Штамм энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271, перспективный для получения биопрепарата против листогрызущих насекомых Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается нового штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis, который может быть использован в качестве основы биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых.

Известен штамм Bacillus thuringiensis Н8 ВКПМ В-8057, предназначенный для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, в частности с колорадским жуком. Штамм обладает повышенным уровнем токсинообразования и малым количеством спор (олигоспорогенный штамм) для предотвращения загрязнения окружающей среды спорами в случае применения биопестицида на основе этого штамма (патент RU 2204598 С1; МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубл. 20.05.2003, бюл. №14). Существенным недостатком данного штамма является узкий спектр действия на листогрызущих насекомых. Учитывая, что штамм Н8 ВКПМ В-8057 является олигоспорогенным, требуются особые условия поддержания и хранения.

Известен штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56, депонированный под номером RCAM 04725. Штамм обладает одновременно высокой энтомоцидной активностью в отношении широкой группы массовых вредоносных видов насекомых - фитофагов, высокой антифунгальной активностью против различных фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и ростостимулирующим действием на растения, т.е. является эффективным полифункциональным средством для использования в растениеводстве. Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 обладает энтомоцидным действием в отношении таких вредителей-фитофагов как колорадский жук, картофельная коровка, крестоцветные блошка, листоед, долгоносик, обитающих на различных сельскохозяйственных культурах (овощные, зерновые и ягодные) (патент RU 2692655 С2; МПК C12N 1/00, опубл. 25.06.2019, бюл. №18).

Известен штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis №25 (BtH₁₀ №25), который обладает полифункциональными свойствами: высокой инсектицидной и антифунгальной активностью в отношении широкой группы массовых вредоносных видов жесткокрылых насекомых и ростостимулирующим действием на растения, пригоден для создания высокоэффективного энтомоцидного препарата (патент RU 2514023 С1; МПК C12N 1/20, A01N 63/00, A01N 63/02, А01С 1/06, опубл. 27.04.2014, бюл. №12).

Штамм BtH₁₀ №25 имеет ряд недостатков, препятствующих его использованию как эффективного штамма для создания на его основе биопрепарата: культивирование на сложных органоминеральных средах, низкая скорость достижения стадии зрелости культуры.

В качестве ближайшего аналога выбран штамм Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis Ню №109 (BtH₁₀ №109) - продуцент препарата «Бацикол», совмещающий инсектицидные и антифунгальные свойства.

Однако необходимо отметить наличие морфолого-колониальной изменчивости штамма Н₁₀ №109 и появление различных диссоциантов. Также штамм, имея высокую эффективность против колорадского жука, значительно уступает по эффективности против чешуекрылых эталонному штамму №98, являющемуся продуцентом БТБ. В лабораторных экспериментах установлена высокая эффективность нативной культуральной жидкости и супернатанта культуральной жидкости, в то время как осадок, полученный в результате центрифугирования культуральной жидкости, (т.е. споро-кристаллический комплекс BtH₁₀ №109) был менее активен. Штамм идентифицирован в качестве Bacillus thuringiensis Н₁₀ (darmstadiensis). Образует одну спору и один кристалл эндотоксина. Образует водорастворимый термостабильный экзотоксин. Для штамма BtH₁₀ №109 характерны округлые колонии бело-серого цвета с гладким краем. Структура колоний однородная, плотной консистенции с матовой поверхностью (http://earthpapers.net/patotipy-bacillus-tlmringiensis-i-ekologicheskie-osnovy-ih-ispolzovaniya-v-zaschite-rasteniy-1; http://www.old.timacad.ru/catalog/disser/kd/belousova/kd_belousova.pdf)

В основу изобретения поставлена техническая задача получения эффективного штамма энтомопатогенных бактерий группы Bacillus thuringiensis, обладающего высокой энтомоцидной активностью, с широким спектром действия, технологичного, который должен культивироваться на дешевых и простых питательных средах в один цикл, который может быть использован для разработки биопрепарата против листоедов на стадии активного питания.

Поставленная задача решена в ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» путем выделения из природных популяций насекомых Крыма нового эффективного штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271.

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 выделен микробиологическим методом (Бурцева Л.И. Методы выделения и биотестирования энтомопатогенных бактерий // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / под ред. В.В. Глупова. - М.: Круглый год, 2001. - 736 с.) из гусениц американской белой бабочки (Hyphanlria cunea Drury) природной популяции. Штамм был идентифицирован по определителю Берджи (1974), Barjac, Bonnefoi (1968), Lusenco (1963) и сравнен с типовым штаммом бактерий Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis Н₁₀ №109 Штамм депонирован 17.10.2019 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05206.

Культурально-морфологические признаки штамма следующие. Клетки суточной культуры палочкоподобные с закругленными концами, размер клеток от 0,5-0,9 до 3,5-6,0 мкм. Подвижные благодаря жгутикам (перитрихи), грамположительные. Образуют споры, белковый кристаллический эндотоксин и термостабильный экзотоксин.

На МПА образовывают серовато-белые округлые, плоские, слабо жесткие колонии со слегка зубчатым краем. Диаметр колоний 7-12 мм. Рельеф колоний плоский, поверхность матовая, серовато-бежевого цвета с более светлой ареолой. Культуры быстрорастущие, появляются на поверхности МПА на вторые-третьи сутки. На стадии вегетативного роста бактерии образуют цепочки (до 5-9 клеток в цепочке). Окраска по Граму положительная. Споры в клетках расположены субтерминально, бипирамидальные кристаллы эндотоксина находятся в противоположном от спор конце клетки.

Физиолого-биохимические признаки штамма. Факультативный анаэроб, желатину разжижает на 5-е сутки. На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол. Гидролизует крахмал (зона гидролиза 8,5 мм), не использует цитраты. На средах, содержащих желток, не образует лецитиназу, также не образовывает пигмент и уреазу. Индол и сероводород не использует. Отношение к источнику углерода выражено в активном усвоении глюкозы, рамнозы и мальтозы. Сахарозу, маннозу, салицин, галактозу, дульцит и лактозу не усваивает. Отношение к источнику азота выражено в активном росте на средах с аммонийными солями, на МПА.

На плотных и жидких средах штамм растет в пределах 20-35°С, температурный оптимум составляет 26-30°С. Рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 7,0-8,3, а оптимальной является реакция среды 7,2-7,6. Признаки штамма стойкие. Антигенные свойства штамма: дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis H-10. Культуру сохраняют на скошенном МПА при температуре 3-5°С, пересевая 2 раза в год. Состав питательной среды для долгосрочного сохранения штамма: мясные кубики 0,4%, пептон 1,0% NaCl - 0,5%, агар - 2,0%, вода - 1 л. Возможно хранить культуру на картофельном агаре (КА) на 1 л: картофель - 300 г, пептон -10 г, сахароза -5 г, агар-агар - 20 г. рН среды - 6,8-7,0.

Энтомопатогенные свойства штамма изучали в лабораторных экспериментах в литровых банках, куда помещали гусениц вместе с обработанным кормом (листьями соответствующих растений). Обработанным кормом гусеницы питались в течение 3-х суток, затем корм меняли на необработанный. Опыты вели в 3-х повторностях, по 25 гусениц в каждой. Энтомоцидную эффективность учитывали на 3, 5, 7, 10-е сутки со дня поставленного опыта. Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 обладает энтомоцидной активностью для насекомых отряда Coleoptera и Lepidoptera. Рекомендован для борьбы с личинками и гусеницами младших возрастов, в особенности колорадского жука. Штамм проявляет 85,0-100% энтомоцидную активность против личинок и гусениц листогрызущих насекомых. Так, 100% гибель личинки колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say, Coleoptera) происходит в течение 7 суток, причем, более 50% насекомых (до 53,3%) погибает в течение 3-х суток. Энтомоцидная активность заявляемого штамма против ильмового листоеда (Xanthogaleruca luteola Statins Muller, Coleoptera) составила 95,8% на 7-е сутки. Эффективность штамма и против личинок самшитовой огневки на 7-е сутки составила 85,4-100%, на 5-е сутки гибель гусениц L_1-2 составила в среднем 83,3%. Гусеницы американской белой бабочки (Hyphantria cunea Drury, Lepidoptera) и плодовой моли практически полностью погибают в течение 6-7 суток. Гусеницы златогузки (Euproctis chrysorrhoea L., Lepidoptera) и капустной совки (Mamestra brassicae L., Lepidoptera) погибают в течение 10 суток на 93,5-99,4%. Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека.

Биотехнологическая характеристика: штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 продуцирует энтомоцидный эндотоксин, освобождающийся из клеток в процессе лизиса их оболочек и экзотоксин, продуцирующийся в процессе вегетативного роста культуры.

Жидкая культура штамма является основой для разработки биопрепарата. Маточную культуру бактерий выращивают в колбах Эрленмейера на жидкой питательной среде, которая состоит из кукурузного экстракта - 50 г/л, глюкозы - 7 г/л, воды водопроводной, рН 6,8-7,0. Маточную среду засевают суспензией спор, выращенных на МПА и инкубируют на термостабильной качалке при 28-32°С, 220 об/мин., в течение 13-15 часов. Титр колониеобразующих единиц (КОЕ) маточной культуры должен быть не менее 1,5-2,0⋅10⁸ в 1 мл. Маточную культуру используют для засева питательной среды для получения жидкой споровой культуры. Как питательную среду используют среду того же состава, как и при получении маточного материала. Может быть использована среда состава соевая мука - 2,5%, крахмал кукурузный - 1,6%. Среду засевают в объеме 1% от объема среды. Культивирование проводят в стеклянных бутылях объемом 3 л с 0,4 л среды на технологичных качалках при температуре 28-30°С, 220 об/мин., в течение 45-48 часов. После окончания культивирования жидкая культура содержит в основной своей массе свободные споры, титр которых составляет 1,2-1,7 млрд. в 1 мл, включения эндотоксина и 0,4 мг/мл экзотоксина.

Лабораторное определение энтомоцидной активности жидкой препаративной формы заявляемого штамма проводили на личинках колорадского жука, гусеницах американской белой бабочки и капустной белянки. Корм (листья картофеля, клена, капусты) обрабатывали водяной суспензией бактерий, потом подсаживали по 25 насекомых (в 3-разовой повторности). Одновременно по поврежденности корма (в %) оценивалась антифидантная активность препаративной формы штамма 0271. Для сравнения исследовали также штаммы Н₁₀ №109 и №98, результаты исследований приведены в таблице 1.

Данные таблицы 1 свидетельствуют, что для гусениц американской белой бабочки и капустной совки штамм 0271 почти в 1,5 раза превышает эффективность штамма Н₁₀ №109 и в 1,2 раза эффективность штамма 98 (продуцента БТБ). Энтомоцидная активность штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 (LD₅₀ млн. спор /мл) по отношению к личинкам колорадского жука составляет 4,24.

Бактериальная суспензия штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 имеет антифидантное действие: поврежденность корма после обработки не превышала 5%, контрольные (без обработки) 7 растений были повреждены на 85-95%. Физиологическое действие бактериальной суспензии штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 проявлялось также в снижении веса на 31-85% и размеров на 28-72% исследуемых насекомых, в сравнении с контрольными после 10 суток опыта.

Таким образом, предлагаемый штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271 обладает высокой энтомоцидной активностью в отношении широкого спектра вредителей и может быть использован в качестве основы биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271, полученный микробиологическим методом из гусениц американской белой бабочки природной популяции и депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05206. Штамм является продуцентом белкового энтомоцидного эндотоксина и может быть использован в качестве основы биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых. 1 табл.

Применение штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05206, для получения биопрепарата против листогрызущих насекомых.