ИНСЕКТИЦИДНЫЙ ПРЕПАРАТ "КОЛОРАДО" ПРОТИВ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ И ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1997 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству бактериальных средств защиты растений. Изобретение может быть использовано для создания биоинсектицида для борьбы с жесткокрылыми насекомыми вредителями пасленовых культур, вредителями однодольных культур, вредителями запасов.

Интенсификация сельского хозяйства обусловила необходимость применения биологических средств защиты растений от вредных насекомых, уничтожающих до 30% урожая. К наиболее опасным насекомым относятся жесткокрылые насекомые, в частности колорадский жук, который поражает картофель, баклажаны, томаты, пьявица вредитель пшеницы, ячменя, ржи, риса, овса. Для борьбы с жесткокрылыми насекомыми используются, в основном, химические инсектициды, они достаточно эффективны, но не обладают специфичностью, загрязняют окружающую среду, накапливаются в почве, воздухе, воде. В качестве альтернативных используются биологические инсектициды "Битоксибациллин", "Боверин" [1, 2] Однако препарат "Боверин" на основе грибного штамма-продуцента малоэффективен и для достижения экономически обоснованного снижения численности вредителя требуются добавки химических инсектицидов. Действующим началом бактериального препарата "Битоксибациллина" является термостабильный экзотоксин, не обладающий специфичностью и поражающий также нецелевых насекомых, в том числе и полезных, и, кроме того, не являющийся экологически безопасным. Использование штаммов, содержащих экзотоксин, в ряде случаев нецелесообразно и экологически небезопасно из-за того, что он трудно разлагается в почве и способен аккумулироваться в окружающей среде.

В настоящее время в мире зарегистрирован биоинсектицид "Новодор" (Дания) [3] в качестве штамма продуцента использован Bac. thuringiensis var. tenebrionis, синтезирующий белковый эндотоксин, специфически активный против жесткокрылых насекомых. Аналогов данному препарату в Российской Федерации и странах СНГ нет.

На территории бывшего СССР биоинсектициды производились в виде смачивающегося порошка, обладали рядом недостатков, среди которых неоднородность морфометрического состава частиц, плохая растворимость и нестабильность рабочих суспензий, недостаточная растекаемость и смачиваемость поверхности листьев.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к предлагаемому изобретению является способ с использованием штамма Bacillus thuringiensis supsp. tenebrionis DSM 2803 [4, 5] синтезирующего кристаллический белковый эндотоксин, обладающий летальным действием против колорадского жука [6] Однако по некоторым основным технологическим характеристикам, таким как время ферментации, способность к росту в обедненной среде, уровень спонтанной индукции фага, штамм-прототип DSM 2803 обладает существенными недостатками, в частности длительным временем культивации (72 часа). Кроме того, при получении токсического материала используется дорогая многокомпонентная среда. Для штамма-прототипа характерен спорадический лизис культуры в жидкой и на плотной питательной среде в результате спонтанной индукции фага.

Цель настоящего патента получение штамма-продуцента биоинсектицида, обладающего высокими технологическими характеристиками, и создание на его основе препарата, обеспечивающего эффективную защиту от вредных жесткокрылых насекомых.

Эта цель достигается использованием в качестве продуцента штамма Bacillus thuringiensis H8 ВНИИгенетика 16-816 (ВКПМ B-6306), синтезирующего белковый кристаллический эндотоксин, летальный для широкого круга жесткокрылых насекомых колорадского жука, щавелевого листоеда, пьявицы красногрудой.

Заявляемый штамм имеет следующие характеристики:
1. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки, размером 1,2 1,6 x 2,5 3,0 мкм. Образуют споры и кристаллические включения в основном квадратной формы. На агаризованных средах через 24 часа роста при 30^oC образует колонии размером 3 4 мм с гладкой поверхностью.

При культивировании в жидких питательных средах при аэрации штамм растет равномерно по всему объему.

При росте в богатых питательных средах -дрожже-полисахаридная (ДПС), дрожжевая споро- и кристаллообразование завершаются к 46-48 часу культивирования при 30^oC. Титр термоустойчивых спор при культивировании в среде ДПС 3 4 млрд. спор /мл, при росте в дрожжевой среде 1,5 2,3 млн. спор/мл. При культивировании наблюдается крайней редкий спонтанный выход фага.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм 16-816 не сбраживает маннозу, салицин, эскулинн; лецитиназу не образует; гидролизует крахмал; сахарозу сбраживает. Штамм усваивает ионы аммония и глутаминовую кислоту. Режим культивирования 28 34^oC, оптимум роста- 30^oC. Значения pH питательной среды для оптимального культивирования 6,8 7,0.

Штамм термостабильный экзотокин не синтезирует.

3. Генетические характеристики.

В клетках штамма 16-816 содержатся экстрахромосомальные элементы (плазмиды) с молекулярными массами (в кв): 60, 40 и 10.

Генетические детерминанты токсинообразования локализованы на плазмиде с мол. весом 6 кв.

Штамм устойчив к пенициллину 100 мкг/мл, полимиксину -100 мкг/мл.

Кристаллы штамма состоят из белков с молекулярными массами- 73, 68 и 65 кДа (возможно, два последних белка являются продуктами распада белка 73 кДа).

4. Инсектицидные свойства.

Штамм высоко активен против жесткокрылых насекомых, в частности против колорадского жука. Инсектицидная активность связана с кристаллическим белковым эндотоксином. Молекулярная масса белкового токсина составляет 73 кДа. Жидкая суспензия, содержащая 10 100 грамм токсического белка на гектар, эффективна для контроля численности личинок колорадского жука I-II возраста.

Бионсектицид на основе штамма Bacillus thuringiensis Н8 ВНИИ генетика 16-816 различной препаративной формы далее будут именоваться "Колорадо".

5. Способ получения штамма.

Штамм получен методом многоступенчатой селекции.

Пример 1.

Способ ферментации, концентрирования и получения различных препаративных форм бионсектицида "Колорадо".

Для культивирования продуцента используют ферментер вместимостью 300 л. Ферментационную среду готовят, используя питьевую воду. Компоненты среды берутся в расчете на объем среды 150 л.

Состав среды, г/л:
1. Кормовые дрожжи (эприн) 15
2. Хлористый кальций 0,1
3. Калий фосфорнокислый однозамещенный 27
4. Гидрат окиси калия 6
5. Пропинол Б -400 1
Для приготовления среды в ферментер заливают 125 135 л воды и при включенной мешалке загружают вышеуказанные компоненты. После перемешивания в течение 15 20 мин объем среды в аппарате доводят водой до 150 л. Величина pH среды перед стерилизацией должна составлять 6,5 7,2. Далее нагревают среду до (123 + 1)^oC глухим и острым паром и стерилизуют при этой температуре среду и одновременно ферментер в течение 1 ч при включенной мешалке, поддерживая в рубашке давление 1,5 1,7 ати, в аппарате 1,2 1,4 ати.

Засев среды производят в асептических условиях через посевной бачок. После засева отбирают пробу среды для контроля концентрации спор и отсутствия посторонней микрофлоры. Температура поддерживается в аппарате автоматически при помощи системы терморегулирования. Каждые 8 12 ч (а также по мере необходимости) из аппарата отбирают пробу КЖ для микробиологического контроля (состояние культуры, полнота споро- и кристаллообразования и т.д.), а также контроля pH. Начиная с 24 ч роста одновременно образуется споры и кристаллы, причем их соотношение составляет 1: 1; контроль за процессом споро- и кристаллообразования производят светооптическим методом.

Продолжительность ферментации 48-56 ч. Процесс оканчивают, когда 50-60% клеток завершило стадию спорообразования, при этом количество аспорогенных клеток в поле зрения при микроскопировании не должно превышать 10%
Концентрация жизнеспособных спор в КЖ, получаемой в результате ферментации, составляет не менее 1,6 млн спор/мл. По окончании процесса ферментации КЖ в ферментере охлаждают, продолжая перемешивание и аэрацию, до 18-20^oC путем подачи воды в рубашку; после чего начинают подачу КЖ на концентрирование. Концентрирование производят одним из известных способов - сепарирование, центрифугирование, мембранная фильтрация, распылительная сушка.

Содержание токсического белка в концентрате должно составлять 40 100 мг/г (40 100 грамм/кг).

Концентрат можно использовать для получения инсектицидного препарата различных модификаций.

Пастообразный препарат с эмульсионной структурной на основе штамма 16-816, использованного в настоящем патенте, содержит следующие ингредиенты мас.

концентрат КЖ вышеупомянутого штамма 50 -55
глицерин 8 10
масло тридекан 20 30
углерод технический 0,2 0,7
спан-60 и неонол 6 8
амбреин 0,1 0,2
Как структурообразователь используется смесь полиспиртов (моно-, ди-, полиглицириды, поливиниловые спирты) с поверхностно-активными веществами в соотношении от 0,5 3:1. В качестве поверхностно-активных веществ используются неионогенные ПАВ, такие как неонол, твины и т.п. или их смесь, а в качестве отдушки применяется амбреин или синтетические душистые вещества.

Пастообразный инсектицид получают введением в концентрат 0,3% углерода технического, а на стадии получения готовой формы концентрат растворяют в смеси минерального масла с ПАВ, а затем при перемешивании вводят небольшими порциями в водный раствор структурообразователя, а затем после получения однородной массы в полученную эмульсию вводят отдушку.

В ходе проведения процесса по указанной схеме введение в КЖ перед сушкой углерода технического позволяет создать в сгущенной жидкости центры первичного структурообразования ингредиентов, что ведет к образованию в биомассе волокнистой структуры, препятствующей слипанию клеток и обеспечивающей более равномерное нагревание клеток, исключая благодаря этому возможность температурной флуктуации. В дальнейшем при использовании готового препарата сажа играет роль фотопротектора.

Полученные в результате сушки "волоконца" под действием растворенного в масле ПАВ разделяются, образуя взвесь, аналогичную дисперсии полимера в растворителе.

При попадании в водный раствор под действием комплексов полиспиртов с ПАВ на границе раздела масло-жидкость происходит переход линейных полимеров в сетчатые, что позволяет создать защитную оболочку вокруг находящихся в масляной фазе спор, обеспечивающих их защиту от факторов внешней среды.

Полученный препарат по своим эксплуатационным характеристикам обладал активностью, не уступающей химическим инсектицидам, экологически безопасный, на 30 40% устойчивее к внешней среде, чем битоксибациллин, обладал хорошей прилипаемостью, а также приятным запахом.

Препарат и технология его получения в просмотренной литературе не описаны. Это в сочетании с вышеизложенными схемой процесса и достигнутыми преимуществами позволяют сделать вывод о соответствии изобретения критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень".

Полученный препарат представляет собой пасту серого цвета с приятным запахом и хорошей растворимостью в воде (не более 30 сек); 1%-водные суспензии препарата достаточно стабильны.

Препараты в форме смачивающихся порошков содержат 5 10% кристаллов штамма 16-816, 25 40% остатков ферментационной среды, каолин или хлористый натрий до 35 50%
Пример 2.

Испытание штамма Bac. thuringiensis Н-8 Вниигенетика 16-816 на колорадском жуке в лабораторных условиях.

Листья картофеля замачивали в различных разведениях культурной жидкости штамма 16-816 (после роста при 30^oC 48 час в среде ДПС). После подсушивания листья переносили в чашки Петри и помещали по 10 личинок колорадского жука I II возраста. Каждое разведение испытывали в трех повторностях. Чашки инкубировали при 22^oC 3 дня. Результаты представлены в таблице N 1.

Пример 3.

Испытание штамма Bac.thuringiensis ВНИИгенетика 16-816 на пьявице красногрудой в лабораторных условиях.

Листья ячменя замачивали в различных разведениях культуральной жидкости штамма 16-816. После подсушивания листья переносили в чашки Петри и на них помещали по 10 личинок пьявицы младших возрастов. Каждое разведение испытывали в трех повторностях. Чашки инкубировали при 22^oC 3 5 дня. Результаты представлены в таблице N 2.

Пример 4.

Испытание препарата "Колорадо" на колорадском жуке в лабораторных условиях.

Ботву картофеля общей площадью 10 кв. см обрабатывали различными концентрациями препарата. Готовили водную суспензию "Колорадо" и соответственно разводили. Листья контрольного варианта обрабатывали водой. Обработанные листья помещали в чашки Петри. В каждую чашку на обработанные листья помещали по 15 личинок I возраста. На каждое разведение использовали 3 чашки по 15 насекомых. Чашки помещали в климатокамеру при 25+1^oC и 18-часовом фотопериоде. Опыт учитывали через 72 часа. Результаты представлены в таблице N 3.

Пример 5.

Полевые испытания препарата "Колорадо" на картофеле в условиях Подмосковья.

В условиях опытного хозяйства в Подмосковье на площади в 0,25 га испытывали различные концентрации "Колорадо" против личинок колорадского жука I II возраста на картофеле. Обработку проводили ручным опрыскиванием при норме расхода рабочей жидкости 500 л/га. Оценку проводили на 25 учетных растениях. В качестве дополнительных контролей использовали "Битоксибациллин" и химический инсектицид "Децис". Результаты представлены в таблице N 4.

Пример 6.

Полевые испытания препарата "Колорадо" на картофеле в условиях Белоруссии.

В условиях хозяйства в Белоруссии на участках по 1 га испытывали препарат "Колорадо" против личинок колорадского жука I II возраста на картофеле. Обработка проводилась тракторным опрыскивателем, расход рабочей жидкости 400 л/га. Результаты представлены в таблице N 5. В качестве дополнительного контроля использовали химический инсектицид "Карате".

Пример 7.

Испытание "Колорадо" против личинок колорадского жука на картофеле в условиях защищенного грунта.

В условиях защищенного грунта в опытном хозяйстве в Подмосковье испытывали "Колорадо" на личинках колорадского жука I II возраста. Обработку проводили ручным опрыскивателем, при расходе рабочей жидкости 500 л/га. Результаты представлены в таблице N 6.

Литература
1. Кандыбин Н.В. с соавт. Новые экзотосигенные штаммы Bacillus thuringiensis. В сб. Бактериальные средства и методы борьбы с вредными насекомыми и грызунами. Л. Колос, 1972, с. 20 23.

2. Лаппа Н.В. Гораль В.М. Способ получения энтомопатогенного препарата боверина. Авт. свид. СССР N 394424 (1973).

3. Rugh S. Use of a Coleopteran astive Bacillus thuringiensis for controlling the cereal leaf beetle Oulema melanopa. WO 91/14369.

4. Krieg V. A. at al. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a new pathotype effective against larvae of Coleoptera. Z. And. Entomol. 1983, 96 500 508.

5. Криг В.А. с соавт. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. tenebrionis для производства инсектицидного препарата против насекомых Coleopteran spp. Авт. свид. СССР N 14489995 A3.

6. Herrnstadt C. Wilcox E. Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles the order Coleopteran. US Patent N 4771131.

Использование: промышленная микробиология, в частности способы получения энтомопатогенных препаратов для борьбы с жесткокрылыми насекомыми. Сущность: изобретение заключается в создании штамма-продуцента Bacillus thuringiensis (ВКПМ B-6306), который синтезирует кристаллический белковый эндотоксин, обладающий высокой специфической активностью против жесткокрылых насекомых. А также - в создании биоинсектицида "Колорадо" на основе штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ B-6306. Препарат обладает высокой эффективностью против жесткокрылых насекомых, удобными эксплуатационными качествами, а также является экологически безопасным из-за отсутствия термостабильного экзотоксина. 2 с. п. ф-лы, 6 табл.

1. Инсектицидный препарат против жесткокрылых насекомых, включающий активное начало концентрат культуральной жидкости Bacillus thuringiensis и целевые добавки, отличающийся тем, что в качестве активного начала он содержит концентрат культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6306, а в качестве целевых добавок глицерин, масло тридекан, углерод технический, спан-60, неонол и дополнительно отдушку амбреин при следующем соотношении компонентов, мас.

Концентрат культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6306 50 55
Глицерин 8 10
Масло тридекан 20 30
Углерод технический 0,2 0,7
Спан-60 и неонол 6 8
Амбреин 0,1 0,2
2. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6306, используемый для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, в частности, против колорадского жука, пьявицы красногрудой и щавелевого листоеда.