СПОСОБ ТЕРМОХИМИОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2009 года по МПК A61N2/04 A61N2/10 A61K31/675 A61K33/26 A61P35/00 A61P35/04 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в онкологии для терапии опухолей различной локализации в эксперименте.

Одним из способов терапии опухолей млекопитающих в эксперименте является внутриопухолевое введение магнитоуправляемых препаратов с последующей индукционной гипертермией [1, 2, 6, 7].

Недостатки: неполный клиренс организма млекопитающего от опухолевых клеток, приводящий к метастазированию и рецидивам первичных опухолей и понижению терапевтического эффекта.

Известен способ терапии опухолей с применением цитостатических средств, в частности сарколизина или алкерана [3]. Параллельно с сарколизином алкеран применяется при терапии большинства сарком и асцитических форм других опухолей [3, 4]; циклофосфан [5] применяется при лимфолейкозах и раке различной локализации.

Недостатки: алкеран и сарколизин слабо влияют на солидные формы опухолей; карциномы, меланомы, гепатомы, лейкозы [3, 4]. Неконцентрированные и нефиксированные в опухоли (рассеянные в организме) алкеран, сарколизин и циклофосфан концентрируются в печени от 20 до 40%, в селезенке, костном мозге, почках и других органах ретикуло-эндотелиальной системы. Это ведет к токсикозу и понижению терапевтического эффекта. При применении алкерана, сарколизина и циклофосфана для терапии солидных форм карциномы Эрлиха и лимфоцитарной лейкемии Р388 существует опасность развития острой и хронической форм миелодепрессии, приводящей к понижению терапевтического эффекта [5] и ранней гибели экспериментальных животных.

Известен способ термохимиотерапии опухолей в эксперименте (прототип) [8], при котором млекопитающее после внутриопухолевого введения магнитоуправляемого противоопухолевого препарата размещают в постоянном магнитном поле для концентрирования и фиксации препарата. После этого млекопитающее ориентируют так, чтобы опухоль находилась в пространстве максимальной напряженности переменного магнитного поля, прошедшего через слой воды с постоянной температурой, и выдерживают заданное время с последующими повторениями процедуры от 3 до 9 сеансов с 3-6 дневными перерывами. Температура среды, окружающей млекопитающее, поддерживается на уровне +36°С, температура опухоли 44-46°С. При этом способе терапии лимфоцитарной лейкемии Р388 полная регрессия опухолей наблюдается у 30% мышей, удлинение продолжительности жизни (УПЖ) 180% [7].

Прототип имеет следующие недостатки:

- наблюдается лишь частичный некроз опухолевых клеток, глубоко инвазировавших в здоровые ткани, продукты некроза опухолевых тканей и остатки препаратов всасываются из разрушенной опухоли, вызывают токсикоз, нарушают гомеостаз и снижают иммунитет, это ведет к понижению терапевтического эффекта. На поздних стадиях канцерогенеза, после 2-3 месячной ремиссии, у большинства мышей наблюдается рецидив карциномы Эрлиха и лимфоцитарной лейкемии Р388 как результат инвазии и метастазирования первичных опухолей.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков, повышение терапевтического эффекта и обеспечение безопасности лечения млекопитающих.

Указанная задача решается тем, что температуру внутри опухоли повышают до +47-+70°С, образовавшиеся при нагреве продукты некроза опухолевых тканей удаляют промыванием раствором антисептика. В подкожные метастазы по мере их обнаружения вводят цитостатические средства. При обнаружении асцита цитостатические средства вводят внутрибрюшинно. При обнаружении метастазов внутренних органов цитостатические средства вводят внутривенно.

Способ осуществляется следующим образом: на 3-9 день после инокуляции опухолевых клеток под кожу правой лопатки мыши, когда объем опухоли достигает 100-300 мм³, вводят с четырех сторон в опухоль от 30 до 100 мкл раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата [содержание γ-Fe₂О₃ от 3,6 до 54 мг, содержание цитостатического средства от 0,4 до 6 мкг, удельная намагниченность насыщения (M_s) 7.5 kA/m, pH 6.6, электрокинетический потенциал (ζ) +15 mV, удельная абсорбция электромагнитной энергии 260 Вт/г Fe]. Ориентируют опухоль в неоднородном постоянном магнитном поле индукцией 0,2-4,0 Тл, градиент 0,015-0,3 Тл/см так, чтобы она была коаксильна силовым линиям неоднородного постоянного магнитного поля, и выдерживают 3-6 мин для концентрации и фиксации феррита и цитостатического средства в опухоли. Далее опухоль ориентируют в переменном магнитном поле (частота 0,01-1,0 МГц, напряженность 7,2 кА/м - 12,0 кА/м, мощность 0,15-15 кВт), пропущенном через слой воды толщиной 0,001-2,0 мм с постоянной температурой (магнитотермостатирование), введенный феррит индукционно нагревается, одновременно активируются цитостатические средства. Одновременно с нагревом непрерывно измеряют температуру опухоли и тела животного. Через 3-15 минут температура внутри опухоли повышается до +47-+70°С, выдерживают от 3 до 30 мин (в зависимости от индуктивности и мощности генератора). Сразу после завершения нагрева полость, образовавшуюся на месте опухоли, промывают раствором антисептического средства. Через каждые 3-6 суток процедуру термохимиотерапии повторяют, всего от 3 до 6 раз в зависимости от физического состояния млекопитающего. Опухоль к этому сроку обычно не прощупывается. В подкожные метастазы по мере их обнаружения вводят цитостатические средства. При обнаружении асцита цитостатические средства вводят внутрибрюшинно. При обнаружении метастазов внутренних органов проводят внутрисосудистое введение цитостатических средств.

При оценке противоопухолевой активности и долечивании придерживаются рекомендаций по химиотерапии злокачественных опухолей [3]. Статистический анализ проводят по рекомендациям, представленным [9]. Все полученные данные обрабатывают статистически по рекомендованным критериям, за достоверные принимают различия при р<0,05 [9].

Температуру определяют в опухоли и в прямой кишке непрерывно и одновременно. В предварительных опытах in vitro определяют оптимальные параметры постоянного и переменного магнитных полей при концентрации, фиксации и индукционном нагреве магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство, в фантоме опухоли и in vivo на экспериментальных животных: мыши, крысы, кролики, собаки.

Предлагаемый способ иллюстрируется примерами 1-3.

Пример 1. Противоопухолевый эффект разрабатываемого способа на подкожную форму карциномы Эрлиха в зависимости от вида терапевтических процедур.

50 Мышам под кожу правой лопатки вводят суспензию 10⁶ клеток карциномы Эрлиха, делят мышей на 5 равных группы: 1, 2, 3, 4 и 5. Лечение начинают, когда средний объем опухоли достигает 45 мм³:

- мышам 1 группы в опухоль вводят с четырех сторон 30 мкл 0,9% раствора NaCl;

- мышам 2 группы в опухоль вводят 30 мкл золя цитостатического средства (содержание алкерана 4 мкг);

- мышам 3 группы в опухоль вводят с четырех сторон 30 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг);

- мышам 4 группы в опухоль вводят с четырех сторон 30 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание алкерана 4 мкг, M_s 7.5 kA/m, pH 6.6, ζ +15 mV);

- мышам 5 группы в опухоль вводят с четырех сторон 30 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание алкерана 4 мкг, M_s 7.5 kA/m, pH 6.6, ζ +15 mV).

Мышей 1, 2, 3, 4 и 5 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см, далее опухоль каждой мыши 1, 2, 3, 4 и 5 групп ориентируют в переменном магнитном поле (частота 0,01-1,0 МГц, напряженность 12,0 кА/м, мощность 0,15 кВт), пропущенном через слой воды толщиной 2,0 мм с постоянной температурой (магнитотермостатирование), введенный феррит индукционно нагревается.

Температура опухоли у мышей 1 и 2 групп под действием переменного магнитного поля в течение 5 мин поднимается выше +38°С. Температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 и 2 групп в течение 30 минут поддерживается между +38-+40°С.

Температура опухоли у мышей 3 и 4 групп, под действием переменного магнитного поля в течение 5 мин поднимается выше +43°С. Далее у мышей 3 и 4 групп температура внутри опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +47°С, температура тела +40°С.

Температура опухоли у мышей 5 группы под действием переменного магнитного поля в течение 5 мин поднимается выше +43°С. Далее у мышей 5 группы температура внутри опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +47°С, температура тела +40°С, после завершения нагрева полость, образовавшуюся на месте опухоли, промывают 0,05% раствором формальдегида в 0,9% растворе NaCl для удаления продуктов некроза опухолевых тканей и остатков препаратов.

В 1, 2, 3, 4 и 5 группах проводят по 6 процедур термохимиотерапии (табл.1). В результате получают:

- в 1 группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии, за это время все мыши гибнут от прогрессирования опухолей;

- во второй группе средний объем опухолей резко уменьшается, в паховой области 6 мышей обнаруживаются метастазы. В метастазы вводят по 1,5 мкг алкерана с целью их подавления. Полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 110%;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, в паховой области 5 мышей обнаружены метастазы, в метастазы вводят по 1,5 мкг алкерана, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 120%;

- в четвертой группе средний объем опухолей с первого дня лечения резко уменьшается, в паховой области 3 мышей обнаружены метастазы, в метастазы вводят по 1,5 мкг алкерана, после завершения терапии полная регрессия опухолей наблюдается у 3 из 10 мышей, опухоли не обнаруживаются в течение 3 месяцев, увеличение продолжительности жизни мышей 170%;

- в пятой группе средний объем опухолей с первого дня лечения резко уменьшается, в паховой области 2 мышей обнаружены метастазы, в метастазы вводят по 1,5 мкг алкерана, после завершения терапии полная регрессия опухолей наблюдается у 4 из 10 мышей, опухоли не обнаруживаются в течение 3 месяцев, увеличение продолжительности жизни мышей 210%, как следует из таблицы 1.

Таким образом, одновременное индукционное нагревание тела с преимущественным по скорости и величине нагревом тканей опухоли, в которые введен магнитоуправляемый препарат, содержащий цитостатическое средство, с последующим промыванием полости, образовавшейся на месте опухоли, от продуктов некроза и остатков препаратов с введением цитостатических средств в метастазы по мере их обнаружения приводит к быстрому уменьшению объема опухолей, их полной регрессии и удлинению продолжительности жизни млекопитающих.

Предпочтительна термохимиотерапия опухоли при +47°С 6×30 мин с интервалом 3 суток, с последующим промыванием полости, образовавшейся на месте опухоли, от продуктов некроза и остатков препаратов с введением в метастазы по мере их обнаружения цитостатических средств, при которой получен максимальный терапевтический эффект (табл.1).

Пример 2. Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лимфоцитарной лейкемии Р388 в зависимости от числа сеансов терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.

60 Мышам под кожу правой лопатки вводят суспензию 10⁶ клеток лимфоцитарной лейкемии Р388, делят мышей на 6 равных групп: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. На 3-4 сутки после прививки, когда средний диаметр опухоли достигает 5 мм, мышам 1 группы в опухоль вводят с четырех сторон 30 мкл 0,9% раствора NaCl. Мышам 2, 3, 4, 5 и 6 групп в опухоль вводят с четырех сторон 100 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание сарколизина 4 мкг, M_s 7.5 kA/m, pH 6.6, ζ +15 mV). Мышей 1, 2, 3, 4, 5 и 6 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. Каждую мышь 1, 2, 3, 4, 5 и 6 групп аналогично примеру 1 магнитотермостатируют и помещают в переменное магнитное поле, опухоль нагревают, после завершения нагрева полость, образовавшуюся на месте опухоли, промывают 0,05% раствором формальдегида в 0,9% растворе NaCl, в метастазы по мере их обнаружения вводят по 1,5 мкг алкерана. Температура опухоли у мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп под действием переменного магнитного поля в течение 5 мин поднимается выше +42°С. Температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) остается между +38-+39°С. У мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп температура внутри опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +50°С. Процедуру термохимиотерапии у мышей 2 группы проводят 1 раз, 3 группы - 3 раза, 4 группы - 5 раз, 5 группы - 6 раз, 6 группы - 9 раз с интервалом 3 суток (табл.2).

В результате получают:

- в 1 (контрольной) группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии;

- во второй группе средний объем опухолей уменьшается медленно, у 3 мышей обнаружены метастазы подмышечных лимфатических узлов, в метастазы ввели по 1,5 мкг сарколизина, и у 2 мышей обнаружен асцит, внутрибрюшинно ввели 2 мкг циклофосфана, увеличение продолжительности жизни 120%;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, у 2 мышей обнаружен асцит, внутрибрюшинно ввели 2 мкг циклофосфана, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 160%;

- в четвертой группе средний объем опухолей с первого дня лечения уменьшается, и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, полная регрессия опухоли наблюдается у 3 из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 200%;

- в пятой группе полная регрессия опухоли наблюдается у 4 из 10 мышей, у 1 мыши обнаружен асцит, внутрибрюшинно ввели 2 мкг циклофосфана, увеличение продолжительности жизни мышей 220%;

- в шестой группе полная регрессия опухоли наблюдается у 6 из 10 мышей, у 2 мышей обнаружен асцит, внутрибрюшинно ввели 2 мкг циклофосфана, увеличение продолжительности жизни мышей 170%, животные погибли из-за развившейся дистрофии.

Таким образом, в соответствие с таблицей 2 максимальный терапевтический эффект дает термохимиотерапия опухоли при +50°С 6×30 мин с последующим промыванием опухоли от продуктов некроза и остатков препаратов при введении цитостатических средств в обнаруживаемые по ходу лечения метастазы.

Пример 3. Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму карциномы Эрлиха в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.

50 Мышам подкожно вводят суспензию 10⁶ клеток карциномы Эрлиха и делят их на 5 равных групп. Когда средний диаметр опухоли достигает 3 мм (около 5 суток), у мышей измеряют температуру в прямой кишке. Мышам 1 (контрольной) группы в опухоль вводят 30 мкл 0,9% раствора NaCl. Мышам 2, 3, 4 и 5 групп в опухоль вводят 30 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание алкерана 4 мкг, M_s 7.5 kA/m, pH 6.6, ζ +15 mV), и мышей помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см.

Каждую мышь 2, 3, 4, и 5 групп, как в 1 примере, магнитотермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура опухоли у мышей 2, 3, 4 и 5 групп под действием переменного магнитного поля в течение 5 мин поднимается выше +42°С. В то же время температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) остается между +38-+39°С. У мышей 2, 3, 4 и 5 групп температура внутри опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +70°С, через 3 минуты нагрев прекращают. После окончания нагрева образовавшуюся на месте опухоли полость промывают 0,3% раствором формальдегида в 0,9% растворе NaCl, в метастазы по мере их обнаружения вводят по 1,5 мкг алкерана, как в примере 1.

Процедуру термохимиотерапии проводят:

- мышам 1 группы 6 раз;

- мышам 2 группы 1 раз;

- мышам 3 группы 4 раза;

- мышам 4 группы 6 раз;

- мышам 5 группы 9 раз с интервалом 3 суток (табл.3).

В результате получают:

- в 1 (контрольной) группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии;

- во второй группе средний объем опухолей уменьшается медленно, у 3 мышей обнаруживаются метастазы, увеличение продолжительности жизни 130%;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, полная регрессия опухоли наблюдается у двух из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 180%;

- в четвертой группе средний объем опухолей с первого дня лечения уменьшается, и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, у 2 мышей обнаруживаются метастазы в подмышечные лимфатические узлы, полная регрессия опухоли наблюдается у 4 из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 220%;

- в пятой группе увеличивается до 6 число мышей с полной регрессией опухолей, но из-за дистрофии наблюдается снижение, увеличения продолжительности жизни до 190% по сравнению с четвертой группой, у одной мыши обнаружено метастазирование опухоли в правый пах, в лимфатические узлы паха ввели 2 мкг циклофосфана,

Таким образом, в соответствии с примером 3 предпочтительна термохимиотерапия опухоли при +70°С 6×3 мин с интервалом 3 суток, с последующим промыванием образовавшейся полости 0,05% раствором формальдегида в 0,9% растворе NaCl, при которой получен максимальный терапевтический эффект.

Приведенные экспериментальные результаты (примеры 1-3, таблицы 1-3) подтверждают высокий противоопухолевый эффект термохимиотерапии опухолей, включающей регионарное введение магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего алкеран или сарколизин, при одновременном нагреве тела до 40°С с преимущественным по скорости и величине нагревом опухоли до +47-+70°С, с последующим промыванием полости, образовавшейся на месте опухоли, от продуктов некроза опухолевых тканей и остатков препаратов и с введением цитостатических средств в метастазы по мере их обнаружения.

Таким образом, одновременное индукционное нагревание тела с преимущественным по скорости и величине нагревом тканей опухоли, содержащих магнитоуправляемый препарат и цитостатическое средство, с последующим промыванием полости на месте опухоли от продуктов некроза и остатков препаратов, введение цитостатических средств в метастазы приводит к быстрому уменьшению объема опухолей, их полной регрессии и удлинению продолжительности жизни млекопитающих.

Предпочтительна термохимиотерапия опухоли при +47-+50°С 6×30 мин и при +70°С 6×3 мин с интервалом 3 суток, с введением в метастазы по мере их обнаружения цитостатических средств, при которой получен максимальный терапевтический эффект (примеры 1-3, таблицы 1-3).

Пример 4. Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лекарственно-устойчивой карциномы Льюис в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.

50 мышам в мышцу бедра правой конечности вводят суспензию 10⁶ клеток карциномы Льюис и делят их на 5 равных групп. Когда средний диаметр опухоли достигает 3 мм (около 5 суток), у мышей измеряют температуру в прямой кишке. Мышам 1 (контрольной) группы в опухоль и окружающие ткани вводят 30 мкл 0,9% раствора NaCl. Мышам 2, 3, 4 и 5 групп в опухоль и окружающие ткани вводят 30 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатические средства (сарколизин, эмбихин и циклофосфан). Содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание сарколизина 2 мкг, содержание эмбихина 2 мкг, содержание циклофосфана 2 мг M_s 7,5 kA/m, pH 5,7, ζ +14 mV и мышей помещают на 2 минуты в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см.

Каждую мышь 1, 2, 3, 4, и 5 групп, как в 1 примере, магнитотермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) +38-+39°С. Температура в опухоли мышей 2, 3, 4 и 5 групп под действием переменного магнитного поля в течение 5 минут поднимается выше +42°С. У мышей 2, 3, 4 и 5 групп температура внутри опухоли продолжает повышаться и через 10 мин достигает +70°С. Через 5 минут нагревание опухоли прекращают. После окончания нагрева образовавшуюся на месте опухоли полость промывают 0,3% раствором формальдегида в 0,9% растворе NaCl, в метастазы по мере их обнаружения в процессе магнитнорезонансной томографии вводят смесь, содержащую 1 мкг алкерана, 1 мкг эмбихина и 1 мг циклофосфана.

Процедуру термохимиотерапии проводят:

- мышам 1 группы 6 раз;

- мышам 2 группы 1 раз;

- мышам 3 группы 4 раза;

- мышам 4 группы 6 раз;

- мышам 5 группы 9 раз с интервалом 3 суток (таблица 4).

В результате получают:

- в 1 (контрольной) группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии;

- во второй группе средний объем опухолей уменьшается медленно, у 2 мышей обнаруживаются метастазы, увеличение продолжительности жизни 110%;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 160%;

- в четвертой группе средний объем опухолей с первого дня лечения уменьшается, и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, у 2 мышей обнаруживаются метастазы в паховых лимфатических узлах, полная регрессия опухоли наблюдается у 2 из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 180%;

- в пятой группе число мышей с полной регрессией опухолей увеличивается до 3, у одной мыши обнаружено метастазирование опухоли в лимфатические узлы правого паха, в лимфатические узлы паха ввели смесь, содержащую 1 мкг алкерана, 1 мкг эмбихина и 1 мг циклофосфана, увеличение продолжительности жизни до 180%.

При патологоанатомическом исследовании павших мышей 1, 2, 3 группы обнаружены множественные метастазы: легких, пищевода, почек, мочевого пузыря, кишечника и других органов. В тушках мышей 4 и 5 групп обнаружены одиночные метастазы лимфатической системы, в опухолях мышей 4 и 5 групп обнаруживаются участки тканей, подвергшиеся карбонизации.

Таким образом, в соответствие с примером 4 для лекарственно устойчивых опухолей предпочтительна термохимиотерапия магнитоуправляемыми препаратами, включающими несколько цитостатических средств при +70°С 6×5 минут с интервалом 3 суток, с последующим промыванием образовавшейся полости 0,3% раствором формальдегида в 0,9% растворе NaCl, при которой получен максимальный терапевтический эффект.

Приведенные экспериментальные результаты в примере 4 и таблице 4 подтверждают высокий противоопухолевый эффект термохимиотерапии опухолей, включающей регионарное введение магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего сарколизин, эмбихин и циклофосфан, при одновременном нагреве тела до 40°С с преимущественным по скорости и величине нагревом опухоли до +47-+70°С и последующим промыванием полости, образовавшейся на месте опухоли, от продуктов некроза опухолевых тканей и остатков препаратов, и с введением алкерана, эмбихина и циклофосфана в метастазы по мере их обнаружения.

Таким образом, одновременное индукционное нагревание тела с преимущественным по скорости и величине нагревом тканей опухоли, содержащих магнитоуправляемый препарат с цитостатическими средствами, с последующим промыванием полости на месте опухоли от продуктов некроза и остатков препаратов, введение цитостатических средств в метастазы приводит к быстрому уменьшению объема опухолей, их полной регрессии и удлинению продолжительности жизни млекопитающих.

Предпочтительна термохимиотерапия опухоли магнитоуправляемым противоопухолевым препаратом, содержащим: декстранферрит, сарколизин, эмбихин и циклофосфан при +47-+50°С 6×30 мин и при +60-+70°С 6×5 мин с интервалом 3 суток, с введением в метастазы по мере их обнаружения цитостатических средств, при которой получен максимальный терапевтический эффект (примеры 1-4, таблицы 1-4).

Таблица 1Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму карциномы Эрлиха в зависимости от вида терапевтических процедур, включающих внутриопухолевые инъекции в 1 группе - 0,9% NaCl; во 2 группе - алкеран и введение алкерана в метастазы; в 3 группе - декстранферрит, фиксацию в неоднородном постоянном магнитном поле, нагрев в переменном магнитном поле и введение алкерана в метастазы; в 4 группе - декстранферрит - алкеран, фиксацию в неоднородном постоянном магнитном поле, нагрев в переменном магнитном поле и введение алкерана в метастазы; в 5 группе - декстранферрит - алкеран, фиксацию в неоднородном постоянном магнитном поле, нагрев в переменном магнитном поле с последующим удалением продуктов некроза и остатков препаратов и введение алкерана в метастазы.ГруппаЧисло процедурСредний объем опухоли до лечения (мм³)Средний объем опухоли после завершения лечения (мм³)Полная регрессия опухоли (%)Число мышей с метастазами (голов)УПЖ* (%)1. (контроль)645,00±15630,00±203,20-02. (алкеран 4 мкг)645,00±151,60±0,52061103. (γ-Fe₂O₃ 36 мг)645,00±154,00±1,31061204. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, алкерана 4 мкг)645,00±15не прощупывается3031705. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, алкерана 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)645,00±15не прощупывается402210* Средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖ_опыт-СПЖ_контр)/СПЖ_контр]×100%.

Таблица 1 показывает:

- в 1 группе мышей (контроль) после 6 процедур, имитирующих заявленный способ, средний объем опухоли увеличивается до 630±203,2 мм³, все мыши пали от прогрессирования опухолей;

- во 2 группе мышей после 6 процедур, имитирующих заявленный способ, средний объем опухоли уменьшается до 1,6±0,5 мм³, у 6 мышей обнаруживаются метастазы, у 20% мышей наблюдается полная регрессия опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей возрастает до 110%;

- в 3 группе мышей после 6 процедур, имитирующих заявленный способ, средний объем опухоли уменьшается до 4±1,3 мм³, у 6 мышей обнаруживаются метастазы, у 10% мышей наблюдается полная регрессия опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей возрастает до 120%;

- в 4 группе мышей после 6 процедур, имитирующих заявленный способ, опухоль не прощупывается, поэтому средний объем опухоли не определяется, у 3 мышей обнаруживаются метастазы, у 30% мышей наблюдается полная регрессия опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей возрастает до 170%;

- в 5 группе мышей после 6 процедур, проведенных по заявленному способу, опухоль не прощупывается, средний объем опухоли не определяется, у 1 мыши обнаруживаются метастазы, у 40% мышей наблюдается полная регрессия опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей возрастает до 210%.

Таблица 2Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лимфоцитарной лейкемии Р388 в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.ГруппаЧисло процедурСредний объем опухоли (мм³)Относительный* объем опухоли (мм³)Число мышей с метастазами (гол)Полная регрессия опухоли (%)УПЖ** (%)1. (контроль)6460,00±1501,000 002. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизин 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)118,000±6,00,390501203. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизин 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)39,002±3,00,2002101604. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизин 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)51,000±0,30,0203302005. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизин 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)6не прощупываетсяне прощупывается1402206. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизин 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)9не прощупываетсяне прощупывается260170* Относительный объем опухоли = (средний объем опухоли в каждой группе)/(средний объем опухоли в 1 группе).** Средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖ_опыт-СПЖ_контр)/СПЖ_контр]×100%.

Таблица 3Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму карциномы Эрлиха в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.ГруппаЧисло процедурСредний объем опухоли (мм³)Относительный* объем опухоли (мм³)Число мышей с метастазами (голов)Полная регрессия опухоли (%)**УПЖ (%)1. (контроль)6620,001,000 002. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, алкерана 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)120,3000,483301303.(γ-Fe₂O₃ 36 мг, алкерана 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)41,0000,023-201704. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, алкерана 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)6не прощупываетсяне прощупывается2402105. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, алкерана 4 мкг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)9не прощупываетсяне прощупывается160190* Относительный объем опухоли = (средний объем опухоли в каждой группе)/(средний объем опухоли в 1 группе).** Средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖ_опыт-СПЖ_контр)/СПЖ_контр]×100%.

Таблица 4Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лекарственно-устойчивой карциномы Льюис в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.ГруппаЧисло процедурСредний объем опухоли (мм³)Относительный* объем опухоли (мм³)Число мышей с метастазами (голов)Полная регрессия опухоли (%)**УПЖ (%)1. (Контроль)6530,001,000-002. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизина 2 мкг, эмбихина 2 мкг, циклофосфана 2 мг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)130,6000,060301103. (γ-Fe₂О₃ 36 мг, сарколизина 2 мкг, эмбихина 2 мкг, циклофосфана 2 мг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)43,0000,0063101604. (γ-Fe₂О₃ 36 мг, сарколизина 2 мкг, эмбихина 2 мкг, циклофосфана 2 мг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)6не прощупываетсяне прощупывается2201805. (γ-Fe₂O₃ 36 мг, сарколизина 2 мкг, эмбихина 2 мкг, циклофосфана 2 мг с удалением продуктов некроза и остатков препаратов)9не прощупываетсяне прощупывается130180* Относительный объем опухоли = (средний объем опухоли в каждой группе)/(средний объем опухоли в 1 группе).** Средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖ_опыт-СПЖ_контр)/СПЖ_контр]×100%.

Неравноценность заявленных температурных режимов

В предварительных опытах нами установлено, что при температуре +47°С гибель различных опухолевых клеток, находящихся во всех фазах клеточного цикла, происходит за 20-30 минут. На основании этого проводится лечение мышей по данной заявке, примеры: 1, 2 и таблицы 1, 2.

При +70°С гибель различных опухолевых клеток, находящихся во всех фазах клеточного цикла, происходит за 1-3 минуты. На основании этого проводится лечение мышей по данной заявке, пример 3 и таблица 3, кроме того, в ответе по данной заявке полученные результаты подтверждаются примером 4 и таблицей 4.

Новизна заявленного способа термохимиотерапии опухолей

Новизна заявленного способа термохимиотерапии опухолей заключается в приготовлении магнитоуправляемого препарата смешиванием коллоидных растворов: декстранферрита, сарколизина, эмбихина и циклофосфана непосредственно перед введением в опухоль и введение полученной смеси прямо в опухоль и в окружающие опухоль ткани.

Необходимость приготовления смеси extempore (непосредственно перед применением) объясняется понижением противоопухолевой активности магнитоуправляемого препарата при хранении.

Необходимость введения инъекционной формы магнитоуправляемого препарата прямо в опухоль и в окружающие опухоль ткани объясняется атипичностью сосудов опухоли и окружающих ее тканей (по таким сосудам препараты не попадают в опухолевые клетки).

Индукционное нагревание опухоли при +47-+70°С магнитоуправляемым препаратом, содержащим декстранферрит-сарколизин-эмбихин-циклофосфан, приводит к полному разрушению и частичной карбонизации опухолевой ткани.

Неочевидность предложенного способа термохимиотерапии опухолей

Многие алкилирующие препараты, содержащие бис-дихлордиэтиламиногруппы, проявляют высокую противоопухолевую активность, к таким веществам относятся цитостатики: сарколизин, эмбихин и циклофосфан. Многолетние (1977-2000 гг.) попытки создания магнитоуправляемых противоопухолевых препаратов на основе сарколизина, эмбихина и циклофосфана [1-7] оказались безуспешными. При введении в реакционную смесь высокодисперсного железа или его окислов с целью получения магнитоуправляемых препаратов, содержащих бис-дихлордиэтиламиногруппы, обладающие высокой противоопухолевой активностью, и поэтому чаще всего применяемых в онкологии, получались вещества, которые не обладали противоопухолевой активностью [1-6]. Анализ полученных результатов показал, что сарколизин, эмбихин и циклофосфан обладают высокой химической активностью. При хранении в присутствии воды (влаги) они взаимодействуют с молекулами воды и гидролизуются с выделением ионов С1, при этом их противоопухолевая активность уменьшается. Поэтому водные растворы этих препаратов не хранят, их используют extempore.

В химических соединениях, в растворах и в порошках в присутствии железа сарколизин, эмбихин и циклофосфан постепенно инактивируются [1-3]. Поэтому в предложенном способе в качестве магнитного носителя используют декстранферрит. Чтобы исключить контакт сарколизина, эмбихина и циклофосфана с ферритовыми ядрами декстранферрита, ферритовые ядра диаметром 10 нм покрывают слоем декстрана толщиной 110-130 нм и получают ионосферы декстранферрита диаметром 220-260 нм [2, 3]. Чтобы исключить частичный гидролиз сарколизина, эмбихина и циклофосфана, в процессе приготовления комбинированного магнитоуправляемого препарата «декстранферрит-сарколизин-эмбихин-циклофосфан» предварительно готовят коллоидные растворы декстранферрита, сарколизина, эмбихина и циклофосфана, которые смешивают непосредственно перед введением в опухоль и в окружающие опухоль ткани.

Таким образом, положительный технический результат получают при учете лабильности бис-дихлордиэтиламиновых группировок, разрушающихся при взаимодействии с водой и препаратами железа [1-6]. На основе этого разработан предложенный способ термохимиотерапии опухолей, в котором используют приемы, предупреждающие разрушение бис-дихлордиэтиламиновых группировок.

Неожиданный технический результат

В результате многолетних исследований получены магнитоуправляемые носители, определены основные параметры электромагнитного поля и подобраны условия проведения термохимиотерапии опухолей [1-7]. В процессе термохимиотерапии опухолей в неоднородном постоянном магнитном поле концентрируют и фиксируют в опухоли наночастицы декстранферрита вместе с сарколизином, эмбихином и циклофосфаном. В переменном магнитном поле индукционно нагревают наночастицы декстранферрита и опухолевые ткани до +70°С. Происходит плавление мембранных липидов и активирование сарколизина, эмбихина и циклофосфана, при котором разрушаются мембраны опухолевых клеток. В процессе разрушения мембран содержимое клеток, включающее эндоферменты, выливается в межклеточное пространство и смешивается с магнитоуправляемым препаратом. При этом проявляется синергический противоопухолевый эффект декстранферрита, сарколизина, эмбихина, циклофосфана и клеточных эндоферментов, который сопровождается полным разрушением клеток. Наблюдаемый эффект гибели опухолевых клеток на порядок превышает эффект от декстранферрита, сарколизина, эмбихина и циклофосфана. Это явление объясняется дополнительным некротизирующим действием содержимого клеток, высвобождаемого при разрушении клеточных мембран и вызывающего обширный некроз опухолевых тканей. Резко уменьшаются размеры опухолей, через 6 сеансов термохимиотерапии опухоли не пальпируются.

По предложенному способу полная регрессия опухолей наблюдается у 40% млекопитающих, удлинение продолжительности жизни до 220% (примеры 1-4, таблицы 1-4). Полученный противоопухолевый эффект превосходит эффекты противопоставленных способов [8].

Использованная литература

1. Брусенцов Н.А. От сарколизина к алкерану. Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. 1991, т.36, N 3, с.353-355.

2. Brusentsov N.A., Brusentsova T.N., Baryshnikov A. Yu. et al. Magnetic carriers biological preparations for diagnostics and therapy of cancer diseases, in book, Biocatalytic Technology and Nanotechnology, G.E.Zaikov, (Eds) Nova Science Publishers, Inc., (2004), 59-63.

3. Брусенцов Н.А. Принципы создания композитных противоопухолевых препаратов. Хим.-Фарм. Ж. 30 (9), 3-11 (1996).

4. Брусенцов Н.А., Гогосов В.В., Лукашевич М.В. Физические и химические критерии ферримагнетиков для биомедицинских целей. Хим.-Фарм. Ж. 1996, 6, N 10, с.48-53.

5. Брусенцов Н.А. Возможности и перспективы применения транспортных и магнитоуправляемых депоформ противоопухолевых препаратов. Ж. Всес.Хим. О. им. Д.И. Менделеева 32 (5), 562-569 (1987).

6. Брусенцов Н.А., Лыков В.В. Управляемые композиционные материалы в биологии и медицине. Ж. Всес. Хим. О. им. Д.И.Менделеева 34 (5), 566-572 (1989).

7. Брусенцов Н.А. Дизайн систем для лечения больных онкологическими заболеваниями. Ж. Всес. Хим. О. им. Д.И.Менделеева 35 (6), 759-766 (1990).

8. Брусенцов Н.А. и др. Реологические свойства и противоопухолевый эффект ферримагнитных жидкостей. Хим.-фарм. Ж. Т.33, №1, 1999, с.9-12.

9. Патент РФ №2222261, 27.03.(2002), опубликован 27.01.2004, Бюл. №3.

10. Одарюк Т.С. и др. Хирургия рака прямой кишки. Изд. Дедалус, 2005 г., 136-139.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано при экспериментальном лечении опухолей путем проведения термохимиотерапии. Для этого в опухоль вводят раствор магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатические средства. Затем препарат концентрируют в опухоли путем воздействия на нее неоднородным постоянным магнитным полем, с последующим индукционным нагреванием опухоли в переменном магнитном поле. После этого температуру в опухоли поддерживают на уровне +47-+70°С. Затем некротизированные ткани удаляют раствором антисептика. В метастазы вводят цитостатические средства. Способ позволяет повысить продолжительность жизни млекопитающих, а также значительно уменьшить объем опухоли за счет нагрева тканей опухоли до такой температуры, при которой активируются цитостатические средства, содержащиеся в магнитоуправляемом препарате, и происходит разрушение мембран опухолевых клеток, независимо от фазы клеточного цикла. 4 табл.

Способ термохимиотерапии опухолей в эксперименте, включающий регионарное введение магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатические средства, концентрацию препарата в опухоли неоднородным постоянным магнитным полем, нагрев опухоли в переменном магнитном поле, отличающийся тем, что температуру в опухоли поддерживают на уровне (+47)-(+70)°С, некротизированные ткани удаляют раствором антисептика, в метастазы вводят цитостатические средства.