17α-АЦЕТОКСИ-3β-ФЕНИЛПРОПИОНИЛОКСИ-6-МЕТИЛПРЕГНА-4,6-ДИЕН-20-ОН, ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕСТАГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2003 года по МПК C07J7/00 A61K31/57 A61K47/00 A61K9/20 A61P5/34 A61P15/06 

Изобретение относится к медицине, точнее к лекарственным средствам, предназначенным для сохранения беременности, и может найти применение в акушерской практике и гинекологии.

Известны высокоактивные гестагенные соединения, применяемые в акушерской практике, такие как и туринал (норстероид) [РЛС - Энциклопедия лекарств. Изд. 7 переработанное. Гл. редактор Ю.Ф. Крылов. - М.: "РЛС-2000", изд 2000 г. , стр. 942], ацетомепрегенол (прегнановый ряд соединений) [там же, стр. 116]. Последний принят за прототип.

В основу изобретения поставлена задача - расширение номенклатурного ряда препаратов, обладающих способностью сохранять беременность.

Новоесинтезированноевещество,представляющеесобой17α-Ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он формулы (I)

и лекарственное средство, активным началом которого является указанное вещество, позволяют решить поставленную задачу. В дальнейшем для заявленного вещества использовано сокращенное название - фенилпропионилокс.

Заявляемое вещество относится к ряду прегнана и содержит дополнительную метильную группу при углеродном атоме С-6, ацетоксигруппу при C-17 в α-конфигурации, фенилпропионилоксигруппу при С-3 в β-конфигурации и двойные связи в положениях 4, 5 и 6, 7.

Изобретение иллюстрируется чертежами, на которых представлено:
фиг. 1 - фотография гистологического препарата поперечного среза матки для определения влияния фенилпропионилокса в дозе 0,25 мг/кг на эндометрий у инфантильных кроликов, оцениваемого по шкале McPhail,
фиг. 2 - график зависимости индекса McPhail от вводимой дозы у неполовозрелых самок кроликов при энтеральном введении туринала и ацетомепрегенола,
фиг. 3 - график зависимости индекса McPhail от вводимой дозы у неполовозрелых самок кроликов при энтеральном введении фенилпропионилокса.

Соединение I представляет собой кристаллическое вещество белого или почти белого цвета, не растворимое в воде, легко растворимое в хлоруглеводородах (хлороформ, хлористый метилен), растворимое в ацетоне, бензоле, спирте, трудно растворимое в гексане и эфире. Структура соединения подтверждена элементарным анализом и спектральными данными.

Заявляемое соединение формулы I получено авторами из мегестрола ацетата II в две стадии: восстановлением боргидридом натрия в среде метанола, образовавшийся при этом 17α-ацетокси-3β-гидрокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он (III) ацилировали при действии хлорангидрида фенилпропионовой кислоты в среде бензола и пиридина. Схему синтеза заявленного соединения (I) см. в конце описания.

Для предотвращения побочных реакций: гидролиза ацетоксигруппы и восстановления карбонильной группы с образованием соединения IV используют небольшой избыток боргидрида натрия, реакцию проводят при охлаждении и при объемно-весовых соотношениях: 1 вес.ч. II, от 0,03 до 0,12 вес.ч. NaBHBH₄ и от 6 до 8 объемов метанола при 15-30^oС в течение 30 мин. Процесс восстановления протекает в суспензии, побочные продукты при этом образуются в следовых количествах (ТСХ-анализ). Стадию ацилирования проводят в соотношении: 1 вес. ч. III, 0,5-0,6 объема хлорангидрида фенилпропионовой кислоты, 0,7-1 объема пиридина, 5-8 объемов бензола.

Целевой продукт выделяют выливанием реакционного раствора в разбавленную соляную кислоту с последующим отделением бензольного слоя, промыванием его водой, фильтрацией бензольного раствора через слой окиси алюминия, упариванием и кристаллизацией продукта из метанола.

Примеры, иллюстрирующие способ получения заявленного соединения:
Получение 17α-ацетокси-3β-гидрокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он (III)
К суспензии 20 г мегестрола ацетата в 160 мл метанола, охлажденной до 12-14^oС, прибавляют порциями 2 г боргидрида натрия с такой скоростью, чтобы температура реакции оставалась в интервале 15-30^oС. После перемешивания в течение 30 мин приливают 140-150 мл воды, содержащей 4-5 мл концентрированной соляной кислоты. После 30-минутного перемешивания осадок отфильтровывают. Получают 19,2 г III с температурой плавления 195-203^oС, [α]20D

Получение17α-ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-она (1)
Смесь 19 г III, 150 мл бензола, 19 мл пиридина, 10 мл хлорангидрида фенилпропионовой кислоты перемешивают 20 часов при комнатной температуре. Реакционную массу медленно выливают в разбавленную соляную кислоту. Бензольный слой отделяют, водный экстрагируют бензолом. Объединенный бензольный раствор промывают водой и после концентрирования в вакууме фильтруют через слой окиси алюминия. Элюат упаривают в вакууме. Получают 18,6 г (73% от теор. ) I после кристаллизации из метанола, т. пл. 145-146^oС, [α]20D

Найдено С 76,27; Н 8,39 С₃₃Н₄₂O₅
Вычислено: С 76,41; Н 8,22.

УФ-спектр: λ_макс 240 нм, Е 21450;
ИК-спектр ν, см ^-1: 1705 и 1720 (С=O эфиров), 1250 (СО ацетата), 1270 (СО фенилпропионата), 1460.

ПМР-спектр (CDCl₃, δ м. д): 0,69 (с СН₃-18); 0,99 (с СН₃-19); 1,78 (с СН₃-6); 2,02 и 2,1 (с СОСН₃); 5,18; 5,14; 5,53 (м С₃-Н, С₄-Н, С₇-Н); 7,25 (м С₆H₅).

Другие свойства и характеристики заявленного вещества 17α-ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он формулы (I) были исследованы на подопытных животных. Исследования проводились в сравнении с известными и применяемыми на практике препаратами и приведены в примерах.

Пример 1. Определение гестагенной активности в тесте Клауберга Мак Фейла (Clauberg-McPhail)
Прогестагенную активность исследовали методом Клауберга-Мак Фейла на неполовозрелых кроликах самках. Сравниваемые вещества вводили в 4-6 дозах. Установлено, что фенилпропионилокс так же, как ацетомепрегенол и туринал, вызывает дозозависимое усиление секреторных процессов в эндометрии инфантильных крольчих. Степень секреторных изменений в эндометрии изучали на гистологических препаратах поперечных срезов матки под бинокулярной лупой. Согласно общепринятым стандартам при изучении гестагенной активности препаратов стадии секреции оценивают по шкале McPhail от 0 до 4 баллов:
- нулевая стадия секреции (0 баллов) - эндометрий и железы стромы компактны, эпителиальный слой слизистой оболочки матки непрерывный, изредка встречаются узкие железки,
- первая стадия секреции (1 балл) - отмечается развитие маточных желез, но они короткие, более глубокие слои стромы не изменены
- вторая стадия секреции (2 балла) - железы увеличиваются в размерах и количестве, строма не изменена, интенсивность окраски усиливается от более глубоких слоев к просвету
- третья стадия секреции (3 балла) железы проникают в более глубокие слои стромы, но они узкие, железистая ткань теряет способность концентроваться вокруг просвета
- четвертая стадия (4 балла) характеризуется сильным развитием маточных желез и нарушением эндометрия, железы проникают близко к миометрию, на срезах стромы соединительнотканые участки встречаются в эндометриальных полях.

При исследовании матки животных контрольной группы, получавших эстрогенную подготовку, отмечена гипертрофия мышечного слоя и эндометрия. Однако внутренняя поверхность матки остается гладкой, что соответствует нулевой стадии по шкале McPhail.

Как видно на фиг. 1, под воздействием фенилпропионилокса в эндометрии наблюдаются следующие изменения: слизистая оболочка матки содержит многочисленные железы, которые простираются через всю толщу эндометрия и проникают в глубокие слои стромы. Гестагенная активность препарата, вызывающего данные изменения в эндометрии инфантильных кроликов, определяется в 3-3,5 балла по шкале McPhail.

Графики, представленные на фиг.2 и фиг.3, характеризуют степень секреторной трансформации эндометрия. Как видно из графика на фиг.2, туринал в дозах 0,004, 0,016 мг/кг оказывал слабое действие на эндометрий, оцениваемое в 0,125 и 0,3 балла соответственно. Дальнейшее увеличение дозы вызывало активацию секреторных изменений эндометрия. В дозе 0,5 мг/кг туринал проявлял свою максимальную гестагенную активность, равную 3,1 балла. Дальнейшее увеличение дозы вводимого препарата не вызывало активации секреторных процессов в эндометрии, которые соответствовали эффекту, вызываемому меньшей дозой - 0,5 мг/кг. Из того же графика следует, что ацетомепрегенол проявлял сходную активность. В дозах 0,008-0,125 мг/кг их активность превосходила действие, оказываемое туриналом, а в дозах 0,25 мг/кг и 0,5 мг/кг устанавливалась на уровне, близком к эффекту, вызываемому туриналом в тех же дозах. Как видно из графика на фиг.3, в дозе 0,25 мг/кг фенилпропионилокс проявляет наиболее высокую гестагенную активность, соответствующую 3,2 баллам по шкале McPhail. При четырехкратном снижении дозы сохраняется выраженный гестагенный эффект данного соединения (2, 6 балла). В дозах менее 0,008 мг/кг активность препарата оценивали менее 1 балла. Экспериментальные данные обработаны методом регрессионного анализа, что позволило вычислить коэффициенты регрессии, на основе которых была определена биологическая активность фенилпропионилокса.

В таблице 1 приведена биологическая активность соединений, оцениваемая по ЕД₅₀. Эффективная доза (ЕД₅₀), при которой частота учитываемого фармакологического эффекта составляет 50%, соответствующая индексу McPhail, равному 2-м, для прогестерона составила 0,26 мг/кг, для туринала - 0,034 мг/кг, для ацетомепрегенола - 0,01 мг/кг, для фенилпропионилокса - 0,00926 мг/кг. Учитывая ЕД₅₀, для каждого соединения вычисляли относительную прогестагенную активность, принимая за единицу активность прогестерона.

Результаты вычисления показали, что фенилпропионилокс обладает высокой относительной гестагенной активностью, в 28,1 раз превышающей активность прогестерона (диаграмма). Относительная гестагенная активность туринала в тесте Клауберга-Мак Фейла в 7,7 раза превышает активность прогестерона. Ацетомепрегенол значительно превосходит активность туринала и в то же время несколько уступает фенилпропионилоксу, превышая активность прогестерона в 26 раз (табл. 1).

Пример 2. Определение гестагенной активности в тесте Корнера Аллена.

Изучение гестагенных ответов фенилпропионилокса было продолжено в опытах на овариэктомированных крольчихах по сохранению беременности в тесте Корнера Аллена. Согласно данному тесту половозрелых крольчих через 18 часов после спаривания подвергали операции двухсторонней овариэктомии (под наркозом). Фенилпропионилокс в виде масляного раствора вводили внутримышечно в дозе 0,25 мг/кг, то есть в минимальной дозе, обеспечивающей выраженный гестагенный эффект в тесте Клауберга-Мак Фейла. Введение препарата осуществлялось в течение 6-и дней, начиная со дня овариэктомии, охватывая таким образом период от развития яйцеклетки до формирования бластоцист, и регистрировали их количество. Овариэктомированные контрольные животные получали внутримышечно растворитель - растительное масло по 0,4 мл.

Результаты исследования представлены в таблице 2. Из приведенных данных следует, что исследуемое новое соединение обладает гестагенной активностью, так как вызывает сохранение беременности у части овариэктомированных крольчих.

Обобщая полученные данные в тесте Клауберг-Мак Фейла и Корнера Аллена, можно заключить, что фенилпропионилокс является активным гестагенным соединением, превосходящим по активности некоторые известные стероидные препараты.

Пример 3. Определение андрогенной и анаболической активности фенилпропионилокса.

Результаты исследований, выполненных на подопытных кастрированных крысах-самцах, получавших фенилпропионилокс в дозе 1,5 мг/кг ежедневно в течение 7 дней, показали, что масса семенных пузырьков и вентральной простаты составляла 6,42±0,20 мг и 56,3±3,1 мг соответственно. У контрольных животных, получавших тестостерона пропионат, масса семенных пузырьков была 18,1±1,1 мг, масса вентральной простаты была 76,2±2,2 мг; у контрольных животных, получавших растворитель - 6,52±0,21 мг и 58,10±2,40 мг соответственно.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что фенилпропионилокс не вызывает статистически достоверных изменений массы семенных пузырьков и вентральной простаты у подопытных животных по сравнению с животными контрольной группы, получавших растворитель. В то же время введение тестостерона пропионата вызывало значительное увеличение массы этих органов.

Таким образом, введение фенилпропионилокса в дозе 1,5 мг/кг инфантильным кастрированным самцам крыс не вызывало статистически достоверного увеличения массы семенных пузырьков и вентральной простаты по сравнению с контролем (растительное масло), что свидетельствует об отсутствии у заявляемого вещества андрогенного эффекта.

Для выявления возможного анаболического действия фенилпропионилокса животных декапитировали на 8-й день от начала опыта, препарировали m. Levator ani и определяли массу мышцы.

У подопытных животных, получавших фенилпропионилокс, масса m. levator ani составляла 61,34±3,36 мг. В контрольной группе крыс, получавших тестостерона пропионат, масса m. levator ani составляла 82,1±3,0 мг, а в контрольной группе, получавшей растворитель - 62,10±3,20 мг.

Результаты опытов показывают, что тестостерона пропионат заметно увеличивает массу мышцы, в то время как фенилпропионилокс практически не влияет на массу органа-мишени. На основании полученных данных можно заключить, что фенилпропионилокс в дозе 1,5 мг/кг не вызывает увеличения массы m. levator ani, что указывает на отсутствие анаболического эффекта у заявленного вещества.

Пример 4. Определение эстрогенной активности фенилпропионилокса
Исследование эстрогенной активности фенилпропионилокса проводили по методу Дорфмана путем регистрации изменений массы матки у инфантильных самок крыс. Подопытным животным внутримышечно вводили фенилпропионилокс в дозе 1,5 мг/кг в объеме 0,1 мл в течение 3-х дней. Контрольным крысам вводили растворитель - растительное масло в том же объеме. Затем животных декапитировали, выделяли матку и взвешивали ее.

Масса матки подопытных крыс составила 44,21±2,16 мг, у контрольных животных масса матки составила 43,62±2,81 мг.

Результаты опытов показали, что испытуемое соединение в указанной дозе практически не вызывает изменений массы матки инфантильных самок крыс. Следовательно, фенилпропионилокс не обладает эстрогенным утеротропным действием.

Пример 5 Определение степени влияния фенилпропионилокса на сократительную активность матки.

Исследования показали, что внутрибрюшинное введение беременным крысам со сроком беременности 14-15 дней гестагенных препаратов ацетомепрегенола и фенилпропионилокса в дозе 0,25 мг/кг приводит к угнетению сократительной активности матки, регистрируемой по биоэлектрической активности. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Уже через 15 минут после введения ацетомепрегенола в указанной дозе отмечалось снижение величины амплитуды биопотенциалов миометрия на 23,3%. Сниженная амплитуда отмечалась и через 20-30 минут после введения препарата. Частота сокращений при этом не изменялась. Восстановление показателей амплитуды происходило через 45 минут после введения препарата (табл. 3).

Аналогичная картина наблюдалась и при введении заявленного вещества - фенилпропионилокса. Как следует из таблицы, фенилпропионилокс в дозе 0,25 мг/кг через 15 минут после введения снижает амплитуду биопотенциалов на 22%. Такой же уровень снижения амплитуды отмечался и спустя 20-30 минут после введения препарата. Препарат не вызывал изменений со стороны частоты сокращений миометрия (табл. 3). Восстановление исходных показателей отмечалось через 45 минут после введения препарата.

Таким образом, исследованные гестагенные препараты: ацетомепрегенол и фенилпропионилокс в определенной дозе оказывают сходное угнетающее влияние на сократительную активность миометрия у беременных крыс со сроком 14-15 дней беременности в опытах in vivo.

Пример 6. Определение влияния фенилпропионилокса на возможность пролонгирования беременности при угрожающем аборте.

Определение влияния фенилпропионилокса на возможность пролонгирования беременности при угрожающем аборте, индуцированном продигиозаном, проводилось в опытах на мышах.

Животным с целью предупреждения аборта на 13, 14 и 15-й день беременности вводили подкожно гестагены в дозе 0,25 мг/кг - ацетомепрегенол одной группе, фенилпропионилокс другой группе животных. Животным контрольной группы вводили оливковое масло. Самопроизвольный аборт регистрировали по наличию мертворожденных плодов. Результаты экспериментов представлены в табл. 4
Как видно из табл.4, у всех животных 1 группы после введения на 16-й день беременности продигиозана (20 мкг/животное) отмечали уже на 17-18-й день беременности самопроизвольный аборт, которому предшествовали кровянистые выделения из половых путей. Предварительное введение ацетомепрегенола беременным мышам (2-я группа) предотвратило выкидыш у 6 из 8 животных. При подкожном введении фенилпропионилокса (3-я группа) - у 7 из 8 животных удалось сохранить беременность (беременности мышей закончились родами в срок живыми плодами). В контрольной группе животных, получавших оливковое масло, беременность закончилась родами в обычные сроки.

Аналогичные положительные результаты были получены при индуцировании прерывания беременности интерлейкином-lβ, простагландином энзапростом Ф и другими препаратами.

Новое синтезированное вещество является малотоксичным соединением. Дозы, в 10-100000 раз превышающие терапевтическую дозу, не вызывают гибели животных, что подтверждает малую токсичность препарата
Полученные данные свидетельствуют о корреляции сохраняющего беременность эффекта веществ и их гестагенной активностью.

Сравнительные испытания нового вещества и известных, применяемых в акушерстве и гинекологии веществ, выявление его гестагенной активности позволило определить состав нового лекарственного средства, активным началом которого является фенилпропионилокс. Традиционно подобные лекарственные средства выпускаются в таблетированном виде. Полученные в процессе экспериментов характеристики вещества позволили определить долю активного начала (фенилпропионилокса) в лекарственном средстве - 0,8-3,0 мас.%.

В частности, рекомендуемый состав, мас.%:
17α-Ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он - 1,2
Лактоза - 88,8
Крахмал - 7,3
Кальция стеарат - 0,9
Тальк - 1,8
Таблетированный препарат можно рекомендовать женщинам при клинической картине угрожающего и начавшегося аборта с 4-х недель беременности с продолжением курса до 20 недель беременности.

Новоесоединение-17α-ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он формулы I, обладающий гестагенной активностью. В состав лекарственного средства новое соединение входит в количестве 0,8-3,0 мас.%. Средство предназначено для сохранения беременности и может найти применение в акушерской практике и гинекологии. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 3 ил., 4 табл.

1. 17α-Ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он формулы I

обладающий гестагенной активностью. 2. Лекарственное средство, обладающее гестагенной активностью, состоящее из активного начала и фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, отличающееся тем, что активное начало представляет собой 17α-ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он формулы I

в количестве 0,8-3,0% от массы лекарственного средства. 3. Лекарственное средство по п. 2, отличающееся тем, что включает в качестве фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ лактозу, крахмал, кальция стеарат и тальк при следующем соотношении компонентов, мас. %:
17α-Ацетокси-3β-фенилпропионилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он - 1,2
Лактоза - 88,8
Крахмал - 7,3
Кальция стеарат - 0,9
Тальк - 1,8