СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО КЛОНИРОВАНИЯ ПАЙЗЫ (ECHINOCHLOA FRUMENTACEA LINK) Российский патент 2003 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности клонированию пайзы в течение длительного периода времени в культуре непрерывно регенерирующих каллусных тканей, и может быть использовано в селекции для размножения ценных генотипов и получения сомаклональных вариантов.

Представители рода Echinochloa являются злаками. Их используют как фуражные культуры или для получения зерна в засушливых и полузасушливых регионах. Однако пайза (Echinochloa frumentacea Link.) является однолетней кормовой культурой, возделываемой в средней полосе России.

Известные способы клонирования представителей рода Echinochloa основаны на получении побегов в каллусных культурах зрелых семян Е. oryzicola Vasing [1] , регенерантных растений в культурах листьев Е. oryzicola Vasing [2], сегментов молодых соцветий Е. crusgalli и Е. colonum (L.) Link [3, 4], мезокотилей Е. crusgalli var. oryzicola и Е. muricata [5]. Наиболее совершенным является способ клонирования Е. glabrescens Munro ex Hook F. в культурах незрелых соцветий и листьев [6]. Он основан на использовании 3 типов сред: каллусогенной, регенерационной и поддерживающей регенерационный потенциал в состоянии покоя в течение продолжительного (примерно 7 месяцев) периода времени.

Недостаток описанного способа клонирования состоит в том, что отсутствует воспроизводство регенерационного потенциала. В условиях регенерационной среды он исчерпывается в течение короткого периода времени. Использование среды, поддерживающей регенерационный потенциал в состоянии покоя означает, что в это время регенерация отсутствует и, следовательно, клонирование регенерантных растений не происходит. При этом поддержание требует проведения частных пересадок. Таким образом, культивирование каллусных тканей без регенерационного процесса приводит к потери времени и перерасходу компонентов сред. Стоит отметить, что в литературе нет данных о методах клонирования пайзы.

Цель изобретения состоит в разработке условий длительного клонирования генотипов пайзы с использованием непрерывно регенерирующей каллусной культуры.

Предложенный способ основан на получении морфогенных каллусов в культуре зрелых семян и формировании каллусной культуры, воспроизводящий свой регенерационный потенциал. Получение каллусов происходит на среде 2КС, содержащей макро- и микросоли по Мурашиге и Скугу [7], витамины по Гамборгу и Эвелегу [8], 100 мг/л миоинозитола, 4 г/л сахарозы, 2 мг/л глицина, 6 г/л агара и 2 мг/л 2,4-Д. В процессе субкультивирования в условиях каллусогенной среды часть каллусов приобретает морфогенные свойства и состоит из нескольких типов тканей. На границе со средой находится недифференцированная ткань. По мере удаления от поверхности среды располагаются опушенные ткани. На поверхности каллусов находятся белые компактные, а также полупрозрачные рыхлые ткани с зачатками регенерирующих побегов.

На свежие среды переносят участки каллусов с компактными (можно без них) и регенерирующими тканями. При этом на границе со средой формируется прослойка пролиферирующей недифференцированной ткани. Находящиеся на поверхности эксплантов белые компактные ткани подвергаются дедифференциации. Также частичной дедифференциации подвергаются и регенерирующие ткани. Через 30-40 суток после помещения эксплантов на свежие среды вновь сформировавшиеся каллусы делятся на 4 типа.

А. Каллусы с недифференцированной тканью на границе со средой, белыми компактными тканями на поверхности и наличием регенерационного процесса.

Б. Каллусы с недифференцированной тканью и наличием регенерационного процесса.

В. Каллусы с преобладанием регенерационного процесса и отсутствием пролиферации каллусной массы.

Г. Каллусы с преобладанием пролиферации недифференцированной ткани.

У сформированных каллусов первых трех типов (А, Б, В) регенерирующие участки, как правило, не подвергаются дедифференциации, а побеги по мере роста могут формировать слабые корешки. У четвертого типа каллусов процесс пролиферации недифференцированных клеток полностью подавляет регенерацию. Пригодными для дальнейшего субкультивирования на свежих средах являются участки двух первых типов каллусов (А, Б).

Возможность длительного культивирования регенерирующих каллусных тканей определяется первоначальной концентрацией 2,4-Д. Содержание в среде 2 мг/л 2,4-Д создает разность концентраций в каллусных тканях, обеспечивая протекание разнородных процессов: дедифференциации и активного роста каллусной ткани (высокая концентрация 2,4-Д на границе со средой) и дифференциации и регенерации (уменьшение концентрации 2,4-Д в направлении от среды к поверхности каллусной ткани). Уменьшение содержания 2,4-Д в среде приводит к снижению интенсивности пролиферации недифференцированной ткани. На среде с 1 мг/л 2,4-Д процесс дедифференциации полностью прекращается у 2/3 каллусов, ранее культивируемых на среде с 2 мг/л 2,4-Д. На среде без регуляторов роста наблюдалось простое разрастание побегов. Увеличение содержания 2,4-Д в среде свыше 2 мг/л приводит к усилению дедифференциации и уменьшению числа морфогенных каллусов.

Таким образом, воспроизводство в процессе субкультвирования регенерационного потенциала и непрерывная регенерация создают предпосылки для длительного, исчисляемого годами, получения клонов регенерантов пайзы.

Пример. Простерилизованные в 96% этиловом спирте (1 мин) и 0,5% растворе хлоргексидиндиглюконата натрия (10 мин) зрелые семена пайзы помещали на среду 2КС. В этих условиях одна часть семян прорастала, а на других семенах наблюдалось образование каллусов (12,2%). Каллусы формировались за счет дедифференциации тканей проростков. Полученные каллусы, за редким исключением, не имели морфогенных свойств. После их пересадки на свежие среды формировались морфогенные каллусы (62,5%) с различными типами тканей. На поверхности недифференцированной каллусной массы образовывались участки с зачатками регенерационных побегов, волоски и очаги белых компактных тканей.

Участки каллусов с компактными тканями и с зачатками регенерирующих побегов (тип А) переносили на свежие среды 2КС. В результате их переноса и развития на свежих средах формировались каллусы 4 типов (см. таблицу). Следует обратить внимание на то, что при переносе на свежие среды организованных участков каллусов типа Б также формируются каллусы типов А, Б, В, Г.

Перенос участков каллусов типов А и Б со среды 2КС на среду MS (без регуляторов роста) приводил к затуханию пролиферации каллусной массы и умножению числа побегов без корней по типу кущения. Стоит отметить, что растения без корневой системы, полученные на среде MS, плохо переносили перевод в нестерильные условия. Как правило, в почвенную культуру переводили регенерантные растения со слабой корневой системой, полученные на среде 2КС. Для того чтобы получить растения с корешками, пригодные для перевода в нестерильные условия, проводили пересадки с интервалом, превышающим 35 суток.

Таким образом, периодический перенос организованных участков каллусов типа А и Б на свежие среды 2КС обеспечил воспроизводство регенерационного потенциала в течение длительного, исчисляемого годами, периода времени. Например, регенерирующий каллусный клон пайзы сорта "Удалая" культивировали in vitro в течение 6 лет.

В лабораторию селекции проса ВНИИЗБК переданы семена более 100 регенерантов R₀ с целью выявления сомаклональных вариантов для использования в различных селекционных программах.

ЛИТЕРАТУРА
1. Maeda E. , Sugiura T. Ultrastructure of barnyard grass callus cells cultured under an aseptic condition // Proc. Crop. Sci. Soc. Jpn. - 1976. - V.45. - P.591-597.

2. Takahashi A., Sakuragi Y., Kamada H., Ishizuka K. Plant regeneration through somatic embryogenesis in barnyardgrass, Echinochloa oryzicola Vasing // Plant science letters. - 1984. - V.36. - P. 161-163.

3. Wang D.Y., Yan K. Somatic embryogenesis in Echinochloa crusgalli // Plant cell reports. - 1984. - V.3. - P.88-90.

4. Tyagi A. K., Bharal S., Rashid A., Maheshwari N. Plant regeneration from tissue cultures initiated from immature inflorescences of a grass, Echinochloa colonum (L. ) Link. // Plant cell reports. - 1985. - V.4. - P. 115-117.

5. Cobb В. G. , Vanderzee D., Zoescher W.Z., Kennedy R.A. Evidence for plantlet regeneration via somatic embryogenesis in the grasses Echinochloa muricata and E. crusgalli var. oryzicola // Plant science. - 1985. - V. 40. - P. 121-127.

6. Wang M., Zapata F.J. Somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue culture of Echinochloa glabrescens Munro ex Hook. F. // Journal of plant physiology. - 1987. - V. 130. - P.79-85.

7. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures // Physiology of plant. -1962. - V.15. - 13. - P.473-497.

8. Gamborg O., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - V.46. - 5. - P.417-421.

Изобретение предназначено для использования в сельском хозяйстве. Способ включает получение морфогенных каллусов. Для их формирования в культуре зрелых семян используют среду MS, дополненную витаминами В5, содержащую 100 мг/л миоинозитола, 4 мг/л сахарозы, 2 мг/л глицина, 6 г/л агара и 2 мг/л 2,4-Д. Стимулирование процесса регенерации и воспроизводство регенерационного потенциала проходит в процессе их субкультивирования в условиях каллусогенной среды. Причем каллусы с недифференцированными и регенерирующими тканями культивируют в течение длительного, исчисляемого годами, периода времени с последовательным выделением регенерантных растений в нестерильные условия. Изобретение позволяет увеличить длительность клонирования. 1 табл.

Способ длительного клонирования генотипов пайзы (Echinochloa frumentacea Link.), включающий получение морфогенных каллусов, отличающийся тем, что для их формирования в культуре зрелых семян используют среду MS, дополненную витаминами В5, содержащую 100 мг/л миоинозитола, 4 мг/л сахарозы, 2 мг/л глицина, 6 г/л агара и 2 мг/л 2,4-Д, а стимулирование процесса регенерации и воспроизводство регенерационного потенциала происходит в процессе их субкультивирования в условиях каллусогенной среды, причем каллусы с недифференцированными и регенерирующими тканями культивируют в течение длительного, исчисляемого годами, периода времени с последовательным выделением регенератных растений в нестерильные условия.