ПРЕПАРАТ ПРОТИВ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА И ДРУГИХ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ-ВРЕДИТЕЛЕЙ Российский патент 2003 года по МПК A01N63/00 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений.

Известны отечественные препараты битоксибациллин (БТБ) и бикол, рекомендуемые для борьбы против личинок колорадского жука 1-2 возраста и ряда других насекомых-вредителей [1]. Эти препараты готовят на основе штаммов Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. В качестве действующего начала они содержат два токсина: β-экзотоксин, эффективный против чешуекрылых и сосущих насекомых, а также против колорадского жука, и δ-эндотоксин, обладающий специфической инсектицидной активностью против чешуекрылых. Препараты выпускаются в виде смачивающихся порошков, для чего в своем составе дополнительно содержат смачиватель.

Недостатком этих препаратов являются высокие нормы расхода при использовании их против колорадского жука: 2-5 кг/га.

Известны также отечественный препарат децимид и зарубежный препарат новодор, которые готовятся на основе штаммов В. thuringiensis var. tenebrionis и содержат в качестве действующего начала δ-эндотоксин, обладающий специфической инсектицидной активностью против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых. Эти препараты рекомендуется применять против личинок 1 -2 возраста.

Недостатком их также являются сравнительно высокие нормы расхода: 2-6 л/га [1].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является жидкий отечественный препарат Колорадо [2]. Он также готовится на основе В. thuringiensis var. tenebrionis и содержит в качестве действующего начала δ-эндотоксин, обладающий специфической инсектицидной активностью против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых. Этот препарат рекомендуется применять против личинок 1-2 возраста. Препарат содержит в своем составе глицерин, масло тридекан, углерод технический в качестве фотопротектора, в качестве ПАВ - Слан 60 и неонол, а также отдушку. Препарат Колорадо дешевле сухих микробных препаратов и удобнее в применении.

Однако недостатком его также является сравнительно низкая эффективность, приводящая к высоким нормам расхода: 4-5 кг/га [1, 2].

Задача изобретения - создание нового высокоэффективного препарата против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых-вредителей.

Задача решается тем, что предлагается препарат на основе рекомбинантного штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IPM-37 [3], который синтезирует два энтомотоксина с различным механизмом действия - β-экзотоксин и инсектицидный белок cry3А-типа. Кроме действующего начала препарат содержит смачиватель, стабилизатор, прилипатель, загуститель и консервант при следующем соотношении компонентов:
Концентрат биомассы штамма IPM-37 - 84-97
Стабилизатор (глицерин) - 0-10
Смачиватель (Тритон Х-100, ОП-7 или аналогичный) - 1-2
Прилипатель (поливинилацетат) - 1-2
Загуститель - набухающий в воде полимер (сакап-акмид, поливиниловый спирт) - 0,5-2,0
Консервант (фенол) - 0,3-0,5
Подобранным сочетанием добавок обеспечивается биологическая и физическая стабильность препарата. Гарантийный срок хранения - не менее 1 года при температурах до +25^oС. В процессе хранения частицы действующего начала не агрегируются, что в совокупности с хорошей адгезией и высокой биологической активностью дает возможность применять препарат против колорадского жука с высокой эффективностью в дозах 1-2 л/га.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление препарата с сакапом.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IPM-37 выращивают в лабораторном ферментере NBS (рабочий объем 8 дм³) на питательной среде следующего состава:
Панкреатический гидролизат казеина (ПГК) - 0,9 г/дм³ по аминному азоту
Сахароза - 9 г/дм³
К₂HРО₄•3Н₂О - 4 г/дм³
MgSО₄•7Н₂O - 0,2 г/дм³
Раствор микроэлементов - 10 см³/дм³.

Для приготовления 1 дм³ среды используют 37,5 г ПГК, содержащий 2,4% аминного азота. В качестве посевного материала используют смыв 6-суточной агаровой культуры с 3-х пробирок, прогретых при температуре 65^oС в течение 10 мин. Выращивание производят при температуре (29±1)^oC. Обеспечение развивающейся культуры кислородом и поддержание концентрации водородных ионов осуществляют в соответствии с алгоритмом ферментации, представленном в табл. 1. Для поддержания величины рН в заданном диапазоне в ферментер вводят 15%-ный раствор серной кислоты.

В клетках 25-30-часовой культуры формируются споры и кристаллы δ-эндотоксина. Для детектирования этого процесса используют фазово-контрастную микроскопию. Процесс выращивания прекращают при наличии 50% свободных спор. Обычно это происходит через 35 ч роста или позднее. Культуру, содержащую 50% свободных спор, выдерживают в статических условиях (без аэрации и перемешивания) при температуре 20-25^oС до полного лизиса клеток. Продолжительность этого периода не превышает 24 ч. Полученная культура содержит 2,8 г/дм³ δ-эндотоксина, 0,60 г/дм³ β-экзотоксина и 2,2•10⁹ спор/см³.

Полученную биомассу концентрируют центрифугированием или сепарированием. Осадок спорокристаллического комплекса (СКК) отделяют, а к супернатанту добавляют СаСl₂ для осаждения β-экзотоксина. Осадок β-экзотоксина снова отделяют центрифугированием или сепарированием. Объединяют осадки СКК и β-экзотоксина и добавляют супернатант, полученный после отделения β-экзотоксина, в таком количестве, чтобы объем концентрата составлял 1/5 исходного объема культуры.

В небольшом объеме супернатанта замачивают сакап в количестве 0,5% от массы концентрата в течение 30 мин. В концентрат биомассы вносят до 10% глицерина, 1% - Тритона X-100, 1% - поливинилацетата (ПВА), 0,5% - фенола и набухший гель сакапа. Все тщательно перемешивают до однородной консистенции и получают препарат следующего состава, %:
Концентрат биомассы штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IPM-37 - 87
Глицерин - 10
Тритон Х-100 - 1
Поливинилацетат - 1
Фенол - 0,5
Сакап - 0,5
Пример 2. Приготовление препарата с поливиниловым спиртом.

Готовят концентрат биомассы вышеупомянутого штамма, как описано в примере 1. В небольшом объеме супернатанта замачивают поливиниловый спирт (ПВС) в количестве 2,0% от массы концентрата в течение часа. В концентрат биомассы вносят 1,5% Тритона Х-100, 2% - ПВА, 0,5% - фенола и набухший гель ПВС. Все тщательно перемешивают до однородной консистенции и получают препарат при следующем соотношении компонентов, %:
Концентрат биомассы вышеупомянутого штамма - 84
Глицерин - 10
Тритон Х-100 - 1,5
Поливинилацетат - 2
Фенол - 0,5
Поливиниловый спирт - 2,0
Пример 3. Определение инсектицидной активности препарата против колорадского жука в лабораторных условиях.

Готовят 4-5 разведений препарата с шагом в 10 раз. Листья картофеля окунают в эти суспензии, подсушивают на воздухе и помещают в чашки Петри, в которые затем вносят личинок колорадского жука 1-2 возраста в количестве не менее 10 штук на чашку. Каждое разведение исследуется не менее чем в трех повторностях. Учет погибших гусениц проводят с 3-их по 5-е сутки. По результатам учета гибели личинок на 5-е сутки вычисляют значения ЛК₅₀ по формуле Кербера. В одном опыте одновременно испытывали препараты, приготовленные по примерам 2 и 3, БТБ и Новодор. Величины ЛК₅₀ составили для препарата по примеру 1 - 0,003%, по примеру 2 - 0,003%, для БТБ - 0,004%, для Новодора - 0,005%.

Пример 4. Определение инсектицидной активности препарата против большого мучного хрущака (Tenibrio molitor).

Искусственный корм, состоящий из отрубей и пшеничной муки в соотношении 1: 1, смешивают с препаратами, приготовленными по примерам 1, 2 и Новодором, используя 1 мл препарата на 3 г корма, и тщательно перемешивают. В чашки Петри раскладывают по 0,5 г обработанного корма и на него помещают не менее 20 личинок Tenibrio molitor 3-4 возраста. Результаты учета гибели личинок приведены в табл. 2. Как следует из табл. 2, исследовавшиеся препараты вызывают полную гибель личинок одного из наиболее устойчивых к воздействию инсектицидов вредителя зерновых запасов.

Пример 5. Определение удерживаемости препарата на модельной поверхности.

В качестве модельной поверхности используют стекло, покрытое парафином. На парафинированное предметное стекло наносят 0,1 мл 1%-ной суспензии препаратов (по примерам 1, 2, по примеру 1 без сакапа, по примеру 2 без ПВС, а также концентрата биомассы) и высушивают на воздухе. Затем стекло промывают струей дистиллированной воды из делительной воронки так, чтобы объем смыва составил 100 мл. Иммуноферментным методом определяют содержание δ-эндотоксина в исходной суспензии и в смыве. Удерживаемость вычисляют как отношение содержания токсинов в смыве к исходной суспензии. Повторность опытов трехкратная. Результаты приведены в табл. 3. Как следует из табл. 3, набухающие и растворимые в воде полимеры способствуют физической стабильности препаратов и сохранению их высоких адгезионных свойств. Использование этих полимеров в составе препарата в концентрациях более низких, чем заявляемые, не обеспечивает нужного эффекта, а применение их в более высоких концентрациях снижает текучесть препаратов и повышает их стоимость.

Пример 6. Полевые испытания препарата против колорадского жука на картофеле.

Испытания проводили во ВНИИ картофельного хозяйства на делянках площадью 25 м² (100 кустов) в четырехкратной повторности. Норма расхода рабочей жидкости - 400 л/га, опрыскиватель "Rapid", сорт картофеля - Невский.

Было проведено два цикла обработок: в первом цикле испытывали БТБ и препарат, приготовленный по примеру 1, в дозе 0,8 кг/га. Популяция личинок перед опрыскиванием на 71% состояла из личинок 1-2 возраста. Во втором цикле испытывали препарат по примеру 2 в дозе 2 кг/га. Второй цикл проводили через две недели после первого, поэтому популяция личинок в основном состояла из личинок более старших возрастов. Результаты представлены в табл. 4.

Как следует из табл. 4, заявляемый препарат имел эффективность 95% при норме расхода 2 кг/га. Таким образом, предлагаемый препарат более чем в 2 раза эффективнее прототипа (Колорадо), который по литературным данным имел эффективность 80% при норме расхода 5 кг/га [2].

Источники информации
1. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в Российской федерации (составители Д.А. Орехов, О.П. Картомышев, О.В. Морозов, Е.В. Кузьмичева). М.: Колос, 1998, 238 с.

2. Патент RU 2125091, кл. A 01 N 63/00, С 12 N 15/32, 1999 г. Бюл. 2.

3. Патент RU 2081583, кл. А 01 N 63/00 С 12 N 1/20, 1997 г.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений. Изобретение представляет собой новый высокоактивный препарат против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых-вредителей. Препарат создан на основе рекомбинантного штамма Bacillus thuringiensis IPM-37, который синтезирует β-экзотоксин и инсектицидный белок cry 3А-типа. Препарат имеет жидкую форму следующего состава, мас.%: концентрат биомассы штамма IPM-3784-97, стабилизатор (глицерин) 0,10, смачиватель (Тритон X-100, ОП-7 или аналогичный) 1-2, прилипатель (поливинилацетат) 1-2, загуститель - набухающий в воде полимер (сакап-акмид, поливиниловый спирт) 0,5-2,0, консервант (фенол) 0,3-0,5. Предложенный состав препарата обеспечивает его биологическую и физиологическую стабильность. Гарантийный срок хранения - не менее 1 года при температурах до 25^oС. В процессе хранения частицы действующего начала не агретируются, что в совокупности с хорошей адгезией и высокой биологической активностью позволяет применять препарат против колорадского жука с высокой эффективностью в дозах 1-2 л/га. 5 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Препарат против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых-вредителей, содержащий токсин Bacillus thuringiensis как действующее начало, стабилизатор, смачиватель, прилипатель и консервант, отличающийся тем, что в качестве активного начала он содержит β-экзотоксин - инсектицидный белок cry 3А-типа в виде концентрата биомассы штамма В. thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37 и дополнительно препарат содержит загуститель при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Концентрат биомассы штамма В. thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37 - 84-97
Стабилизатор - 0-10
Смачиватель - 1-2
Прилипатель - 1-2
Загуститель - 0,5-2,0
Консервант - 0,3-0,5
2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве загустителя он содержит набухающий в воде полимер, например, сакап-акмид либо поливиниловый спирт. 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве смачивателя он содержит тритон Х-100, ОП-7 или другое вещество с аналогичными физико-химическими свойствами. 4. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве прилипателя он содержит, например, поливинилацетат. 5. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве консерванта он содержит, например, фенол. 6. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора он содержит, например, глицерин.