и 4 - 2085/26.

Каллусные клоны были получены на культуральных средах, которые содержали макро- и микросоли по Мурашиге и Скугу (1962) - среда MS, витамины по Гамборгу и Эвелегу (1968) - среда В5, 2 мг/л глицина, 40 г/л сахарозы, 6 г/л агара, 500 мг/л мио-инозитола, 200-500 мг/л L-глутамина, 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота). Стимулирование регенерационного процесса происходило на среде с солями MS, витаминами В5, дополненной 2 мг/л глицина, 40 г/л сахарозы, 6 г/л агара, 10 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) и 0,5 мг/л α-НУК (α-нафтилуксусная кислота).

Получение регенерантных растений в культуре пыльников проса не являлось результатом прямого эмбриогенеза, а включало ряд этапов. Период стимулирования регенерационного процесса эмбриогенных каллусных тканей составлял 50 суток. Продолжительность периода инициации регенерационного процесса, в среднем, составляла 25 суток. В целом, время от посадки экспланта до регенерации корнесобственных растений составляло 75 суток. Регенерантные растения получали в течение 1-2 лет в процессе культивирования регенерирующей каллусной ткани на среде без регуляторов роста.

На регенерантных растениях R₀ были получены всхожие семена. Регенеранты R₁ выращивали в полевых условиях, где проводилась их оценка по наличию маркерных признаков и расщеплению.

Все семьи регенерантов R₁ клонов gml и 2085/26 расщеплялись по 4 маркерным признакам, что указывало на их происхождение из соматических клеток пыльников. Среди регенерантов R₁ клонов аm26, am129 и 2084/34 встречались как нерасщепляющиеся, так и расщепляющиеся семьи, что указывало на их происхождение как из пыльцевых зерен, так и из соматических клеток пыльников. В нерасщепляющихся семьях клонов аm26 и am129 наблюдались различные наборы маркерных признаков, что указывало на участие в процессе пролиферации различных типов пыльцевых зерен. Растения нерасщепляющихся семей клона аm26 были представлены 3 наборами признаков:
а) белая окраска зерна, наличие антоциана, развесистая метелка (38,9%);
б) белая окраска зерна, отсутствие антоциана, развесистая метелка (2,8%);
в) красная окраска зерна, наличие антоциана, димутантная метелка (2,8%).

Растения нерасщепляющихся семей клона am129 имели 2 набора признаков:
а) белая окраска зерна, развесистая метелка (15,4%);
б) красная окраска зерна, развесистая метелка (23,1%).

Растения нерасщепляющихся семей клона 2084/34 были представлены 1 фенотипом с белой окраской зерна (15%).

В эксперименте с культурой пыльников проса растение-донор пыльников у клона 2084/34 было гетерозиготным по 1 маркерному гену, что не позволило проводить дифференциацию типу пыльцевых зерен.

Растение-донор пыльников клона am129 было гетерозиготным по 3 маркерным генам, что согласно формуле n=2^x позволяло выявить 8 типов пыльцевых зерен. Экспериментально получили, что регенеранты представляли только 2 типа. Растение-донор клона аm26 было гетерозиготным по 4 маркерным генам, что позволяло выявить 16 типов пыльцевых зерен. Фактически определено участие в формировании каллусной ткани 3 типов пыльцевых зерен.

Впервые проведено сравнительное испытание гомозиготных линий проса, полученных методом культуры пыльников, в полевых условиях. Это позволяет значительно ускорить селекционный процесс и целенаправленно получать генотипы с заданными признаками.

Источники информации
1. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1980, - 304 с.

2. Raghavan V. Pollen developmental biology in cultured anthers|| Cell culture and somatic cell genetics of plants. - 1986. - V 3. - P. 275-301.

3. Matthews P.S., Vasil I.K. The dynamics of cell proliferation in haploid and diploid tissues of Nicotiana tabacum|| Z. Pflanzenphysiologie. - 1976. - V. 77. - P. 222-236.

4. Vasil I.K., Nitsch C. Experimental production of pollen haploids and their uses|| Z. Pflanzenphysiologie. - 1975. - Bd. 76. - S. 191-212.

5. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. - М.: Высшая школа, 1987, - 591 с.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства и биотехнологии. Способ включает анализ регенерантных растений, для проведения которого используют пыльники растений-доноров с маркерными генами в гетерозиготном состоянии. По наличию маркерных признаков и расщеплению семей R₁, выращенных в полевых условиях, делают вывод о происхождении регенерантов из пыльцевых зерен, если в семьях R₁ отсутствует расщепление по маркерным признакам, и о происхождении из соматических клеток пыльника, если семьи расщепляются, различные сочетания маркерных признаков у регенерантных растений нерасщепляющихся семей при наличии у растения-донора пыльников более двух маркерных генов свидетельствуют о происхождении регенерантов из различных типов пыльцевых зерен. Изобретение позволяет выделить генетически однородные линии проса. 1 табл.

Способ генотипической оценки происхождения регенерантов культуры пыльников проса (Panicum miliaceum L.), основанный на анализе регенерантных растений, отличающийся тем, что для проведения анализа используют пыльники растений-доноров с маркерными генами в гетерозиготном состоянии, по наличию маркерных признаков и расщеплению семей R₁, выращенных в полевых условиях, делают вывод о происхождении регенерантов из пыльцевых зерен, если в семьях R₁ отсутствует расщепление по маркерным признакам, и о происхождении из соматических клеток пыльника, если семьи расщепляются, различные сочетания маркерных признаков у регенерантных растений нерасщепляющихся семей при наличии у растения-донора пыльников более двух маркерных генов свидетельствуют о происхождении регенерантов из различных типов пыльцевых зерен.