СПОСОБ ИНДУКЦИОННОЙ ГИПЕРТЕРМИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2003 года по МПК A61N2/04 A61N2/06 A61N2/08 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в онкологии для лечения опухолей различной локализации в эксперименте.

Известен способ индукционной гипертермии злокачественных опухолей животных в переменном магнитном поле: после внутриопухолевого введения магнитовосприимчивых частиц животное индукционно нагревают, мыши выдерживают 3-минутные процедуры лечения, после 7-минутных процедур они гибнут [1].

Известен способ индукционной гипертермии злокачественных опухолей животных в переменном магнитном поле: после внутриопухолевого введения магнитовосприимчивых частиц животное, покрытое электроизолирующим материалом, индукционно нагревают, мыши выдерживают 9-минутные процедуры лечения, после 15-минутных процедур они гибнут. У выживших животных после кратковременной ремиссии развивается рецидив [2].

Известные аналоги имеют следующие недостатки: электрическое поле индуцирует электрические заряды на коже экспериментальных животных. Электрические заряды генерируют искровые электрические разряды, которые обладают высокой токсичностью и калечат экспериментальных животных. Животные страдают от токсикоза, вызванного искровыми электрическими разрядами и перегревом.

Наиболее близким к предлагаемому способу индукционной гипертермии (прототип) [3] является способ, при котором мышь после внутриопухолевого введения магнитной жидкости помещают в болюс (кювета с двумя створками), болюс с мышью располагают между полюсами сердечника (частота 500 кГц, индукция от 1 до 10 кА/м) и индукционно нагревают. Температура среды, окружающей животное, поддерживается на уровне +35^oС, температура опухоли 42-45^oС.

Прототип имеет те же недостатки, что и аналоги: неконцентрированное и нефиксированное в опухоли (рассеянное в организме) состояние магнитоуправляемого препарата, который концентрируется в печени от 12 до 14%, в селезенке, почках и других органах ретикулоэндотелиальной системы, что ведет к токсикозу и понижению терапевтического эффекта, после недельной ремиссии наступает рецидив.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков, обеспечение безопасности и терапевтического эффекта. Указанная задача решается тем, что после регионарного внутриопухолевого введения магнитоуправляемого препарата животное размещают в неоднородном постоянном магнитном поле таким образом, чтобы препарат концентрировался и фиксировался в опухоли по ходу силовых линий, после этого животное ориентируют так, чтобы опухоль находилась в пространстве максимальной напряженности переменного электромагнитного поля, прошедшего через слой воды с постоянной температурой, и выдерживают заданное время с последующими повторениями процедуры от 3 до 12 сеансов с 3-6-дневными перерывами, в зависимости от злокачественности и объема опухоли. Длительность перерыва зависит от физического состояния животного, которое определяют по внешнему виду и подвижности: чем лучше выглядит животное, тем короче перерыв.

При пропускании переменного электромагнитного поля через слой воды толщиной 1,2-21 мм, имеющей постоянную температуру, поглощается энергия электрического поля и восстанавливается постоянная температура среды, окружающей животное, наблюдается электротермостатирование животного.

Способ осуществляется следующим образом: на 6-9 день после прививки, когда объем опухоли достигает 21-30 мм³, вводят в центр опухоли 300 мкл раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата (содержание γ-Fе₂О₃ 36 мг), ориентируют опухоль в неоднородном постоянном магнитном поле индукцией 0,2-4 Тл, градиент 0,015-0,3 Тл/см так, чтобы она была коаксиальна силовым линиям неоднородного постоянного магнитного поля и выдерживают 3-9 мин, далее опухоль ориентируют в переменном магнитном поле (частота 50 - 1000 кГц, индукция 7,2 кА/м - 12 кА/м, мощность 0,15-15 кВт), пропущенном через слой воды толщиной 1,2-21 мм с постоянной температурой (электротермостатирование), введенный препарат индукционно нагревается и через 3-15 минут температура опухоли повышается до (+42) - (+45)^oС, выдерживают 6-45 мин (в зависимости от мощности). Сразу после завершения нагрева измеряют температуру в прямой кишке (не должна превышать +37^oС). Через каждые 3-6 суток процедуру гипертермии повторяют, всего от 3 до 12 раз. Полученные результаты лечения представлены в примерах.

Все процедуры проводят в соответствии с рекомендациями [4]. Все полученные данные обрабатывают статистически по рекомендованным критериям, за достоверные принимают различия при ρ <0,05 [4]. Температуру определяют с помощью спиртового и электрического термометров. В предварительных опытах in vitro определяют оптимальные параметры постоянного и переменного магнитных полей при концентрации, фиксации и индукционном нагреве магнитоуправляемого противоопухолевого препарата в фантоме опухоли и in vivo на экспериментальных животных: мыши, крысы, кролики, собаки.

Преимущества заявленного способа по сравнению с известными демонстрируются примерами 1-9.

Пример 1. Преимущества электротермостатирования. 18 мышей самцов делят на 3 равные группы. У мышей измеряют температуру в прямой кишке. Каждую мышь помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. После этого мышей 1 группы выдерживают 45 мин в переменном электромагнитном поле; мышей 2 группы выдерживают 45 мин в переменном электромагнитном поле с частичной защитой от электрического поля; мышей 3 группы выдерживают 45 мин в переменном электромагнитном поле, пропущенном через слой воды толщиной 1,2-21 мм с постоянной температурой (полная защита от электрического поля и перегрева, электротермостатирование), при частоте (f) 0,88 МГц, индукции (Н) 7,2 кА/м, мощности 0,15 кВт. Сразу после процедур воздействия постоянного и переменного магнитных полей у каждой мыши измеряют температуру на поверхности кожи и в прямой кишке. В 1 и 2 группах, без полной защиты от электрических разрядов и перегрева (без электротермостатирования) животные заряжены (при соприкосновении с телом животного наблюдается свечение неонового индикатора, это указывает на электрический заряд на его поверхности), температура в прямой кишке мышей +36,5^oС, на поверхности кожи - (+37) - (+42)^oС, кроме перегрева, они подвергаются действию искровых электрических разрядов, которые вызывают выпадение усов и облысение головы, на хвосте и подушечках лап искровые электрические разряды точечно выжигают участки кожи диаметром до 3 мм и глубиной до 1,5 мм. В местах электрических поражений появляются множественные кровоточащие раны, в дальнейшем хвост воспаляется и теряет гибкость. После этого большинство испытуемых животных выживает, но у 30-60% мышей спонтанно ампутируется часть - или весь хвост, животные не размножаются. В 3 группе температура в прямой кишке и на поверхности кожи +36,5^oС и полностью отсутствуют признаки электрического поражения, животные чувствуют себя нормально. Защитное действие электротермостатирования объясняется тем, что при пропускании электромагнитного поля через слой воды абсорбируется энергия электрического поля и избыток тепла, животное не заряжено (при соприкосновении с телом животного свечение неонового индикатора не наблюдается, это указывает на отсутствие электрического заряда на его поверхности), температура кожи +35^oС.

Т.о., электротермостатирование полностью защищает подопытных животных от токсикоза, вызванного искровыми электрическими разрядами и перегревом. В этом преимущество заявленного способа по сравнению с известными.

Пример 2. Концентрация и фиксация магнитоуправляемого противоопухолевого препарата неоднородным постоянным магнитным полем в опухолевых тканях. 18 мышам самцам под кожу правого бока вводят 10⁶ клеток карциномы Эрлиха. На 6-9 день, когда объем опухоли достигает 21-30 мм³, вводят в центр опухоли каждой анестезированной мыши 300 мкл раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг). Мышей делят на 3 равные группы. Мышей 1 группы размещают в неоднородном постоянном магнитном поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см так, чтобы опухоль была коаксиальна магниту, и выдерживают 5 мин. При этом происходит: укрупнение и ориентация частиц магнитоуправляемого противоопухолевого препарата параллельно силовым линиям поля, их концентрация и фиксация в опухолевых тканях, при последующем индукционном нагревании выраженные ответы опухолей получают через 28 дней; во 2 группе без магнитной концентрации и фиксации (магнитоуправляемый препарат вводят, но опухоль не помещают в постоянное магнитное поле) получают низкий противоопухолевый эффект. У мышей 1 группы в тканях опухоли, удаленных после концентрации и фиксации магнитоуправляемого противоопухолевого препарата неоднородным постоянным магнитным полем, обнаруживают от 63 до 75% (вес. ) Fe от введенного в составе магнитоуправляемого противоопухолевого препарата. Во 2 и 3 группах, без концентрации и фиксации магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, обнаруживают от 0,09 до 1,8% (вес.) Fe от введенного в составе магнитоуправляемого противоопухолевого препарата.

Т. о. , неоднородное постоянное магнитное поле концентрирует и фиксирует магнитоуправляемый противоопухолевый препарат в опухоли. Этим объясняется высокий противоопухолевый эффект и подтверждается преимущество заявленного способа по сравнению с известными.

Пример 3. Безопасность заявленного способа. 12 мышей самцов делят на 2 равные группы, опытную и контрольную. 12 мышей самок делят на 2 равные группы, опытную и контрольную. У мышей измеряют температуру в прямой кишке. Каждую мышь опытной группы в капсуле помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. Из постоянного магнитного поля электротермостатированную мышь перемещают в переменное магнитное поле, частота 0,88 МГц, индукция 7,2 кА/м, мощность 0,15 кВт и выдерживают 6х90 мин с интервалом 3 суток. Сразу после завершения процедуры измеряют температуру на поверхности кожи и в прямой кишке. Температура кожи и прямой кишки +36,5^oС. После процедур воздействия постоянного и переменного магнитных полей каждого самца опытной группы подсаживают в клетку к самке опытной группы, получившей те же процедуры. Среднее число мышат в пометах опытной группы составляет 5,6. Среднее число мышат в пометах контрольной группы составляет 6. Средняя продолжительность жизни мышей в опытной группе составляет 48 месяцев. Средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе составляет 49 месяцев.

Этими результатами подтверждается безопасность заявленного способа в условиях лечения онкологических заболеваний.

Пример 4. Определение зависимости противоопухолевого эффекта от температуры кожи на поверхности опухоли и продолжительности сеанса гипертермии. 36 мышам подкожно вводят суспензию 10⁶ клеток саркомы S180, делят мышей на 4 равные группы: 1, 2, 3 и 4. Когда средний диаметр опухоли достигает 6 мм (около 6 суток), мышам 2, 3 и 4 групп в опухоль вводят от 0,06 до 0,09 мл 30% раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата. Мышей 1, 2, 3 и 4 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см, каждую мышь электротермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура в прямой кишке и на поверхности опухоли у мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) остается между (+36) - (+37)^oС. Температура опухоли у мышей 2, 3 и 4 групп под действием переменного магнитного поля в течение 24 мин поднимается выше +42^oС. Гистологически подтверждается образование некротизированной опухолевой ткани в центре опухоли, кроме того, в опухолях обнаруживаются скопления живых клеток. Во 2 группе опухоли нагревают еще 6 минут, температура повышается до (+43) - (+44)^oС, в центре опухоли все клетки мертвые, по периферии остаются скопления живых опухолевых клеток. В 3 группе опухоли нагревают 45 минут, температура повышается до (+44) - (+45)^oС, по периферии опухоли остаются единичные живые опухолевые клетки. В 4 группе опухоли нагревают 60 минут, температура повышается до (+45) - (+46)^oС, живые опухолевые клетки не обнаруживаются, но проявляются симптомы обширного ожога кожи, поэтому в дальнейшем время нагрева опухолей ограничивают 45 минутами (табл. 1).

Т.о., предпочтительна индукционная гипертермия опухоли при +45^oС в течение 45 мин.

Пример 5. Определение зависимости противоопухолевого эффекта заявленного способа от числа сеансов индукционного нагревания опухоли. 54 мышам подкожно вводят суспензию 10⁶ клеток саркомы S180, делят мышей на 6 равных групп: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Когда средний диаметр опухоли достигает 6 мм (около 6 суток), мышам 2, 3, 4 5 и 6 групп в опухоль вводят от 0,06 до 0,09 мл 30% раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата. Мышей 1, 2, 3, 4, 5 и 6 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см, каждую мышь электротермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура опухоли у мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп под действием переменного магнитного поля в течение 24 мин поднимается выше -42^oС. В то же время температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) остается между (+36) - (+37)^oС. У мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп температура опухоли продолжает повышаться и через 45 мин достигает +45^oС. Процедуру нагревания опухолей у мышей 2 группы проводят 1 раз, 3 группы - 2 раза, 4 группы - 6 раз, 5 группы - 9 раз, 6 группы - 12 раз с интервалом 4 суток (табл. 2).

Получают:
- в 1 группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии;
- во второй группе средний объем опухолей уменьшается медленно, увеличение продолжительности жизни 117%:
- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 9 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 140%;
- в четвертой группе средний объем опухолей в большинстве случаев продолжает увеличиваться до двенадцатого дня, после которого начинается уменьшение объема опухолей и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, полная регрессия опухоли наблюдается у 4 из 9 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 160%;
- в пятой группе после 9 терапевтических воздействий незначительно увеличивается продолжительность жизни мышей 163%;
- в шестой группе после 12 терапевтических воздействий наблюдается уменьшение продолжительности жизни мышей до 140%;
Т. о. , предпочтительна индукционная гипертермия опухоли при +45^oС 9х45 мин с интервалом 4 суток.

Пример 6. Увеличение средней продолжительности жизни мышей при внутриопухолевой индукционной гипертермии саркомы S180. 20 мышам подкожно вводят суспензию 10⁶ клеток саркомы S180 и делят их на 2 равные группы. Когда средний диаметр опухоли достигает 6 мм (около 5 суток), у мышей 1 и 2 групп измеряют температуру в прямой кишке, в опухоль вводят от 0,06 до 0,09 мл 30% раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата имышей помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. Мышей 2 группы электротермостатируют и индукционно нагревают опухоли (частота 0,88 МГц, индукция 7,2 кА/м, 0,15 кВт) 9х45 мин при (+44) - (+45)^oС с повторением процедуры через 4 суток. Сразу после прекращения нагрева измеряют температуру на поверхности опухоли и в прямой кишке мыши электротермометром. После девятикратного, с интервалом 4 суток повторения процедуры нагревания, опухоли у мышей мумифицируются и отторгаются в течение следующих 3 недель наблюдения. Из 10 мышей выживает 6 (60%). На месте отторгшейся опухоли образуется лысина, которая через 6 - 9 месяцев зарастает шерстью. Индукционное нагревание саркомы S180 приводит к полной регресси опухоли у 4 животных и к увеличению средней продолжительности жизни мышей 2 группы до 160%.

Этими данными подтверждается противоопухолевый эффект и увеличение средней продолжительности жизни мышей при лечении плотной формы саркомы S180 (табл. 3). Полученные результаты указывают на превосходство заявленного способа над известными.

Пример 7. Определение числа процедур и отдаленного противоопухолевого эффекта при индукционной гипертермии опухоли. Кусочки опухолевой ткани (плотная карцинома Эрлиха), содержащие магнитоуправляемый препарат, имплантируют 45 мышам под кожу правого бока; мышей делят на 5 равных групп. В 1 группе мышей не проводят процедуру индукционного нагревания, во 2 группе проводят - 2 раза, в 3 группе - 4 раза, в 4 группе -12 раз, в 5 группе - 18 раз с интервалом 4 суток (табл. 4). Получают:
- в 1 группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается;
- во второй группе средний объем опухолей незначительно уменьшается и у мышей развивается кратковременная ремиссия;
- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, УПЖ мышей возрастает до 110%;
- в четвертой группе средний объем опухолей в большинстве случаев продолжает увеличиваться до двенадцатого дня, после которого начинается уменьшение объема опухолей и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, полная регрессия опухолей наблюдается у 1 из 9 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 120%. Гистологически подтверждается образование некротизированной опухолевой ткани в центре опухоли после первой процедуры нагревания, однако сразу после третьей процедуры нагревания по периферии опухоли еще обнаруживаются жизнеспособные опухолевые клетки. Полная регрессия опухоли наступает через 4 недели после двенадцатой процедуры нагревания. Полученные результаты указывают на повышение противоопухолевого эффекта при повторяющихся процедурах индукционного нагревания во 2, 3 и 4 группах мышей, в 5 группе проявляется падеж животных от метастазов, связанный с особенностями течения карциномы Эрлиха (табл. 4).

Т. о., для достижения полной регрессии опухолей и проявления отдаленного противоопухолевого эффекта необходимо многократное нагревание. Полученные результаты указывают на превосходство заявленного способа над известными.

Пример 8. Увеличение средней продолжительности жизни мышей при внутриопухолевой индукционной гипертермии саркомы МХ11. 40 мышей делят на 4 равные группы: 1 группа контрольная, 2, 3, 4 - опытные. Всем мышам подкожно вводят суспензию 10⁶ клеток саркомы MX11. Когда средний диаметр опухоли достигает 6 мм (около 5 суток), у мышей измеряют температуру в прямой кишке, в опухоль вводят от 0,06 до 0,09 мл 30% раствора магнитоуправляемого препарата и помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см, мышей 2, 3, 4 групп электротермостатируют и выдерживают опухоль в переменном магнитном поле (частота 0,88 МГц, индукция 7,2 кА/м, мощность 0,15 кВт), 45 мин при (+43) - (+44)^oС с последующим повторением процедуры через 4 суток: во 2 группе 4 раза, в 3 группе 8 раз, в 4 группе 12 раз. В 4 группе после восьмикратного, с интервалом 4 суток, повторения процедуры лечения опухоли у мышей мумифицируются и отторгаются в течение следующих 3 недель наблюдения. Из 10 мышей выживает 4 (40%). На месте отторгшейся опухоли образуется лысина, которая через 6-9 месяцев зарастает шерстью. В 5 группе после 12-кратного, с интервалом 4 суток, повторения процедуры лечения опухоли у мышей мумифицируются и отторгаются в течение следующих 3 недель наблюдения. Из 10 мышей выживает 3 (30%). В контрольной группе, после подкожного введения 10⁶ клеток саркомы МХ11, у всех 10 мышей развиваются опухоли, от которых они гибнут в течение 3 месяцев. Индукционное нагревание саркомы MX11 приводит к увеличению средней продолжительности жизни опытных мышей до 150% (табл. 5) по сравнению с контрольными.

Т. о. при гипертермии саркомы MX11 лучшие результаты дает 8-кратное повторение гипертермии.

Пример 9. Потенцирование противоопухолевого иммунитета. В контрольной группе А 6 мышам вводят кусочки опухоли МХ11 под кожу правого и левого бока. В группе Б кусочки опухолевой ткани (саркома МХ11), содержащие магнитоуправляемый препарат, имплантируют 9 мышам под кожу правого бока, дополнительно им имплантируют под кожу левого бока кусочки опухолевой ткани, не содержащие магнитоуправляемый препарат. Опухоли всех мышей индукционно нагревают 8х45 мин с интервалом 4 суток. При лечении этих мышей нагревание при +45^oС наблюдается лишь в группе Б, в опухолях, расположенных на правом боку. В табл. 6 представлены величины регрессии опухолей на правом и левом боку на 28 день после 8х45 мин с интервалом 4 суток процедур индукционного нагревания. В группе А опухоли обнаруживаются у всех мышей на правом и левом боку. В группе Б полная регрессия на левом боку наблюдается у трех из девяти мышей, отдаленный противоопухолевый эффект наблюдается у каждой из этих мышей. Полная регрессия не наблюдается у 6 из девяти мышей в группе Б, у этих же мышей не наблюдается отдаленный эффект (табл. 6). Т.о., преимущество заявленного способа над известными заключается в том, что индукционное нагревание приводит к потенцированию противоопухолевого иммунитета.

Этими данными подтверждается преимущество заявленного способа увеличением средней продолжительности жизни мышей при индукционном нагревании солидной формы саркомы МХ11.

Пример 10, Определение отдаленного противоопухолевого эффекта. Кусочки опухолевой ткани (саркома S180), содержащие магнитоуправляемый препарат, имплантируют 27 мышам под кожу правого и левого бока; мышей делят на 3 равные группы. Мышам первой группы дополнительно имплантируют под кожу левого бока кусочки опухолевой ткани, не содержащие магнитоуправляемый препарат. Для 1 и 2 группы мышей проводят индукционное нагревание 4•45 мин с интервалом 4 суток. При лечении этих мышей нагревание при +45^oС наблюдается лишь в опухолях, расположенных на правом боку. У мышей 1 и 2 групп скорость роста опухолей снижается в 2 раза в результате повторяющихся процедур нагревания по сравнению с 9 контрольными мышами, на которых процедуры нагревания не распространяются. Через 28 дней после завершения процедур индукционного нагревания у 2 мышей 1 группы наблюдается полная регрессия опухолей, как на правом, гак и на левом боку.

Т. о. . индукционное нагревание опухолей приводит к быстрому уменьшению объема опухолей и проявлению отдаленного противоопухолевого эффекта. В этом преимущество заявленного способа над известными.

Таким образом, заявленный способ превосходит по эффективности и безопасности действия известные способы химиотерапии сарком: S180, МХ11 и карциномы Эрлиха.

Источники информации
1. Medal B.S., Shorey W., Gilchrist R.K., Barker W., Hanselman R. Archives of surgery 79, (1959), pp. 427-431.

2. Брусенцов Н.А., Порубова Г.М., Евелев Ю.К., Шумаков Л.И., Чулков А.В. , Килимник И. В., Разумовский В.А. 4-я Всесоюзная конф. по применению магнитных жидкостей в биологии и медицине. Сухуми, 1991, с. 27-30.

3. A. Jordan, P. Wust, R.. Scholz, H. Faehling, J. Krause, and R. Felix. Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers (Eds) Hafeli et al. Plenum Press, N.Y., (1997), pp. 569 - 595.

4. Л. Ф. Ларионов. Химиотерапия злокачественных опухолей. Мед.лит., М., 1962.

Изобретение относится к медицине. Предложен способ индукционной гипертермии в эксперименте, включающий регионарное введение магнитоуправляемого препарата в зону локализации опухоли с его последующей концентрацией, фиксацией в постоянном магнитном поле и нагревом в переменном электромагнитном поле через слой воды, имеющей постоянную температуру. 6 табл.

Способ индукционной гипертермии в эксперименте, включающий регионарное введение магнитоуправляемого препарата в зону локализации опухоли с его последующей концентрацией, фиксацией и нагревом, при этом концентрация и фиксация препарата осуществляется в постоянном магнитном поле, а нагрев - в переменном электромагнитном поле, пропущенном через слой волы, имеющей постоянную температуру.