СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИНТЕТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/52 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам гистохимического определения активности ферментов, и может быть использовано для диагностики процессов повреждения тканей, связанных с активацией свободнорадикального окисления.

Исследования последнего десятилетия вывели синтетазу оксида азота в число самых изучаемых ферментов [1, 2]. Это связано с многообразием функций и высокой биологической активностью конечного продукта ферментативной реакции - оксида азота - одного из пяти известных внутриклеточных мессенджеров [3]. Оксид азота может усиливать защитные механизмы и повышать устойчивость клеток к воздействию. Однако, взаимодействуя с супероксиданионрадикалом, оксид азота образует пероксинитрит, который в кислой среде диссоциирует с образованием гидроксильного радикала. Указанные радикалы являются длительноживущими и оказывают сильное повреждающее действие на структуры клеток. Их образование обеспечивает противомикробную защиту организма, но при патологических состояниях (инсульты, инфаркты, околоопухолевое воспаление и др.) может способствовать расширению зоны повреждения и утрате высокоспециализированных клеток с критическими для жизни нарушениями функций органов. В силу этого процессы образования оксида азота, выполняющего, кроме того, регуляторные функции, подвергаются детальному анализу для прогнозирования исходов заболеваний.

Синтетаза оксида азота представляет собой сложный фермент, состоящий из нескольких частей, каждая из которых выполняет определенную каталитическую функцию [4].

Известен способ гистохимической оценки активности энзима по конечному продукту ферментативной реакции. При образовании часть оксида азота связывается с тиолами, образуя нитрозотиолы. Содержание последних в тканях оценивают иммуногистохимически по количеству нитротирозина [5]. Достоинства этого способа состоят в возможности оценить активность фермента по количеству конечного продукта ферментативной реакции, что повышает специфичность результатов. К числу недостатков данного способа, ограничивших его применение, относятся необходимость использования сывороток, производство и очистка которых сопряжены с существенными материальными затратами, а также возможность оценки содержания оксида азота, связанного только с одной аминокислотой, тогда как остальные более многочисленные нитрозотиолы не подвергаются анализу.

Известен способ гистохимического определения активности фермента посредством цветной реакции с нитросиним тетразолием (НСТ), восстанавливающимся в окрашенный формазан при окислении восстановленного никотинамид-динуклеотид фосфата (НАДФН₂) на редуктазном домене энзима [5, 6]. Эта гистохимическая реакция с успехом применялась для выявления NO-ергических нейронов в коре головного мозга и в сплетениях кишечника, а также для исследования образования оксида азота в различных органах и тканях [7-9].

Однако использование данного способа не позволяло получить точные результаты в силу того, что аналогичная ферментативная реакция осуществляется как минимум еще пятью ферментами, выделить среди которых компонент синтетазы оксида азота не представляется возможным. Для преодоления этого недостатка разработан способ предварительной обработки переживающего материала для подавления активности НАДФН₂-диафораз, не связанных с метаболизмом оксида азота. Эта обработка сводится к предварительному погружению срезов в раствор формальдегида или перманганата калия [5, 10, 11].

Применение предварительной обработки срезов позволило повысить специфичность способа, что подтверждено иммуногистохимическим выявлением белка NO-синтетазы. Было показано, что модифицированное выявление диафоразной активности с высокой степенью совпадает с распределением иммуннологической метки и маркирует локализацию фермента [12, 13].

Описанный способ гистохимического определения активности NO-синтетазы принят в качестве прототипа как наиболее широко распространенный и близкий по порядку производимых действий.

Его достоинства состоят в простоте исполнения и возможности оценивать суммарную скорость окислительных процессов на ферменте.

Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков, заключающихся в:
- оценке активности фермента не по конечным продуктам ферментативной реакции, что исключает возможность получения информации о работе фермента при дефиците тетрагидробиоптерина, когда при диссоциации центров метаболизма L-apгинина и одноэлектронного восстановления кислорода совместно с NO вырабатывается супероксиданионрадикал (фиг.1);
- невозможности инактивировать формалином или перманганатом калия все побочные НАДФН₂-диафоразы. Чрезмерная обработка коагулирующими агентами способна угнетать активность самой синтетазы оксида азота, а в случае недостаточной предварительной обработки может быть выявлена дополнительная активность, не относящаяся к образованию оксида азота.

Приведенные аргументы определяют необходимость параллельного проведения нескольких гистохимических реакций, характеризующих процессы на оксидазном и редуктазном доменах фермента и определяющих степень их согласования.

Целью изобретения является изыскание способа определения активности синтетазы оксида азота, позволяющего повысить точность оценки функционального состояния и активности данного фермента в конкретных клетках для решения диагностических и научно-исследовательских задач.

Указанная цель достигается за счет использования комплексного способа, заключающегося в том, что наряду с выявлением НАДФН₂-диафоразной активности фермента проводят оценку сопряжения функционирования его каталитических центров в ходе НСТ-теста и гистохимического выявления нитритов реактивом Грисса.

Возможность достижения цели изобретения доказывается следующими примерами.

Пример 1. Способ определения активности синтетазы оксида азота
Способ представляет собой выполнение следующего порядка действий. Образец ткани извлекают из биологического объекта и замораживают в жидком азоте после коррекции поверхностного натяжения последнего тальком. Для изготовления свежезамороженных срезов применяют микротом со столиком ТОЗ или криостат, изготовление срезов в котором осуществляют при температуре -18^oС. Образец ткани извлекают из жидкого азота и помещают в нанесенную каплю воды, примораживая к препаратодержателю. Посредством микроподачи образец ткани поступательно поднимают на 10 мкм, срезая поднятый над плоскостью ножа участок.

При изготовлении криостатных срезов их переносят с ножа кисточкой на заранее охлажденное стекло и посредством локального нагревания противоположной срезу поверхности стекла достигают расправления препарата. Лучшая адгезия препарата на стекле достигается быстрым высушиванием. После изготовления срезов на столике ТОЗ срезы переносят в охлажденный до 4^oС забуференный физиологический раствор (pН 7,4). При осуществлении указанного способа используют три среза ткани, смонтированные на три стекла или помещенные в три емкости с физиологическим раствором. Для контроля реакций используют еще три препарата.

В случае использования способа для оценки активности синтетазы оксида азота в культурах клеток и тканей при окрашивании культур на стеклах не выполняют предыдущие манипуляции. Инкубационные среды сливают и препараты культур трижды промывают в пробирках холодным забуференным физиологическим раствором (рН 7,4, температура 4^oС).

Первый препарат переносят из физиологического раствора в свежеприготовленный раствор реактива Грисса. При использовании криостатных срезов растворы окрашивающих реактивов накапывают на стекло. При окрашивании культур тканей на стеклах препараты целиком погружают в красящие растворы посредством заливания последних в пробирки, содержащие культуры. Окрашивание выполняют в течение 30 мин при температуре 37^oС. Приготовление реактива Грисса осуществляют растворением 350 мг официнального препарата (производство НПО "Реактив") в 50 мл дистиллированной воды. Контролем служат препараты, инкубированные после предварительной обработки в растворе ингибитора синтетазы оксида азота - метилового эфира L-нитроаргинина в концентрации 10^-5 М.

Второй препарат помещают в 0,2% раствор нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) для проведения НСТ-теста. Окрашивание выполняют в течение 30 мин. Контролем служат препараты, инкубированные без добавления НСТ.

Третий препарат в течение 10 мин обрабатывают по способу-прототипу, помещая в 4% водный раствор нейтрального формалина для инактивации НАДФН₂-диафораз, не связанных с образованием оксида азота. После обработки формалином препараты инкубируют в субстратно-буферной смеси, содержащей НСТ и НАДФН₂, по прописи Лойда [14]. Контролем служат препараты, предварительно обработанные в растворе солей дифенилйодиния в концентрации 10^-5 М.

После окрашивания препараты высушивают феном и без дополнительного обезвоживания просветляют ксилолом и заключают в канадский бальзам или сироп Апати.

Содержание продуктов цитохимической реакции в клетках ткани препарата оценивают количественно на световом микроскопе с помощью фотометрических приставок. Интенсивность выпадения диформазана оценивают при длине волны 530 нм, а фотометрию продуктов гистохимической реакции на нитриты выявляют при длине волны 480 нм. Активность фермента описывают тремя показателями фотометрии.

Пример 2. Оценка активности NO-синтетазы в седалищном нерве крыс
Извлеченный образец тканей седалищного нерва крысы обрабатывали в соответствии с заявляемым способом. Результаты окраски срезов приведены на фиг. 2, 3 и 4.

Очевидно, что наибольшее накопление диформазана при выявлении НАДФН₂-диафоразы происходит в клетках стенки сосудов и глиоцитах, тогда как нервные тяжи остаются малоокрашенными. Аналогичным образом распределяется продукт диазосочетания, маркирующий скопление нитритов. При проведении НСТ-теста структуры нерва окрашивались слабо, что свидетельствует о сопряжении процессов на оксидазном и редуктазном доменах фермента.

В данном примере распределение продуктов реакции для выявления нитритов совпадало с результатами выявления НАДФН₂-диафоразы (способа-прототипа), однако дополнительное применение НСТ-теста позволило оценить сопряженность функционирования доменов фермента.

Таким образом, заявляемый способ по сравнению со способом-прототипом позволяет получить дополнительную информацию о ферментативном процессе.

Пример 3. Оценка активности NO-синтетазы в культуре клеток почечного эпителия
Препараты культур клеток почечного эпителия, адгезированных на покровных стеклах, обрабатывали заявляемым способом.

При микроскопии в клетках выявляли гранулы продуктов гистохимических реакций. Показано, что при выявлении формалинрезистентной НАДФН₂-диафоразной активности количество этих гранул в клетках и интенсивность их окраски были значимо большими по сравнению с результатами гистохимической реакции при выявлении нитритов и результатами НСТ-теста. Это, по-видимому, связано с тем, что клетки данного дифферона экспрессируют ряд ферментов, обладающих формалинрезистентной НАДФН₂-диафоразной активностью.

В данном примере распределение продуктов реакции для выявления нитритов и результат НСТ-теста не совпадали с результатами выявления НАДФН₂-диафоразы (способа-прототипа), что, вероятно, связано с дополнительным окрашиванием ткани, не связанным с процессами синтеза NO.

Таким образом, заявляемый способ превосходит прототип по специфичности и позволяет получить более точную информацию об активности фермента.

Пример 4. Оценка активности NO-синтетазы в седалищном нерве после ишемии конечности и реперфузии
Беспородную белую крысу массой 220 г наркотизировали тиопенталом в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно и фиксировали на станке в положении на спине с расправленными конечностями. На правую конечность в паховой области поперечно накладывали сдавливающий турникет на 1 ч. По истечении времени препятствие кровотоку ликвидировали и через 10 мин после реперфузии конечности наркотизированное животное выводили из опыта. Крысу декапитировали и иссекали седалищный нерв ишемизированной конечности. Контралатеральный седалищный нерв использовали для контроля.

Извлеченные образцы тканей седалищных нервов крысы обрабатывали заявляемым способом. Результаты окраски срезов интактного нерва не отличались от приведенных в примере 2. Результаты окраски нерва ишемизированной конечности приведены на фиг.5, 6 и 7.

Окрашивание тканей седалищного нерва поврежденной конечности отличалось от такового с контралатеральной стороны. Обнаруживали значимо большую интенсивность распределения продуктов цветной реакции на нитриты и высокий уровень НСТ-теста, однако НАДФН₂-диафоразная активность существенно не изменялась.

В данном примере распределение продуктов реакции диазосочетания превосходило результаты диафоразного теста (способа-прототипа). Интенсивное окрашивание срезов диформазаном при неиндуцированном восстановлении НСТ позволило предположить диссоциацию функционирования доменов и утечку электронов без изменения диафоразной активности.

Таким образом, заявляемый способ превосходит прототип по возможности анализировать процессы синтеза оксида азота при патологических состояниях. Интенсивная реакция при определении нитритов в сочетании с интенсивным окрашиванием тканей при выполнении НСТ-теста позволяют установить формирование пероксинитрита и прогнозировать степень повреждения тканей.

Приведенные примеры показывают, что только при проведении комплекса гистохимических реакций можно оценить адекватно функционирование синтетазы оксида азота в нормальных, а главное в патологических условиях, когда изолированное применение НАДФН₂-диафоразного теста (способа-прототипа) дает искаженные результаты.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию "новизна", так как впервые предложен эффективный способ оценки активности и функционального состояния синтетазы оксида азота, предусматривающий проведение комплекса гистохимических реакций и позволяющий определять патологические изменения в конкретных клеточных популяциях, а не в ткани в целом, что значимо повышает ценность получаемой информации. Гистохимическое определение нитритов ранее в литературе не описано.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию "изобретательский уровень", так как в нем не используются известные технические решения. В предлагаемом способе для оценки активности и функционального состояния NO-синтетазы применен комплекс гистохимических реакций, позволяющих оценить функционирование энзима и сопряжение реакций метаболизирования L-аргинина и одноэлектронного восстановления кислорода при образовании конечных продуктов ферментативной реакции.

Соответствие критерию "пригодность для промышленного применения" доказывается результатами проведенных исследований, из которых видно, что предлагаемый способ прост в осуществлении и может широко применяться при проведении научно-исследовательских работ и в лабораторно-диагностической практике для получения достоверных результатов при идентификации биохимических механизмов формирования патологических состояний.

Источники информации
1. Горрен А.К.Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. - 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 870-880.

2. Тейлор B.C., Аларсон Л.Х., Биллиар Т.Р. Индуцибельная синтаза оксида азота в печени: регуляция и функции // Биохимия. - 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 905-923.

3. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазназная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота // Биохимия. - 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 1029-1040.

4. Costa E. T., do-Nascimento J.L., Picanco-Diniz C.W., Quaresma J.A., Silva-Filho M. Histochemical characterization ofNADPH-diaphorase activity in area 17 of diurnal and nocturnal primates and rodents // Braz. J. Med. Biol. Res. - 1996. - Vol. 29, 10. - P. 1355-1362.

5. Mirza M. H. , Oliver J.L., Seaborn T.L., Hosgood G., Moore R.M. Detection and comparison of nitric oxide in clinically normal horses and those with naturally acquired small intestinal strangulation obstruction // Can. J. Vet. Res. - 1999. - Vol. 63, 4. - P. 230-240.

6. Alonso J.R., Porteros A., Crespo С., Arevalo R., Brinon J.G., Weruaga E. , Aijon J. Chemical anatomy of the macaque monkey olfactory bulb: NADPH-diaphorase/nitric oxide synthase activity // J. Сотр. Neurol. - 1998. - Vol. 402, 3. - P .419-434.

7. Мотавкин П.А., Охотин В.Е., Сулимов Г.Ю. Холинэргические пирамидные нейроны двигательной области нокортекса человека // Морфология. - 1990. - Т. 99, вып. 8. - С. 34-39.

8. Liu L., Liu G.L., Barajas L. Distribution of nitric oxide synthase-containing ganglionic neuronal somata and postganglionic fibers in the rat kidney // J. Сотр. Neurol. - 1996. - Vol. 369. 1. - P. 16-30.

9. Nakajima Т. , Sakaue M., Kato M., Saito S., Ogawa K., Taniguchi K. Immunohistochemical and enzyme-histochemical study on the accessory olfactory bulb of the dog // Anat. Rec. - 1998. - Vol. 252, 3. - P. 393-402.

10. Matejevic D., Grozdanovic Z., Gossrau R., Nakos G., Graf R. Nitric oxide synthase I immunoreactivity and NOS-associated NADPHd histochemistry in the visceral epithelial cells of the intraplacental mouse yolk sac // Acta Histochem. - 1996. - Vol. 98, 2. - P. 173-183.

11. Nahar N.S., Chowdhury J.U., Tokuno H., Tomita Т., Torihashi S., Iino S. , Kobayashi S. Nitrinergic nerves controlling pacemaker activities of the inner sublayer(P-layer) in the canine proximal colon circular muscles // Arch. Histol. Cytol. - 1996. - Vol. 59, 1. -P. 37-46.

12. Blute T.A., Mayer В., Eldred W.D. Immunocytochemical and histochemical localization of nitric oxide synthase in the turtle retina // Vis. Neurosci. - 1997. - Vol. 14, 4. - P. 717-729.

13. Lamanna С., Costagliola A., Vittoria A., Mayer В., Assisi L., Botte V. , Cecio A. NADPH-diaphorase and NOS enzymatic activities in some neurons of reptilian gut and their relationships with two neuropeptides // Anat. Embryol. (Beri). - 1999. - Vol. 199, 5. - P. 397-405.

14. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов: лабораторные методы. Пер. с англ. - M.: Мир, 1982. - 272 с.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гистохимии. Способ обеспечивает повышение точности оценки функционального состояния и активности синтетазы оксида азота в конкретных клетках для решения диагностических и научно-исследовательских задач. Проводят оценку НАДФН₂-диафоразной активности фермента путем обработки исследуемого препарата растворами солей тетразолия в присутствии НАДФН₂ после выдержки препарата в течение 10 мин в 4% водном растворе нейтрального формалина, при этом предусматривают проведение комплекса гистохимических реакций, включающего дополнительно оценку сопряжения функционирования каталитических центров фермента в ходе НСТ-теста путем окрашивания препарата в течение 30 мин в 0,2% растворе нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) и выявления нитритов путем выдержки препарата в свежеприготовленном реактиве Грисса в течение 30 мин при 37^oС, а активность и функциональное состояние синтетазы оксида азота определяют фотометрически по содержанию в клетках препарата продуктов цитохимических реакций на нитриты и диформазана. 7 ил.

Способ определения активности и функционального состояния синтетазы оксида азота, включающий оценку НАДФН₂-диафоразной активности фермента путем обработки исследуемого препарата растворами солей тетразолия в присутствии НАДФН₂ после выдержки препарата в течение 10 мин в 4% водном растворе нейтрального формалина, отличающийся тем, что предусматривает проведение комплекса гистохимических реакций, включающего дополнительно оценку сопряжения функционирования каталитических центров фермента в ходе НСТ-теста путем окрашивания препарата в течение 30 мин в 0,2%-ном растворе нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) и выявления нитритов путем выдержки препарата в свежеприготовленном реактиве Грисса в течение 30 мин при 37^oС, а активность и функциональное состояние синтетазы оксида азота определяют фотометрически по содержанию в клетках препарата продуктов цитохимических реакций на нитриты и диформазана.