СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОТИПОВ ПРОСА (PANICUM MILIACEUM L.) Российский патент 2003 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности клонированию проса в течение длительного периода времени в культуре непрерывно регенерирующих каллусных тканей, и может быть использовано в генетических исследованиях и селекции для размножения ценных генотипов и получения клональных вариантов.

Известный способ клонирования генотипов проса (Panicum miliaceum L.) включает два важных этапа: а) получение эмбриогенных каллусных тканей в культурах первичных эксплантов; б) стимулирование регенерации корнесобственных растений в эмбриогенных каллусных тканях. Эмбриогенные каллусные ткани получены в культурах незрелых зародышей, листьев, отрезков стеблей и корней прорастающих семян на среде Линсмайера и Скуга-LS [1] в присутствии регулятора роста 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) в концентрациях 2,5-10 мг/л [2]. Стимулирование регенерационного процесса происходило после переноса эмбриогенных каллусов на среду LS без регуляторов роста. На этой среде регенерационный потенциал реализовывался в течение 2 пересадок, что эквивалентно 80 суткам культивирования в условиях регенерационной среды. Проблема увеличения числа регенератных растений решалась за счет культивирования каллусных тканей на каллусогенной среде LS, где они в течение 4 месяцев сохраняли эмбриогенные свойства. Эмбриогенные каллусные ткани также получены на среде Мурашиге и Скуга-MS [3], содержащей 5% кокосового молока и 2,5 мг/л 2,4-Д в культуре сегментов незрелых соцветий [4]. Стимулирование регенерационного процесса происходило на среде MS с 0,2 мг/л 2,4-Д. Эмбриогенные свойства каллусогенных тканей сохранялись в условиях каллусогенной среды в течение 9 месяцев.

Недостаток описанных выше способов состоит в том, что в период поддержания эмбриогенных каллусных тканей на каллусогенных средах генерационный процесс отсутствует и, следовательно, клонирование регенерантных растений не происходит. Культивирование каллусных тканей без регенерационного процесса приводит к потере времени и перерасходу компонентов культуральных сред.

Цель изобретения состоит в разработке условий длительного клонирования генотипов проса с использованием культуры непрерывно регенерирующих каллусных тканей.

Предложенный способ основан на технологии клонирования, которая наряду с получением эмбриогенных каллусов и стимулированием регенерационного процесса включает этап получения клонов в длительно культивируемых каллусных тканях, сочетающих процессы пролиферации клеток и регенерации корнесобственных растений, на среде без регуляторов роста.

Формирование эмбриогенных каллусных тканей в культуре сегментов незрелых соцветий происходит на среде, содержащей макро- и микросоли по Мурашиге и Скугу [3], витамины среды В5 по Гамборгу и Эвелегу [5], 100 мг/л мио-инозитола, 4 г/л сахарозы, 2 мг/л глицина, 6 г/л агара и 2 мг/л 2,4-Д (табл.1).

Среды для получения эмбриогенных каллусных тканей в культуре пыльников дополнительно содержат 200-500 мг/л L-глутамина или L-глутаминовой кислоты, повышенную концентрацию мио-инозитола (500 мг/л). Стимулирование регенерационного процесса происходит на среде, содержащей в качестве регуляторов роста 10 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) и 0,5 мг/л α-НУК (α-нафтилуксусная кислота). Эта среда характеризуется стандартным (100 мг/л) содержанием мио-инозитола и не содержит L-глутамин (L-глутаминовую кислоту).

Рыхлые регенерирующие каллусные ткани переносят на среду без регуляторов роста. В условиях этой среды устанавливается равновесная система, в которой одновременно происходят процессы пролиферации клеток каллусной ткани и регенерации корнесобственных растений. За счет этого процесс непрерывного получения корнесобственных растений происходит в течение длительного, исчисляемого годами, периода времени и характеризуется высокой степенью стабильности.

Простота культивирования непрерывно регенерирующих каллусных тканей на среде без регуляторов роста с периодическим выделением регенерантов и возможность массового получения регенерантных клонов, в том числе самоклональных и гаметоклональных вариантов, являются достаточными условиями использования способа в селекции проса.

Пример. В качестве экспланта использовали сегменты незрелых соцветий сорта проса Орловское 92, гибрида F₃ ПОМ5 x П1630 и пыльники сортов Благодатное, Крупноскорое и гибридов F₃: Соргообразный карлик 2010 x Могарообразное 2009; Могарообразное 2009 x Соргообразный карлик 2010; Регенерант 20 10 (получен из соматического каллусного клона сорта Орловское 92) x Соргообразный карлик 1959.

На всех этапах эксперимента применяли среды, содержащие макро- и микросоли MS [3], витамины среды В5 [5], 2 мг/л глицина, 40 г/л сахарозы, 6 г/л агара. В средах для индукции каллусогенеза в культуре сегментов незрелых соцветий в качестве регулятора роста использовали 2 мг/л 2,4-Д. Каллусогенез в культуре пыльников наблюдался на средах, дополнительно содержащих L-глутамин или L-глутаминовую кислоту (200-500 мг/л), повышенную концентрацию мио-инозитола (500 мг/л) и очищенный агар фирмы "Difco"(6 г/л). Для стимулирования регенерационного процесса применяли среды как с регуляторами роста, так и без них. В вариантах сред с регуляторами роста использовали 2,4-Д в низких концентрациях (0,2 мг/л) и различные сочетания цитокининов и ауксинов, преимущественно 6-БАП и α-НУК.

Эффективность формирования эмбриогенных каллусных тканей в культуре сегментов незрелых соцветий составляла 80%. Частота формирования эмбриогенных каллусных тканей в культуре пыльников составляла 0,2-0,5%.

Регенерация корнесобственных растений проходила при длительном культивировании эмбриогенных каллусных тканей в условиях каллусогенной среды, что наблюдалось достаточно редко. Регенерация наблюдалась также после переноса эмбриогенных каллусов на среды с низкой концентрацией 2,4-Д (0,2 мг/л) или не содержащие регуляторов роста. Наибольшая эффективность регенерационного процесса получена после переноса эмбриогенных каллусов на оригинальную среду, содержащую в качестве регуляторов роста 10 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л α-НУК.

В условиях этой среды регенерационный процесс наблюдался у 70% каллусов. С началом регенерации твердая каллусная ткань увеличивалась в объеме, становилась рыхлой и содержала регенерантные растения на различных стадиях развития. После переноса регенерирующей твердой каллусной ткани на среду без регуляторов роста наблюдалось одновременное течение процессов пролиферации каллусной массы и непрерывной регенерации корнесобственных растений. Сочетание этих процессов обеспечивало теоретически не ограниченную длительность культивирования ткани в условиях in vitro с периодическим переносом на свежие культуральные среды и выделением корнесобственных регенерантов в не стерильные условия.

Период формирования эмбриогенных каллусных тканей в культуре пыльников составлял 50 суток. Продолжительность этапа стимулирования регенерационного процесса в среднем составляла 25 суток. Период времени от посадки пыльников до регенерации корнесобственных растений равнялся 75 суткам, что значительно меньше продолжительности субкультивирования регенерирующих каллусных тканей на среде без регуляторов роста (табл.2).

ЛИТЕРАТУРА
1. Linsmaier E.M., Skoog F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures // Physiology of plant. - 1965. - V.8. - P. 100-127.

2. Heyser J.W., Nabors M.W. Regeneration of proso millet from embriogenic calli derived from various plant parts // Crop science. - 1982. - V.22. - 5. - Р. 1070-1074.

3. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures // Physiology of plant. - 1962. - V.15. - 13. - P.473-497.

4. Rangan T.S., Vasil I.K. Somatic embriogenesis and plant regeneration in tissue cultures of Panicum miliaceum L. and Panicum miliare Lamk // Z. Pflanzenphysiology. - 1983. - V.109. - P.49-53.

5. Gamborg O., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley // Can.J. Biochem. - 1968. - V.46. - 5. - Р. 417-421.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства. Способ включает получение эмбриогенных каллусных тканей. Для их формирования в культуре незрелых соцветий используется среда MS, дополненная витаминами среды B5 и 2 мг/л 2,4 Д. Эмбриогенные каллусы в культуре пыльников получают на среде, дополнительно обогащенной 200-500 мг/л L-глутамина и 500 мг/л миоинозитола, а стимулирование регенерационного процесса происходит после переноса эмбриогенных каллусных тканей на среду без L-глутамина, содержащую 10 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л α-НУК. Причем регенерирующую каллусную ткань помещают на среду без регуляторов роста для длительного культивирования in vitro с последовательным выделением корнесобственных растений в не стерильные условия. Изобретение позволяет получить культуру непрерывно регенерирующих каллусных тканей, а также сократить время получения клонов и перерасход компонентов культуральных сред. 2 табл.

Способ длительного клонирования генотипов проса (Panicum miliaceum L. ), включающий получение эмбриогенных каллусных тканей, отличающийся тем, что для их формирования в культуре незрелых соцветий используют среду MS, дополненную витаминами среды В5 и 2 мг/л 2,4 Д, эмбриогенные каллусы в культуре пыльников получают на среде, дополнительно обогащенной 200-500 мг/л L-глутамина и 500 мг/л миоинозитола, а стимулирование регенерационного процесса происходит после переноса эмбриогенных каллусных тканей на среду без L-глутамина, содержащую 10 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л α-НУК, причем регенерирующую каллусную ткань помещают на среду без регуляторов роста для длительного культивирования in vitro с последовательным выделением корнесобственных растений в не стерильные условия.