Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 в качестве полифункционального средства для растениеводства Российский патент 2019 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма бактерий p. Bacillus в качестве средства для защиты растений от насекомых-вредителей и грибных болезней, а также стимулирования их роста.

Интенсификация сельского хозяйства обусловила необходимость применения биологических средств защиты растений от вредных насекомых, уничтожающих до 30% урожая [1].

К наиболее опасным насекомым относятся жесткокрылые насекомые, в частности, колорадский жук, который поражает картофель, баклажаны, томаты, перец. Картофель - излюбленное кормовое растение. Жуки хорошо адаптируются к разнообразным экологическим условиям, а также по отношению к корму. Оказавшись на томате (на неблагоприятном для них кормовом растении) жуки очень быстро привыкают к нему. Столь быстрое привыкание к новому корму объясняется возможностью адаптивных перестроек пищеварительной системы, связанной с активностью гидролитических ферментов. Для колорадского жука в Европейской части ареала характерна постоянно высокая плотность популяции. При высокой плодовитости самок (обычно около 500, но в ряде случаев - более 4000), наличие трех и даже двух генераций, потомство одной самки теоретически к концу сезона может достичь 30 млн особей [2].

Для борьбы с колорадский жуком используются в основном химические инсектициды: Актар, Фастап, Регент, Конфидор, Танрет и др. Однако по мере использования этих препаратов, у насекомых возникает к ним устойчивость, в результате чего их эффективность снижается. Это заставляет либо повышать дозу применения препарата, либо проводить ротацию инсектицида. Кроме того, химические инсектициды небезопасны экологически, не обладают избирательностью действия, могут накапливаться в почве, воде, опасны для человека и теплокровных животных.

В качестве альтернативных средств используются биологические инсектициды: Боверин, Битоксибациллин, Колорадо, Новодор, однако они не охватывают целой группы массовых вредоносных видов жесткокрылых насекомых.

К числу экономически значимых болезней растений относятся болезни, вызываемые микроскопическими грибами [3]. Для борьбы с возбудителями болезней растений грибного или бактериального происхождения также широко используются химические фунгициды: Альто, Раксил, Фундазол, Фоликур, эффективность пестицидного действия которых составляет не более 50-60%. Но эти препараты способны накапливаться в окружающей среде, вызывая фитоток-сический эффект. Кроме того, после их применения необходим период регламентированного ожидания до появления на обработанных участках людей и техники. В качестве альтернативных средств защиты растений от грибных болезней используются биологические препараты, основу которых составляют метаболиты бактериального происхождения, проявляющие антагонистическую активность по отношению к различным их возбудителям: Флавобактерин, Мизорин, Агат-25, Бактофит и др. [4].

Известно изобретение «Инсектицидный препарат «Колорадо» против жесткокрылых насекомых и штамм бактерий Bacillus thuringiensis, используемый для получения инсектицидного препарата по патенту №2081583, заявка 93018092/13 с приоритетом от 7.04.1993 г., МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликовано 20.06.1997 г.

В патенте описан штамм Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, депонированный в ВКПМ под №В-6306, на основании которого создан жидкий биоинсектицид «Колорадо», содержащий в качестве действующего начала 5-эндотоксин, активный против колорадского жука, щавелевого листоеда, пьявицы красногрудой. Препарат содержит в своем составе глицерин, масло тридекан, углерод технический в качестве фотопротектора, в качестве ПАВ - Слан 60 и неонол, а также отдушку. Титр штамма ВКПМ №6306 при культивировании на дрожжеполисахаридной среде при 30°С через 48 ч составляет 3,4 млрд спор/мл, однако при этом иногда наблюдается спонтанный выход фага. Препарат рекомендуется применять против личинок 1-2 возраста. Недостатком «Колорадо» является сравнительно низкая эффективность, приводящая к высоким нормам расхода: 4-5 кг/га.

Известно изобретение «Штамм Bacillus thuringiensis - продуцент эндотоксина против жесткокрылых насекомых и способ его культивирования» по патенту №2108384, заявка №95111008 с приоритетом от 27.06.1995 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 10.04.1998 г.

В патенте описан штамм бактерий Bacillus thuringiensis 16931, который выделен из озимой совки и депонирован в ВКПМ под № В-6649. Показано, что этот штамм эффективен против жесткокрылых насекомых, в т.ч. против колорадского жука. При воздействии разведенной в 10 раз культуральной жидкости на личинок колорадского жука 1-2 возраста наблюдается их 100% гибель.

Известно изобретение «Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 в качестве средства для получения энтомоцидного биопрепарата» по патенту №2514211, заявка 2012143320 с приоритетом от 10.10.2012 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 27.04.2014 г.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH₁ 800/15) выделен из трупов личинок колорадского жука и депонирован в ВКСМ ГНУ ВНИСХМ под per. №611. В патенте описан пример получения препарата жидкой формы, созданного на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксин), который обладает энтомоцидной активностью против - насекомых-фитофагов.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora» по патенту №2347809, заявка 2007132825 с приоритетом от 31.08.2007 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 27.02.2009 г.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis получен путем аналитической селекции из материала, выделенного из природных образцов и депонирован под номером ВКПМ В-9790. Штамм обладает инсектицидной и фунгицидной активностью против личинок колорадского жука, большого мучного хрущака, щавелевого и калинового листоедов, а также способностью подавлять вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora spp.carotovora.

Известно изобретение «Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis №25 в качестве средства комплексного воздействия на вредных жесткокрылых насекомых и фитопатогенные грибы» по патенту №2514023, заявка 2012156501, с приоритетом от 25.11.2012 г., МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликовано 27.04.2014 г. (прототип).

Штамм Bacillus thuringiensis Н₁₀ №25 (BtH₁₀ №25) выделен из трупов колорадского жука и депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под per. номером RCAM 01490 В патенте приведен пример получения препарата на основе этого штамма (Бациколин), обладающего энтомоцидными свойствами против вредных жесткокрылых насекомых и антифунгальной активностью против фитопатогенных грибов.

Задачей изобретения является выявление нового штамма на основе экологически безопасной бактерии из группы Bacillus thuringiensis, пригодного для использования в сельском хозяйстве и обладающего полифункциональными свойствами: энтомоцидной активностью в отношении разных видов массовых вредоносных жесткокрылых насекомых, антифунгальной активностью против фитопатогенных грибов и ростостимулирующим действием на растения.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве полифункционального средства для сельского хозяйства, обладающего энтомоцидной, антифунгальной активностью и ростостимулирующими свойствами, используют новый штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56.

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 был выделен из трупов колорадского жука в Ленинградской области с последующей многоступенчатой селекцией в результате анализа физиологических и хозяйственно - ценных свойств штамма в ряде генераций по этапам:

- рассев культуры на твердые питательные среды (МПА, РА);

- изучение морфологии колоний;

- микроскопический анализ культуры с учетом образования кристаллов эндотоксина и спор (оптимальное соотношение 1:1);

- оценка на экзотоксиногенность для BtH₁₀ (тест - объект Musca domestica);

- оценка на энтомоцидную активность (тест - объект личинки 2-го возраста колорадского жука).

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56) депонирован 01.12.2017 г. В Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) ФАНО ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 04725, что подтверждается справкой о депонировании от 04.12.2017 г. (справка прилагается).

Морфологические признаки и физиолого-биохимические свойства изучали стандартно. Предварительную идентификацию бактерий проводили по Определителю Берги. Штамм BtH₁₀ 56 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства.

Вегетативные клетки грамположительные, палочковидной формы, размером (1,2-1,5)×(2,5-4,5) мкм, единичные с перитрихиальным типом жгутикования. Образуют наряду со спорой параспоральный кристалл тетрагональной, бипирамидальной или овоидной формы размером (0,2-0,6)×(0,3-0,8) мкм по длине края. Споры овальные, субтерминальные размером (0,6-0,8)×(1,4-1,6) мкм. В клетке образуется одна спора и один кристалл эндотоксина. В рыбном бульоне (РБ) рост хороший, образует пленку. При выращивании штамма на рыбном агаре (РА) через 48 ч при 28-30°С образует колонии плоские, шероховатые серовато-белого цвета неправильной округлой формы, непрозрачные. Диаметр колоний 8-10 мм. На ломтиках картофеля рост умеренный серовато-зеленого цвета. При культивировании в жидких питательных средах штамм растет при температуре 20-36°С (оптимум 28-32°С) и при показателе кислотности среды рН 6,2-9,0 (оптимум 6,8-7,2) при скорости вращения на качалке 220 об/мин. Образование спор и кристаллов эндотоксина заканчивается через 60-72 часа роста.

Биохимические свойства.

Факультативный анаэроб.

Хорошо развивается на средах, содержащих органический азот: пептон, гидролизат казеина, рыбный бульон, кормовые дрожжи.

Из глюкозы, мальтозы, целлобиозы образует кислоту, но не газ. Не усваивает галактозу, арабинозу, маннозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, маннит, сорбит, дульцит, инозит, инулин.

Гидролизует эскулин и крахмал, салицин не расщепляет, цитрат натрия не использует в качестве единственного источника углерода. Образует амилазу, протеиназу, каталазу и нитратредуктазу. Не образует лецитиназу, уреазу, лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, индол и сероводород.

Пигмента не образует.

Штамм продуцирует водорастворимый термостабильный экзотоксин.

Антигенные свойства.

Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (идентифицирован по этой реакции и по классификации Bacillus thuringiensis (1990) H.de Barjack. По серологическим свойствам относится к 10 серотипу Bacillus thuringiensis.

Штамм устойчив к основным производственным фагам: М, К, Э-5, Д₂-Д₅.

По показателям вирулентности, токсичности и токсигенности штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56) не патогенен для теплокровных животных, относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Штамм хранится на агаровых питательных средах: на мясопептонном (МПА), рыбном агаре (РА) в пробирках под вазелиновым маслом, в кристаллах натрия хлорида, методом криоконсервации при температуре минус 80°С.

В процессе исследований было установлено, что для культивирования штамма BtH₁₀ 56 могут быть использованы различные источники азота: соевая, ячменная, гороховая, овсяная мука. При этом обеспечивается продуктивность в пределах (2,7-4,4)⋅10⁹ спор/мл культуральной жидкости, оптимальные показатели получены при использовании гороховой и соевой муки (4,1-4,35)⋅10⁹ спор/мл.

Выявлено, что штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56) обладает выраженными энтомоцидными свойствами против жесткокрылых насекомых-фитофагов, антифунгальными свойствами против фитопа-тогенных грибов и оказывает ростостимулирующее действие на растения.

При этом штамм BtH₁₀ 56 обладает энтомоцидным действием в отношении широкого круга вредителей-фитофагов (колорадского жука, картофельной коровки, крестоцветных блошек, листоедов, долгоносиков), обитающих на различных сельскохозяйственных культурах (овощные, зерновые и ягодные). Он проявляет эффективность против фитопатогенов на ряде культур в различных зонах и при различных технологиях выращивания (в том числе, против серой гнили на землянике, фузариозного увядания томатов, льна, ризоктониоза на картофеле. Штамм стимулирует всхожесть семян (например, капусты, томата, огурцов, кабачков, свеклы).

Ниже приведен пример получения биопрепарата с полифункциональными свойствами на основе штамма BtH₁₀ 56, названого авторами Энтобакт.

Сначала в колбах (1 л) готовят дрожжеполисахаридную питательную среду следующего состава, мас. %: Мука соевая - 2,5; крахмал кукурузный - 2,5; дрожжи кормовые - 0,5; К₂HPO₄ - 0,3; MgSO₄×7H₂O - 0,02; СаС1₂×2H₂O - 0,1; остальное (до 100) - вода. РН среды до стерилизации 7,4-7,8.

Подготовленную среду разливают в колбы Эрленмейера по 40-50 мл и стерилизуют в автоклаве при температуре +(120-125)°С в течение 40 минут. РН среды после стерилизации 6,8-7,2. Стерильную питательную среду охлаждают до 30-35°С и засевают культурой штамма из пробирки. Для чего в пробирку с культурой на скошенном рыбном агаре вносят 5-8 мл стерильной воды или физиологического раствора. Этой же пипеткой осторожно растирают культуру, взбалтывают до гомогенной суспензии и вносят в колбы по 0,2-0,5 мл. Культуру в колбах выращивают на качалке при скорости вращения 220-250 об/мин и температуре 28-30°С в течение 56-72 часов до полного высыпания спор и образования кристаллов эндотоксинов (проверку осуществляют микроскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма BtH₁₀ 56 используют для засева среды в ферментерах.

Для выращивания культуры в ферментере может быть использована любая питательная среда, оптимально - того же состава, который был использован для получения посевной культуральной жидкости в колбах Эрленмейера (состав указан выше). В ферментере любой емкости, заполненном на 25% водой, сначала растворяют соли, затем заваривают расчетное количество кукурузного крахмала при 80-85°С, охлаждают до 40°С, добавляют расчетное количество соевой муки, затем добавляют воду до 50% от объема ферментера и перемешивают с водой в течение 20 минут. Доводят рН среды до 8,0 с помощью 40% едкого натра (каустической соды) и стерилизуют при 1 атм в течение 1 часа, после чего охлаждают до 32-35°С.Перед внесением посевного материала из ферментера берут пробу среды для контроля стерильности. При просмотре под микроскопом в поле зрения не должно быть наличия микроорганизмов.

После этого в питательную среду в ферментере вносят 1-2% культуральной жидкости из колб Эрленмейера.

Процесс выращивания культуры в ферментере ведут при температуре 28-30°С, непрерывном перемешивании среды при помощи мешалки, при давлении в ферментере 0,2-0,4 атм и соответствующей аэрации:

до 3 час - только перемешивание;

с 3-12 час - 0,5V воздуха/V среды/мин;

с 12-42 час - 1,0V воздуха/V среды/мин;

с 42 час до окончания ферментации - 0,5V воздуха/V среды/мин.

То есть процесс ферментации проводят в условиях высокой аэрации и заканчивают при достижении соотношения 1:1 количества свободных спор и кристаллов эндотоксина при общем их количестве 70-80% от общего количества включений. Титр спор определяют общепринятым методом серийных разведений. При этом титр спор штамма BtH₁₀ 56 в полученном препарате составляет не менее (2,8-4,2)⋅10⁹ спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры и вирулентного фага.

Таким образом был получен биопрепарат Энтобакт на основе штамма бактерий BtH₁₀ 56, представляющий собой жидкость, легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения серийной опрыскивающей аппаратуры. Технология его производства не требует больших энергозатрат, необходимых для сушки при получении препаратов сухой формы.

Энтомоцидные свойства штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56) против жесткокрылых насекомых-фитофагов подтверждают следующие опыты.

Были проведены лабораторные испытания энтомоцидной эффективности препарата на основе штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт) по отношению к массовым насекомым-фитофагам сельскохозяйственных культур: к личинкам колорадского жука и картофельной коровки 2-го возраста (L₂). При этом корм (листья картофеля) обрабатывали водной суспензией штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт) в концентрациях 5,0, 1,0 и 0,2%. В каждый вариант опыта сажали по 25 личинок колорадского жука или картофельной коровки 2-го возраста (в четырехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях при тех же концентрациях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25 (Бациколин) и препарат штамма-аналога BtH₁ №800/15 (Битоксин). Учет гибели личинок колорадского жука и картофельной коровки проводили на 7 день.

Содержание экзотоксина в препарате определяли на личинках комнатной мухи по следующей методике.

Препарат на основе штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт) в количестве 20 мл центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Полученный фугат автоклавировали при давлении 0,1 МПа и температуре 105°С в течение 20 мин. Затем готовили разведения препарата: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32, что соответствует концентрациям 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкл/г корма. Каждую концентрацию испытывали в четырех параллельных определениях.

Для испытаний в стеклянную банку объемом 200 мл вносили: 2 мл препарата на основе штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт) соответствующего разведения; 11 мл 2,5% - водной суспензии сухого молока; 7 г стерилизованных пшеничных отрубей. В контрольном опыте в банки вместо разведенного препарата вносили 2 мл стерильной воды. Корм с соответствующими разведениями препарата в каждой банке тщательно перемешивали и помещали туда по 25 личинок комнатной мухи, отверстия банок завязывали бязью и содержали в термостате при температуре (28±1)°С и относительной влажности 70-85%). На 5-е сутки выбирали пупарии и оставляли в тех же условиях до вылета мух.

Для сравнения в опытах при тех же условиях и при тех же концентрациях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25 (Бациколин) и препарат на основе штамма-аналога BtH₁ №800/15 (Битоксин).

Активность экзотоксина оценивали по числу погибших на 8 день мух с поправкой на гибель в контроле определяли по формуле:

Х=(К-В)/К×100, где

К - количество мух, вылетевших в контроле; В - количество мух, вылетевших в опыте.

По результатам указанных выше лабораторных опытов для каждого случая был определен показатель ЛК₅₀ - доза препарата (в %, в мкл/г корма, в кг, в мл и пр.), которая вызывает 50% гибели насекомых.

Значение ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (см., например, [5]):

Lg ЛК₅₀=lg C_м-δ(ΣL₁-0,5),

где: C_м - максимальная из испытанных концентраций;

σ - логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведений);

ΣL₁ - сумма отношений числа насекомых, которые погибли от данной концентрации, к общему числу насекомых, которые подверглись действию этой концентрации.

Значения ЛК₅₀ для препаратов на основе: штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт), а также штамма-прототипа BtH₁₀ №25 (Бациколин) и штамма-аналога BtH₁ №800/15 (Битоксин), характеризующие их биологическую (энтомоцидную) активность, представлены в таблице 1.

Из результатов, представленных в таблице 1, следует, что препарат на основе штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт) по энтомоцидной активности (ЛК₅₀) в отношении личинок картофельной коровки в 1,5 и 1,6 раза активнее соответственно препаратов на основе штамма -прототипа BtH₁₀ №25 (Бациколин) и штамма-аналога BtH₁ №800/15 (Битоксин), а по содержанию экзотоксина он превосходит их в 1,3 раза. При этом значения энтомоцидной активности против личинок колорадского жука всех испытанных препаратов на основе штаммов Bt сопоставимы.

Были проведены также полевые мелкоделяночные опыты на картофеле против картофельной коровки Henosepilachna vigintictomaculate Motch в Приморском крае, Уссурийского района в зоне подзолистых почв. Посевы картофеля, заселенные картофельной коровкой с соотношением личинок по возрастам: L₁=35,7%; L₂=62,4%; L₅=l,9%, обрабатывали жидким препаратом Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56, полученным описанным выше в Примере способом. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препараты Бациколин на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25 и Битоксин на основе штамма-аналога BtH₁ №800/15. Среднее значение личинок картофельной коровки на 25-ти кустах учитывали до обработки, а также на 5-й и 10-й дни после обработки. Обработку выполняли ручным опрыскивателем, доза препарата 15 л/га, расход рабочей жидкости 400 л/га. Результаты полевых опытов приведены в таблице 2.

Данные результатов, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой эффективности препарата на основе штамма BtH₁₀ 56 (Энтобакт) против картофельной коровки в полевых опытах. Его эффективность на 15 и 16% выше эффективности препаратов на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25 (Бациколин) и препарата на основе штамма-аналога BtH₁ №800/15 (Битоксин) соответственно. При этом прибавка урожая при обработке препаратом Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56 была выше на 21,7 и 26,7%, чем при обработке препаратами Бациколин и Битоксин соответственно.

Были проведены полевые опыты по исследованию энтомоцидной эффективности препарата Энтобакт, полученного на основе штамма BtH₁₀ 56 указанным выше в Примере способом, на различных культурах против различных видов насекомых - фитофагов.

Обработку расположенных в разных регионах страны участков (Ленинградская обл., Ставропольский и Приморский края), занятых культурами, проводили опрыскиванием, используя ручной опрыскиватель. Доза расхода препарата была в пределах 12-20 л/га. Расход рабочей жидкости составлял 300-400 л/га. При этом, в зависимости от вида сельскохозяйственной культуры и основного вида насекомых - фитофагов на ней, расход препарата составил: на капусте против белянок, на малине против малинного клеща, на зерновых против злаковой пьявицы и на цветочных культурах в теплицах (розе, гвоздике, хризантеме) против трипсов: 12, 15, 20 и 20 л/га соответственно. Заселенность культур вредителями учитывали до обработки, а также на 10-е сутки после обработки, вычисляя % их гибели и определяя таким образом биологическую активность препарата Энтобакт, полученного на основе штамма BtH₁₀ 56. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о высокой энтомоцидной активности препарата на основе штамма BtH₁₀ 56 против различных видов насекомых - фитофагов на различных сельскохозяйственных и цветочных культурах.

Опытным путем были выявлены антифунгальные свойства штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56) по отношению к различным фитопатогенным грибам, возбуждающим болезни растений, в частности: Bipolaris sorokiniana (гельминтоспориоз или темнобурая пятнистость) - на зерновых (пшенице, ячмене, ржи); Rhizoctonia solani Kuhn (ризоктониоз) - на картофеле; Botrytis cinerea Pers (серая гниль) - на ягодниках (землянике, малине, смородине, крыжовнике); Pythium spp. (питиозная корневая гниль) - на зерновых, горохе, свекле.

Антифунгальную активность штамма BtH₁₀ 56 против различных фитопатогенных грибов определяли методом агаровых блоков в чашках Петри [6] Препарат на основе штамма BtH₁₀ 56, полученный указанным выше в Примере способом, вносили в расплавленную и охлажденную до 40°С среду Чапека. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Для сравнения в опытах при тех же условиях и при тех же концентрациях использовали препараты на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25 (Бациколин) и штамма-аналога BtH₁ №800/15 (Битоксин).

Диаметр колоний гриба измеряли через 3 суток. Ингибирующую активность рассчитывали по формуле:

Х=(Д_к-Д_о)/Д_к×100, где

X - степень ингибирования роста колоний гриба, см;

Д_к и Д_о - диаметр колоний гриба в контроле и опыте соответственно.

Результаты опытов представлены в таблице 4.

Из результатов, представленных в таблице 4 следует, что антифунгальный эффект препарата Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56 на 14-18% выше, чем препарата Бациколин на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 25, и в несколько раз превосходит эффект от препарата Битоксин на основе штамма BtH₁ №800/15 по всем представленным видам фитопатогенов. При этом 100% эффект инги-бирования роста гриба возникает при действии препаратов Энтобакт и Бациколин на гриб Botrytis cinerea Pers - возбудителя серой гнили на ягодниках.

Опытным путем было также установлено ростостимулирующее свойство штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56).

Способность штамма BtH₁₀ 56 оказывать на растения ростостимулирующее действие исследовали в лабораторных опытах. Семена сельскохозяйственных растений: салата, огурца, кабачка, тыквы, перед посевом замачивали на 3 часа в препарате Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56, полученном описанным выше в Примере способом, а также для сравнения - замачивали в препарате Бациколин на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25, а в контроле - в воде. После замачивания семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги при температуре 26°С и влажности 86%. Через 5 дней учитывали всхожесть семян, а через 3 недели контролировали длину ростков и корней.

Результаты опытов представлены в таблице 5.

Результаты испытаний, представленные в таблице 5, показали, что препарат Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56 стимулирует всхожесть семян, рост проростков и корней растений, что подтверждает ростостимулирующие свойства штамма BtH₁₀ 56. При этом ростостимулирующая активность нового штамма BtH₁₀ 56 на 5-22% больше, чем у штамма-прототипа BtH₁₀ №25.

Были проведены также полевые опыты по исследованию способности штамма BtH₁₀ 56 оказывать ростостимулирующее действие на растения (ботву) и урожайность картофеля.

Опыты проводили путем предпосевного замачивании клубней картофеля для посадки в препарате Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56, полученного способом, описанным выше в Примере, а также для сравнения замачивали в препарате Бациколин на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25, а в контроле - в воде. После замачивания посевные клубни сажали в землю и выращивали обычным методом. Через 1,5 месяца после посадки срезали картофельную ботву, измеряли количество и высоту стеблей, вес растений, а также определяли полученный урожай картофеля.

Результаты полевых опытов приведены в таблице 6.

Результаты опытов, приведенные в таблице 6, свидетельствуют о росто-стимулирующем влиянии препарата Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56 на ботву и урожайность картофеля при замачивании в нем посевных клубней. При этом вес растений, высота стеблей и урожай при предпосевной обработке клубней препаратом Энтобакт выше на 19,4; 17; 16% соответствующих показателей при замачивании препаратом Бациколин на основе штамма-прототипа BtH₁₀ №25. Контрольный вариант при предпосевном замачивании клубней в воде уступает препарату Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56, соответственно, на 27, 23 и 22%.

Таким образом, штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56), кроме выраженной энтомоцидной активности в отношении широкой группы массовых вредоносных видов насекомых, обладает высокой антифунгальной активностью против различных фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, а также ростостимулирующим действием на растения, то есть обладает полифункциональными свойствами.

Кроме того, были проведены лабораторные опыты по определению сохранения титра спор штамма BtH₁₀ 56 и содержанию экзотоксина в препарате Энтобакт через 6 месяцев хранения при различных плюсовых температурах: 5, 15, 25, 30°С без консервирующих добавок в контроле и с добавкой в виде 0,5% цитрата натрия (Na₃C₆H₅O₇) или 10% хлористого натрия (NaCl) в качестве консерванта. Исходные значения: титр спор штамма BtH₁₀ 56 - 3,5⋅10⁹/мл, а содержание экзотоксина, которое оценивалось через показатель ЛК₅₀ для L₂ комнатной мухи, - 3,21 мкл/г корма.

Результаты опыта представлены в таблице 7.

Из приведенных в таблице 7 данных следует, что при хранении препарата на основе штамма BtH₁₀ 56 в течение 6 мес.при температурах +(5-15)°С, с консервирующей добавкой или без нее, его титр спор составил 97,1-92,2%) от исходного значения, т.е. снизился незначительно; и только при высоких температурах хранения +(25-30)°С он снизился на 12-17,2% по сравнению с исходным.

При этом уровень содержания экзотоксина, определенный через показатель ЛК50, во всех вариантах опыта остался высоким - в пределах 3,35-3,71 мкл/г корма по сравнению с исходным - 3,21 мкл/г корма.

Результаты описанных опытов показывают, что препарат Энтобакт на основе штамма BtH₁₀ 56 может храниться при различных плюсовых температурах от 5°С до 30°С не менее 6 месяцев, в значительной мере сохраняя свою биологическую активность.

По показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis №56 (BtH₁₀ 56) не патогенен для теплокровных животных и в соответствии с «Методическими указаниями…» №2620-82 и №4263-87, штамм BtH₁₀ 56 относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам. Результаты по безопасности данного биопрепарата согласуются с мировой практикой широкого использования биоинсектицидов на основе штаммов бактерий группы Bacillus thuringiensis.

Таким образом, опытным путем было установлено, что новый выявленный штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH₁₀ 56) обладает одновременно высокой энтомоцидной активностью в отношении широкой группы массовых вредоносных видов насекомых - фитофагов, высокой антифунгальной активностью против различных фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и ростостимулирующим действием на растения, т.е. является эффективным полифункциональным средством для использования в растениеводстве сельского хозяйства.

Кроме того, новый штамм BtH₁₀ 56 и биопрепараты, полученные на его основе, расширяют арсенал подобных средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. Санкт-Петербург, Пушкин, 2009, 245 с.

2. Богданов-Патьков Н.Н. Колорадский картофельный жук Septinatarsa desemlineata say и его карантинное значение. Л. Тип. «Печ. Двор», 1947, 200 с.

3. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. Перевод с нем. М., Мир, 1995, 114 с.

4. Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Изучение действия биопрепаратов на основе Bacillus thuringiensis на фитопатогенные грибы. Вестник защиты растений, №1, 2010, с. 27-35.

5. Патыка В.Ф., Патыка Т.И., Экология Bacillus thuringiensis, Киев, изд. ПГАА, 2007 г., 217 стр.

6. Методы экспериментальной микологии, под редакцией Билай В.И., Киев, изд. «Наукова думка», 1982 г., 552 с.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой щтамм бактерий p. Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56, депонированный под номером RCAM 04725, в качестве средства для защиты растений от насекомых-вредителей и грибных болезней, а также стимулирования их роста. Заявленный штамм является эффективным полифункциональным средством для использования в растениеводстве сельского хозяйства. Кроме того, новый штамм BtH₁₀ 56 и биопрепараты, полученные на его основе, расширяют арсенал подобных средств. 7 табл.

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56, депонированный в ФАНО ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 04725, в качестве полифункционального средства для растениеводства, обладающего энтомоцидной, антифунгальной активностью и ростостимулирующими свойствами.