СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРИОННОГО БЕЛКА ИЗ ПРОДУКТОВ КРОВИ Российский патент 2011 года по МПК A61M1/36 A61K35/14 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу удаления патологического прионного белка из продукта крови. В частности, настоящее изобретение относится к способу селективного удаления патологического прионного белка, который может присутствовать в продукте крови, таком как цельная кровь, концентрированный раствор эритроцитов или тромбоцитов.

Уровень техники

Трансмиссивная губчатая энцефалопатия (TSE) или прионная болезнь вызывает смертельные нейродегенеративные заболевания у людей и других млекопитающих. Наиболее известны скрейпи овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE). Болезни человека включают спорадическую болезнь Крейцфельда-Якоба (sCJD), ятрогенную болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера (GSS), фатальную семейную бессонницу (FFI) и куру. Прионная болезнь может возникать в результате изменения конформации природного нормального прионного белка в вариантный патологический прионный белок (вариантный прионный белок может вызывать прионную болезнь), инфицирующий людей и других млекопитающих. Вариантный прионный белок обладает структурой, обогащенной β-слоями по сравнению с нормальным прионным белком, поэтому вариантный прионный белок обладает высокой гидрофобностью, легко образует мультимеры и устойчив к протеазе К.

В последнее время в нескольких работах было показано, что <вариантная> CJD, встречающаяся, как правило, в Великобритании, связана с потреблением говядины коров, зараженных BSE (непатентные документы 1 и 2). В этих работах было сделано предположение, что <вариантная> CJD может переноситься при употреблении в пищу говядины и передаваться от человека к человеку при переливания <продукта крови> или переноса вариантного прионного белка, присутствующего в тканевом трансплантате. В связи с этим в 2004 г. были описаны два случая инфицирования <вариантной> CJD реципиентов, получавшим донорную кровь, у которых развилась <вариантная> CJD после сдачи крови, и в 2006 г. был описан третий случай, так что существует высокая вероятность переноса <вариантной> CJD путем трансфузии. У многих людей, инфицированных CJD, болезнь не развивается, и продукты крови, полученные от таких людей, могут способствовать распространению инфекции. Таким образом, необходим способ удаления патологического прионного белка из продукта крови.

В области переливания крови распространено так называемое переливание крови, не содержащей лейкоцитов, когда переливают продукт крови после удаления лейкоцитов, содержащихся в крови. Эта процедура проводится, поскольку было выяснено, что побочные эффекты, такие как головная боль, тошнота, лихорадка и негемолитическая фебрильная реакция, сопровождающие переливание крови, тяжелые побочные эффекты, такие как аллоантигенная сенсибилизация, посттрансфузионное заболевание «трансплантат против хозяина» (GVHD) и вирусная инфекция, серьезно поражающие реципиента, как правило, обусловлены присутствием лейкоцитов в продукте крови, используемом при переливании. Способ фильтрации имеет ряд преимуществ, таких как высокая эффективность удаления лейкоцитов, простота в применении и низкая стоимость, поэтому он широко используется в качестве способа удаления лейкоцитов из <продукта крови>. При получении продукта крови кровь обычно фильтруют в центре крови и в последнее время эта процедура проводится перед хранением для достижения полного контроля качества продукта крови, не содержащего лейкоциты, способом фильтрации, то есть с использованием фильтра, удаляющего лейкоциты. Как правило, в случае, когда кровь фильтруют с помощью фильтра, удаляющего лейкоциты, в центре крови, пакет с кровью, содержащий продукт крови, подлежащий фильтрации, помещают на 70-150 см выше, чем пакет для сбора профильтрованного продукта крови, и продукт крови фильтруется под действием силы притяжения.

В качестве систем для получения продукта крови, не содержащего лейкоцитов, широко применяются два типа систем (типа SCD и встроенного типа). В случае применения системы типа SCD пакет, содержащий продукт крови, подлежащий удалению лейкоцитов, асептически соединяют с системой для удаления лейкоцитов. Таким образом, соединяются только фильтр для удаления лейкоцитов и пакет для сбора продукта крови после фильтрации. В случае встроенной системы процесс от забора крови у донора до получения продукта крови проводится в интегрированной системе, так что пакет с кровью обычно содержит раствор консерванта или антикоагулянт. Для стерилизации SCD-системы обычно применяется стерилизация облучением в связи с низкой стоимостью. Однако стерилизация облучением может привести к разложению раствора консерванта и антикоагулянта, поэтому для встроенной системы обычно применяется стерилизация автоклавированием.

Уровень гемолиза является одним из показателей качества продукта крови, содержащего эритроциты. Поставляемый высококачественный продукт крови, свободный от лейкоцитов, содержащий эритроциты, уровень гемолиза должен быть менее чем 0,8% (непатентный документ 3).

С точки зрения оперативности работы центра крови, стоимости и потерь продукта крови способ удаления патологического прионного белка из продукта крови предпочтительно представляет собой способ одновременного удаления патологического прионного белка и лейкоцитов.

В патентном документе 1 раскрыт полимер для покрытия материала фильтров для удаления лейкоцитов, содержащий элемент, происходящий из гидрофобного полимеризуемого мономера, элемент, происходящий из полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и элемент, происходящий из полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть в качестве материала, высокоэффективно удаляющего лейкоциты, но не раскрывается и не предлагается удаления патологического прионного белка. Фильтрация крови, не содержащей лейкоцитов, перед хранением в многих случаях включает как фильтрацию при комнатной температуре, при которой кровь фильтруют при комнатной температуре в течение одного дня после забора крови, так и фильтрацию при низкой температуре, при которой кровь фильтруют после хранения крови в холодильнике в течение 1-3 дней. В случае фильтрации при комнатной температуре большее количество лейкоцитов просачивается через фильтр, чем в случае охлажденной крови, несмотря на короткое время фильтрации, в то время как в случае фильтрации при низкой температуре фильтрация проводится в течение более длительного времени, и возможно до некоторой степени предотвратить протечку лейкоцитов через фильтр. Однако в патентном документе 1 не изучалось время фильтрации при низкой температуре.

В патентном документе 2 раскрыт способ образования комплекса прионного белка в биологической жидкости с полимерным матриксом, содержащим гидрофильную, гидрофобную или амфифильную функциональную группу, или с прион-связывающим веществом, содержащим окись алюминия или окись кремния. Однако этот комплекс не способен к удалению лейкоцитов, несмотря на то, что в примерах функциональная группа связана со смолой, и таким образом при фактическом использовании в центре крови необходимо применять фильтр для удаления лейкоцитов. При раздельном удалении лейкоцитов и патологических прионных белков могут увеличиваться потери продукта крови, затраты труда в центре крови и стоимость. Кроме того, известно, что окиси алюминия и кремния индуцируют активацию системы свертывания, а также демонстрируют высокую неселективную адсорбцию белков, и таким образом эти вещества не подходят для продукта крови.

В патентном документе 3 раскрыт способ удаления прионных белков из произвольного образца жидкости с использованием устройства, такого как проточной колонки и сферических полимерных бусин, чья поверхность покрыта агентом, образующим комплекс с прионом, такого как соль металла (такого как натрий) фосфовольфрамовой кислоты. Однако образец должен подвергаться воздействию агента, образующего комплекс, в течение достаточного времени для образования комплекса агента, образующего комплекс, с практически всеми патологическими прионными белками, содержащимися в образце. Например, образец инкубируют при температуре приблизительно 30-45°С (предпочтительно, 37°С) в течение приблизительно 1-16 часов. Однако температура 37°С является неподходящей для хранения продукта крови, и в общепринятом способе, использующем фильтр для удаления лейкоцитов, как правило, используется фильтрация при комнатной температуре или при пониженной температуре. Кроме того, в этом способе применяется фильтрация на основе силы притяжения, так что такой способ не подходит для удаления патологических прионных белков или лейкоцитов из продукта крови.

В патентном документе 4 раскрыт способ образования комплекса прионного белка и полимерного матрикса, содержащего гидрофильную, гидрофобную или амфифильную группу для удаления или обнаружения приона или прион-связывающее вещество, такое как окись алюминия или окись кремния. Однако прион-связывающее вещество, используемое в примерах, не способно к удалению лейкоцитов, и в случае раздельного удаления лейкоцитов и патологических прионных белков существует проблема увеличения потерь продукта крови, затрат труда в центре крови и стоимости. Кроме того, известно, что окиси алюминия и кремния индуцируют активацию системы свертывания, а также демонстрируют высокую неселективную адсорбцию белков, и таким образом эти вещества не подходят для продукта крови.

Таким образом, для удаления патологического прионного белка из продукта крови необходим простой и эффективный способ удаления патологического прионного белка из продукта крови, и кроме того, желательно, чтобы такой способ обеспечивал одновременное удаление патологического прионного белка и лейкоцитов.

[Непатентный документ 1] G. Chazot, et al., (1996) Lancet 347: 1181

[Непатентный документ 2] R.G. Will, et al., (1996) Lancet 347: 921-25

[Непатентный документ 3] Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components 9th edition/ Council of Europe Publishing

[Патентный документ 1] WO 03/011924

[Патентный документ 2] US 2005/0014196 A

[Патентный документ 3] JP 2002-539081 A

[Патентный документ 4] JP 2006-522344 A

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Ввиду вышеописанных проблем общепринятых технологий целью настоящего изобретения является разработка простого и эффективного способа удаления патологического прионного белка из продукта крови и способа одновременного удаления патологического прионного белка и лейкоцитов.

Пути решения задач

Авторы настоящего изобретения провели широкие исследования, в результате которых было обнаружено, что патологический прионный белок возможно очень просто и эффективно удалить из продукта крови с помощью фильтра, покрытого терполимером, включающим гидрофобный полимеризуемый мономер, полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть и полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть (неполимер, включающий любой один из этих мономеров), и таким образом выполнили настоящее изобретение. Таким образом, настоящее изобретение относится к:

(1) способу удаления патологического прионного белка из продукта крови, включающему: фильтрацию продукта крови через фильтр, заполненный носителем, покрытым полимером, образованным тремя элементами, включающими 20 молярных процентов или более и 40 молярных процентов или менее элемента, происходящего из гидрофобного полимеризуемого мономера, 5 молярных процентов или более и 13 молярных процентов или менее элемента, происходящего из полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть и элемента, происходящего из полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть в качестве баланса; и сбора профильтрованного продукта крови;

(2) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по вышеприведенному пункту (1), отличающийся тем, что продукт крови представляет собой продукт цельной крови, а фильтр подвергается стерилизации облучением и затем стерилизации автоклавированием;

(3) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по вышеприведенному пункту (2), отличающийся тем, что облучение представляет собой γ-лучи или электронные лучи;

(4) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (1)-(3), отличающийся тем, что полимер представляет собой полимер винилового типа;

(5) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (1)-(4), отличающийся тем, что гидрофобный полимеризуемый мономер, полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть и полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, представляют собой производные акриловой кислоты и/или производные метакриловой кислоты;

(6) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (1)-(5), отличающийся тем, что основная азотсодержащая группа представляет собой третичную аминогруппу;

(7) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (1)-(6), отличающийся тем, что протонная нейтральная гидрофильная группа представляет собой гидроксильную группу;

(8) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (1)-(7), отличающийся тем, что фильтр представляет собой фильтр для удаления лейкоцитов;

(9) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по вышеприведенному пункту (8), отличающийся тем, что носитель, покрытый полимером, представляет собой волокнистый материал или материал с губчатой структурой;

(10) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по вышеприведенному пункту (8) или (9), отличающийся тем, что удельная площадь носителя, покрытого полимером, составляет 1,0 м²/г или более и 5,0 м²/г или менее;

(11) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (8)-(10), отличающийся тем, что средний диаметр поры носителя составляет 1 мкм или более и 60 мкм или менее;

(12) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (8)-(11), отличающийся тем, что плотность заполнения носителем, покрытым полимером, составляет 0,1 г/см³ или более и 0,5 г/см³ или менее;

(13) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (8)-(12), отличающийся тем, что пористость носителя, покрытого полимером, составляет 60% или более и 90% или менее;

(14) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из вышеперечисленных пунктов (8)-(13), отличающийся тем, что носитель, покрытый полимером, представляет собой нетканый материал; и

(15) способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по вышеприведенному пункту (14), отличающийся тем, что диаметр волокна нетканого материала составляет 0,3 мкм или более и 3,0 мкм или менее.

Эффект изобретения

Согласно настоящему изобретению, возможно просто и эффективно удалять патологический прионный белок из продукта крови и одновременно удалять патологический прионный белок и лейкоциты. Кроме того, способ по настоящему изобретению может использоваться при получении высококачественного продукта крови, обладающего высокой текучестью и содержащего меньше гемолизированных клеток.

Краткое описание чертежей

На чертеже представлено схематическое изображение системы, посредством которой осуществляется настоящее изобретение.

Описание позиций на чертеже:

1: пакет с продуктом крови,

2: шланг,

3: фильтр,

4: пакет для сбора продукта крови после фильтрации.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение описано более детально.

Термин «полимер» в настоящем изобретении означает полимер (полимеры), включающий элемент, происходящий из гидрофобного полимеризуемого мономера, элемент, происходящий из полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и элемент, происходящий из полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть.

Термин «элемент» в настоящем изобретении означает минимальный повторяющийся элемент, происходящий из каждого полимеризуемого мономера в составе полимерной молекулы. Например, в случае полиприсоединения полимеризуемого мономера винилового соединения с формулой СH₂=CXY (X: H или заместитель, отличный от Н, Y: заместитель, отличный от Х) путем раскрытия двойной связи минимальный повторяющийся элемент представляет собой -(CH₂-CXY)-. В случае, когда полимер синтезируют путем поликонденсации из полимерного предшественника с формулой A-(R)-B (R: часть, не высвобождающаяся при полимеризации, А и В: части, высвобождающиеся во время реакции полимеризации), в качестве минимального повторяющегося элемента может приниматься -(R)-, когда А и В высвобождаются при полимеризации.

Примеры гидрофобного полимеризуемого мономера, в особенности с точки зрения доступности и простоты в использовании включают: стирен; метилстирен; акрилаты и метакрилаты, такие как метилакрилат, метилметакрилат, этилакрилат, этилметакрилат, бутилакрилат, бутилметакрилат, фенилакрилат, фенилметакрилат, этилгексилакрилат, этилгексилметакрилат, трихлорэтилакрилат и трихлорэтилметакрилат; алкены, такие как пентен, гексен, гептен и октен; органические соединения кремния, такие как силикон и силоксан; и фторорганические полимеризуемые мономеры, в которых хотя бы один атом водорода в составе этилена заменен на атом фтора. Однако гидрофобный полимеризуемый мономер не ограничивается веществами, приведенными выше. Из этих мономеров с точки зрения доступности и простоты в использовании предпочтительны мономеры, содержащие виниловую группу в качества полимеризуемой части, при полимеризации которых (виниловой полимеризации) образуется полимер винилового типа. Далее предпочтительные гидрофобные полимеризуемые мономеры представляют собой производные акриловой кислоты и производные метакриловой кислоты. Наиболее предпочтительные гидрофобные полимеризуемые мономеры представляют собой акрилаты и метакрилаты.

Материалы, содержащие основную азотсодержащую функциональную группу, имеют положительный заряд на поверхности в биологической жидкости, что дает эффект повышения эффективности удаления патологического прионного белка. Термин «полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть», в настоящем изобретении означает полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, описанный ниже. В качестве основной азотсодержащей группы может выступать первичная аминогруппа, вторичная аминогруппа, третичная аминогруппа, четвертичная аминогруппа, пиридиловая группа, имидазоиловая группа и другие. Предпочтительная основная азотсодержащая аминогруппа представляет собой третичную аминогруппу. Полимеризуемые мономеры, содержащие основную азотсодержащую часть с точки зрения доступности и простоты в использовании, включают виниловые производные азотсодержащих ароматических соединений, таких как виниламин, 2-винилпиридин, 4-винилпиридин, 2-метил-5-винилпиридин, 4-винилимидазол, N-винил-2-этилимидазол, и N-винил-2-метилимидазол; акрилаты и метакрилаты, такие как диметиламиноэтилакрилат, диметиламиноэтилметакрилат, диэтиламиноэтилакрилат, диэтиламиноэтилметакрилат, 3- диметиламино-2-гидроксипропилакрилат и 3-диметиламино-2-гидроксипропилметакрилат; амидные производные акриловой кислоты и метакриловой кислоты, такие как амид N,N- диметиламиноэтилакриловой кислоты, амид N,N-диметиламиноэтилметакриловой кислоты, амид N,N- диэтиламиноэтилакриловой кислоты, амид N,N- диэтиламиноэтилметакриловой кислоты и амид N,N-диметиламинопропилакриловой кислоты; производные стирена, такие как п-диметиламинометилстирен и п-диэтиламиноэтилстирен; и производные, такие как четвертичные аммониевые соли, полученные путем реакции полимеризуемого мономера с алкилгалидной группой. Однако полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, не ограничивается этими веществами. Из этих мономеров с точки зрения доступности и простоты в использовании, предпочтительны мономеры, содержащие виниловую группу в качестве полимеризуемой части, образующие полимер винилового типа путем полимеризации (виниловой полимеризации). В качестве полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, предпочтительны производные акриловой кислоты и метакриловой кислоты. Более предпочтительны в качестве полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, акрилаты и метакрилаты. Из этих веществ особенно предпочтительны диметиламиноэтилакрилат, диметиламиноэтилметакрилат, диэтиламиноэтилакрилат и диэтиламиноэтилметакрилат.

Термин «полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть», в настоящем изобретении означает мономер, чья неполимеризуемая часть диссоциирует с высвобождением протонов (Н⁺), и мономер, не обладающий сильной кислотностью или основностью, как карбоксильная кислота или основная аминогруппа. Полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, проявляет большие гидрофильные свойства по сравнению с мономером, содержащим непротонную нейтральную гидрофильную часть, и обладает прекрасными способностями к активации и предотвращению протока продукта крови. Примеры протонной нейтральной гидрофильной части включают гидроксильную группу, альдегидную группу, имеющую протон в α-положении и амидную группу, имеющую протон в α-положении и 1,3-дикарбониловую группу. В качестве неполимеризуемой протонной нейтральной гидрофильной части особенно предпочтительна гидроксильная группа. Примеры полимеризуемых мономеров, содержащих нейтральную гидрофильную часть, включают 2-гидроксиэтилметакрилат, гидроксипропилметакрилат, гидроксибутилакрилат, акриламид и метакриламид. Однако полимеризуемые мономеры, содержащие протонную нейтральную гидрофильную часть, не ограничиваются вышеперечисленными веществами. Из этих мономеров с точки зрения доступности и простоты в использовании, предпочтительны мономеры, содержащие виниловую группу в качестве полимеризуемой части, образующие полимер винилового типа путем полимеризации (виниловой полимеризации). Из этих мономеров в качестве полимеризуемых мономеров, содержащих протонную нейтральную гидрофильную часть, предпочтительны производные акриловой кислоты и производные метакриловой кислоты. В качестве полимеризуемых мономеров, содержащих протонную нейтральную гидрофильную часть, наиболее предпочтительны акрилаты и метакрилаты. Термин «полимер винилового типа» в настоящем изобретении означает полимер винилового типа в широком смысле, чья основная цепь не содержит циклов. Конкретные примеры включают α-замещенную полиакриловую кислоту и ее производные, поливиниловый эфир, поливиниловый спирт, поливиниловый сложный эфир, полистирен и его производные и также сополимеры, включающие эти полимеры, как описано в J. Brandrup; E.H. Immergut. 1989 “Polymer Hand book Third Edition” A Wiley-interscience publication, стр. VII-5 - VII-18.

Для удаления патологического прионного белка из продукта крови, содержащего компонент плазмы, необходимо использовать вышеупомянутый полимер, включающий три элемента, включающие элемент, происходящий из гидрофобного полимеризуемого мономера, элемент, происходящий из полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и элемент, происходящий из полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть. Даже при использовании полимера, содержащего только один из этих элементов, невозможно удалить патологический прионный белок с высокой эффективностью, и в особенности невозможно эффективно удалить патологический прионный белок из продукта крови, содержащего компонент плазмы.

Патологический прионный белок содержит три различные связывающие области, связывающееся с положительно заряженными функциональными группами, отрицательно заряженными функциональными группами и гидрофобными функциональными группами. При этом было показано, что изоэлектрической точке патологического прионного белка соответствует значение pH, равное 4,6, а pH продукта крови находится в пределах приблизительно 5-7,5, так что патологический прионный белок в продукте крови заряжен отрицательно. Таким образом, мономер, содержащий основную азотсодержащую часть и гидрофобный полимеризуемый мономер, могут удалять патологический прионный белок из продукта крови с высокой эффективностью. Кроме того, известно, что контакт между материалом, несущим отрицательные заряды, и продуктом крови может индуцировать продукцию брадикинина, вызывающего анафилактическую реакцию, такую как падение кровяного давления, прилив крови к лицу, конъюнктивальная гиперемия, сокращение гладкой мускулатуры или боль, таким образом, полимер, несущий отрицательные заряды, не подходит для покрытия поверхности носителя при использовании для фильтрации продукта крови.

С другой стороны, фильтрация продукта крови с использованием фильтра необходима для получения продукта крови такого же качества, как продукт крови, полученный с помощью фильтрации через обычный фильтр для удаления лейкоцитов. Протонная нейтральная гидрофильная часть полимера необходима для обеспечения смачиваемости, необходимой для распространения продукта крови по всему фильтру, в особенности для проведения равномерной «активации» колонки, то есть процедуры заполнения фильтра продуктом крови на первой стадии фильтрации. Если композиции мономера, содержащего основную азотсодержащую часть и гидрофобного полимеризуемого мономера в полимере, превышают определенные уровни, это вызывает потерю качества, приводящую к гемолизу или увеличенному времени фильтрации. Таким образом, для производства продукта крови, из которого патологический прионный белок удаляется с высокой эффективностью, необходимо отрегулировать композицию гидрофобного полимеризуемого мономера, полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть, в должных пределах.

Термин «гидрофобный полимеризуемый мономер» в настоящем изобретении означает полимеризуемый мономер, обладающий очень низким сродством к воде и растворимостью в воде 12 г на 100 г воды или менее при 20°С и означает мономер, чья молекула не содержит ни основной азотсодержащей части, ни протонной нейтральной гидрофильной части. Если растворимость составляет более чем 12 г на 100 г воды, может не достигаться высокая эффективность удаления патогенного прионного белка, представленная в настоящем изобретении. Более предпочтительна растворимость в пределах 2 г на 100 г воды или менее. Растворимость может определяться известным способом, таким как способ определения точки росы, термальный анализ, электрический способ, включающий измерение электродвижущей силы или электрической проводимости раствора, газовая хроматография или индикаторный способ, в случае, когда полимеризуемый мономер представляет собой твердое вещество. В случае, когда полимеризуемый мономер представляет собой жидкость, растворимость может определяться теми же способами, что применимы к твердому полимеризуемому мономеру, а также способами, известными из уровня техники, такими как емкостный способ, способ рассеяния света или способ давления насыщенного пара. В качестве более простого способа, если точка кипения полимеризуемого мономера значительно выше точки кипения воды, может использоваться способ, где из насыщенного водного раствора полимеризуемого мономера выпаривают воду и измеряют массу сухого остатка.

Для достижения большей эффективности удаления патологического прионного белка и удаления лейкоцитов предпочтительно, чтобы полимер включал вышеперечисленные мономеры в следующих концентрациях (молярные доли): гидрофобный полимеризуемый мономер, 20 молярных процентов или более и 40 молярных процентов или менее; полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, 5 молярных процентов или более и 13 молярных процентов или менее; полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, концентрация, получающаяся в результате вычитания суммы молярных долей гидрофобного полимеризуемого мономера в полимере и полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, из 100 молярных процентов. Если молярная доля гидрофобного полимеризуемого мономера в полимере меньше 20 молярных процентов или концентрация полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, меньше 5 молярных процентов, эффективность удаления патологического прионного белка может не повышаться, что нежелательно. Если концентрация гидрофобного полимеризуемого мономера в полимере превышает 40 молярных процентов, может уменьшаться смачиваемость для продукта крови, хранящегося в холодильнике, что нежелательно, поскольку это вызывает уменьшение скорости фильтрации продукта крови при фильтрации продукта крови с использованием фильтра, покрытого полимером по настоящему изобретению. Если концентрация полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, превышает 13 молярных процентов, в продукте крови, хранящемся в холодильнике, может происходить гемолиз, что нежелательно. Чтобы достичь еще большей эффективности удаления патологического прионного белка и удаления лейцкоцитов, предпочтительно, чтобы полимер включал вышеперечисленные мономеры в следующих концентрациях: гидрофобный полимеризуемый мономер, 25 молярных процентов или более и 35 молярных процентов или менее; полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, 7 молярных процентов или более и 12 молярных процентов или менее; полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, в концентрации, получающейся в результате вычитания суммы молярных долей гидрофобного полимеризуемого мономера в полимере и полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, из 100 молярных процентов. Наиболее предпочтительно, чтобы полимер включал гидрофобный полимеризуемый мономер в концентрации 27 молярных процентов или более и 33 молярных процентов или менее; полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, в композиции сополимеризации 8 молярных процентов или более и 11 молярных процентов или менее; полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, в качестве баланса.

Композиция мономеров в составе полимера может определяться в соответствии с общепринятой физико-химической техникой. Примеры физико-химической техники для определения состава сополимеризации включают известные способы, такие как ядерно-магнитная резонансная спектроскопия (ЯМР, -1Н, -13С) и способ пиролиза GC/MS. Также возможно определить, проходит ли полимеризация в соответствии с планом в отношении композиции заряженного мономера или имеют место вариации от партии к партии. Также возможно растворить и экстрагировать полимер, покрывающий носитель, используя растворитель для полимера, и возможно проанализировать состав мономеров в экстрагированном полимере с помощью вышеперечисленных способов. Также возможно применить способ растворения носителя и полимера, присутствующего на поверхности, дейтерированным растворителем и определения состава с помощью ядерно-магнитной резонансной спектроскопии (ЯМР, -1Н, -13С) в качестве способа определения композиции сополимеризации. Молекулярную массу полимера можно измерить с помощью известного способа гель-проникающей хроматографии. Средняя молекулярная масса предпочтительно находится в пределах 50000 или более и 3000000 или менее, более предпочтительно 100000 или более и 2000000 или менее, наиболее предпочтительно 150000 или более и 1500000 или менее. Если средняя молекулярная масса (Mw) меньше 50000, может иметь место нежелательная элюция полимера в продукт крови в процессе удаления патологического прионного белка и удаления лейкоцитов из продукта крови. Если молекулярная масса (Mw) больше 3000000, имеет место нежелательное уменьшение растворимости полимера в растворителе, используемом для покрытия. Кроме того, может оказаться невозможным стабильное производство полимера при полимеризации. Полимер может представлять собой случайный сополимер или блок-сополимер. Однако более предпочтителен случайный сополимер, поскольку блок-сополимер имеет тенденцию к уменьшению растворимости в растворителе при покрытии и может иметь тенденцию к ухудшению равномерности покрытия из-за образования мицелл в растворе. Полимер может представлять собой линейный полимер или разветвленный полимер. Однако более предпочтительна линейная полимерная цепь, поскольку разветвленная полимерная цепь может иметь тенденцию к уменьшению растворимости в растворителе при покрытии и может иметь тенденцию к ухудшению равномерности покрытия из-за образования мицелл в растворе. Для синтеза полимера может использоваться общепринятый способ полимеризации. Могут применяться аддитивная полимеризация (виниловая полимеризация), представляющая собой цепную реакцию; изомеризационная полимеризация; и реакция элиминации, полимеризация, поликонденсация, аддитивная поликонденсация и подобные способы, представляющие собой последовательные реакции. В качестве переносчиков цепи при получении полимера могут использоваться радикалы или ионы. Что касается типа полимеризации, в качестве примеров можно привести полимеризацию в растворе, полимеризацию в массе, осаждение с одновременной полимеризацией, эмульсионную полимеризацию. Из этих способов предпочтительна полимеризация в растворе.

Ниже приведен пример способа полимеризации.

В качестве растворителя для полимеризации используют этанол, и раствор этанола, в котором растворили мономеры и инициатор (диазо-соединение), добавляют по каплям для проведения реакции, при этом раствор помешивают при постоянной температуре, равной или меньшей, чем точка кипения этанола, в атмосфере азота. При необходимости может быть добавлен стабилизатор или другие вещества. Выход реакции измеряют и подтверждают путем использования общепринятого способа, такого как газовая хроматография. Возможна очистка реакционной смеси с помощью общепринятого способа химической очистки для удаления примесей, таких как низкомолекулярные компоненты и непрореагировавшие вещества, содержащиеся в полимере или в реакционном растворе, содержащем полимер, которые могут элюировать во время обработки продукта. В качестве способа очистки можно привести способ, при котором реакционную смесь заливают в растворитель, растворяющий примеси, но не растворяющий полимер, и затем отделяют осадок путем фильтрования или сцеживания. В качестве альтернативы можно привести способ, где осадок промывают растворителем с растворимостью немного большей, чем растворимость растворителя, содержащего осадок (например, смесь растворителя и растворителя, содержащего осадок), и высушивают осадок при пониженном давлении до тех пор, пока масса осадка не станет постоянной.

Не существует специфических ограничений типа носителя при условии, что в материале имеются поры, через которые может фильтроваться кровь. Среди различных конформаций носителей, пригодных к использованию, особенно предпочтительны волокнистые материалы, такие как натуральное волокно, стеклянное волокно, вязаный, тканый или нетканый материал, пористая мембрана, и материал, обладающий губчатой структурой, содержащий трехмерную сеть протяженных пор. Различные носители, такие как органические полимерные материалы, неорганические полимерные материалы и металлы, могут использоваться без ограничений при условии, что клетки крови не повреждаются. Из перечисленных материалов предпочтительны органические полимерные материалы благодаря своим прекрасным технологическим свойствам, таким как резка. Например, полиэстер, полиолефин, полиакрилонитрит, полиамид, полистирен, полиметилметакрилат, поливинилфторид, полиуретан, поливиниловый спирт, поливинилацетат, полисульфон, поливинилиденфторид, политрифторхлорвинил, сополимер винилиденфторида и тетрафторэтилена, полиэстерсульфон, полиакрилат, сополимер бутадиена и акрилонитрита, блок-сополимер полиэстера и поламида, целлюлоза и ацетат целлюлозы. Однако носитель по настоящему изобретению не ограничивается вышеприведенными примерами. Предпочтительны полиэстер и полиолефин и особенно предпочтителен полиэстер.

Термин «носитель, покрытый полимером» в настоящем изобретении означает носитель, полученный путем фиксирования полимера на поверхности носителя таким образом, что полимер не элюирует в продукт во время обработки продукта. В качестве способа фиксации полимера на поверхности носителя может применяться химический способ образования ковалентных связей или физико-химический способ образования нековалентных связей. Предпочтительно количество полимера 0,6 мг/м² или более и 83 мг/м² или менее. При количестве полимера менее чем 0,6 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности носителя имеет место нежелательное уменьшение эффективности удаления патологического прионного белка и удаления лейкоцитов; при количестве полимера, превышающем 83 мг/м², могут иметь место нежелательные флуктуации производительности фильтра из-за неравномерности покрытия. Более предпочтительное количество полимера составляет 5 мг/м² или более и 50 мг/м² или менее на единицу площади на всей площади поверхности носителя, особенно предпочтительное количество носителя составляет 10 мг/м² или более и 40 мг/м² или менее. Количество полимера на поверхности носителя возможно определить согласно общепринятой физико-химической технике. В качестве способа измерения избытка полимера на поверхности носителя можно привести способ, при котором покрытый носитель и полимер, присутствующий на поверхности, растворяют в дейтерированном растворителе и определяют количество с помощью способа ядерно-магнитного резонанса (ЯМР, -1Н, -13С). В описании настоящего изобретения в некоторых случаях «покрытый носитель» относится к носителю, покрытому полимером.

В качестве способа покрытия полимером носителя по настоящему изобретению можно привести известные способы, такие как фиксация вышеупомянутых полимеризуемых мономеров полимера на носителе с помощью химического ковалентного связывания (например, прививка), способ фиксации путем нековалентного физико-химического связывания (ионная связь, силы Ван дер Ваальса и т.д.) (например, покрытие) и способ встраивания полимера. Более точно способ прямой прививки полимеризуемых мономеров или полимера на поверхность носителя способом прививочной полимеризации, таким как радиационная прививка или плазменная прививка или способ покрытия полимером поверхности носителя путем насыщения носителя раствором полимера или нанесение на валик и перенос проводника на поверхность носителя являются предпочтительными ввиду сравнительно простого процесса производства, в результате которого стабильно получаются продукты, обладающие прекрасной производительностью. Для покрытия полимером по настоящему изобретению носителя могут использоваться различные способы без особых ограничений при условии, что поверхность носителя может покрываться достаточно равномерно, а поры носителя не забиваться. Примеры способов покрытия полимером носителя включают, но не ограничиваются способом насыщения носителя раствором полимера, способом напыления раствора полимера на носитель, и способом нанесения или переноса раствора полимера на носитель с помощью валика для фотогравировки. Из этих способов предпочтителен способ насыщения носителя раствором полимера и сдавления носителя и способ нанесения или переноса раствора полимера на носитель с помощью валика для фотогравировки благодаря прекрасным возможностям непрерывного производства и низкой стоимости. Не существует особых ограничений на типы растворителей, которые могут быть использованы для растворения полимера при условии, что эти растворители не растворяют носитель. Примеры таковых включают: растворы, содержащие воду и неорганические соли; спирты, такие как метанол, этанол, пропанол и бутанол; кетоны, такие как ацетон и метилэтилкетон; сложные эфиры, такие как метилацетат и этилацетат; углеводороды, такие как бензол и циклогексан; галогенизированные углеводороды, такие как хлороформ и дихлорметан; серосодержащие растворители, такие как диметилсульфоксид; амиды, такие как диметилформамид и диметилацетамид; и смеси различных видов вышеперечисленных растворителей в пределах их растворимости. Однако растворители, применимые в качестве растворителей, растворяющих полимер по настоящему изобретению, не ограничены в высокой степени вышеприведенными примерами. Для высушивания раствора полимера после покрытия может использоваться способ, включающий удаление избытка растворителя путем механического сжатия или впрыскивания газа, такого как воздух или азот, и оставление покрытого носителя в сухом воздухе или при пониженном давлении при атмосферной температуре или при нагревании. Для увеличения адгезии полимера согласно настоящему изобретению к носителю поверхность носителя может быть обработана перед покрытием подходящим агентом, таким как кислота или щелочь, или облучена плазмой. Адгезия полимера к носителю может быть далее повышена с помощью термической обработки после покрытия полимером или с помощью пост-обработки, заключающейся в облучении покрытой поверхности лучами, такими как γ-лучи или электронные лучи. Стадия покрытия может проводиться в процессе производства носителя или после производства носителя.

Известно, что физическая структура проводника играет большую роль в удалении патологического прионного белка и лейкоцитов. Для увеличения эффективности удаления патологического прионного белка и лейкоцитов важным фактором также является выбор носителя. Что касается физической структуры покрытого носителя, удельная площадь поверхности составляет 1,0 м²/г или более и 5,0 м²/г или менее, предпочтительно 1,1 м²/г или более и 3,0 м²/г или менее, и наиболее предпочтительно 1,3 м²/г или более и 2,0 м²/г или менее. Если площадь специфической поверхности носителя составляет менее 1,0 м²/г, трудно достичь высокой эффективности удаления лейкоцитов. Если площадь специфической поверхности превышает 5,0 м²/г, становится невозможным стабильное производство покрытого носителя. На практике при обработке продукта с использованием фильтра для крови предпочтительно, чтобы два или более покрытых носителя с различными значениями удельной площади поверхности были расположены таким образом, чтобы удельная площадь поверхности носителя увеличивалась по направлению к выходному порту.

В отношении физической структуры покрытого носителя предпочтительно, чтобы пористость составляла 65% или более и 90% или менее, более предпочтительно 75% или более и 88% или менее. При пористости менее 65% уменьшается скорость фильтрации крови, и для удаления патологического прионного белка и лейкоцитов требуется большее количество времени. В то же время, если пористость превышает 90%, количество точек пересечений волокон, с которыми могут сцепляться патологический прионный белок и лейкоциты, мало, что приводит к низкой эффективности удаления патологического прионного белка и удаления лейкоцитов. При использовании волокнистого материала, такого как нетканый материал, в качестве покрытого носителя, средний диаметр волокна составляет 0,3 мкм или более и 3,0 мкм или менее, предпочтительно 0,5 мкм или более и 2,5 мкм или менее, более предпочтительно 1 мкм или более и 2 мкм или менее. На практике при обработке продукта крови с использованием фильтра для крови предпочтительно, чтобы два или более покрытых носителя с различными значениями среднего диаметра волокон были расположены таким образом, чтобы средний диаметр волокон носителя уменьшался по направлению к выходному порту. На практике при обработке продукта крови с использованием фильтра для крови, со стороны входного порта от покрытого носителя необязательно может располагаться носитель со средним диаметром волокна, равным 10 мкм или более и 40 мкм или менее, с целью удаления мелких агрегатов.

Средний диаметр поры означает величину (средний диаметр пор, MFP), полученную путем анализа образца массой около 50 мг с использованием порометра Coulter R производства Coulter Electronics. Средний диаметр поры составляет 1 мкм или более и 60 мкм или менее, предпочтительно 1 мкм или более и 30 мкм или менее, более предпочтительно 1 мкм или более и 20 мкм или менее. При среднем диаметре поры меньше 1 мкм нежелательно, продукт цельной крови трудно проникает через поры, в то же время, если средний диаметр пор превышает 60 мкм, может нежелательно падать эффективность удаления лейкоцитов. На практике при обработке продукта крови с использованием фильтра для крови, предпочтительно, чтобы два или более покрытых носителя с различными значениями среднего диаметра пор были расположены таким образом, чтобы средний диаметр пор носителя уменьшался по направлению к выходному порту. На практике при обработке продукта крови с использованием фильтра для крови со стороны входного порта от покрытого носителя необязательно может располагаться носитель со средним диаметром пор, равным 50 мкм или более и 200 мкм или менее, с целью удаления мелких агрегатов.

На практике при обработке продукта крови с использованием фильтра для крови со стороны выходного порта от покрытого носителя необязательно может располагаться носитель со средним диаметром пор, равным 50 мкм или более и 200 мкм или менее, с целью предупреждения неравномерности потока.

При заполнении контейнера волокнистым материалом для удаления патологического прионного белка и лейкоцитов плотность заполнения предпочтительно составляет 0,1 г/см³ или более и 0,5 г/см³ или менее, более предпочтительно 0,1 г/см³ или более и 0,3 г/см³ или менее. Способ измерения плотности заполнения описан посредством примера. Нетканый материал, предназначенный для заполнения, разрезают на кусочки и измеряют размер заполнения (см³) и массу (г). Плотность может быть рассчитана исходя из протяженности (см) материала в реальном контейнере.

Если средний диаметр волокна менее 0,3 мкм или средний диаметр поры менее 1 мкм или плотность заполнения менее 0,5 г/см³, фильтр может забиваться клетками крови, или может увеличиваться потеря давления. Если средний диаметр волокна больше 3,0 мкм, средний диаметр поры больше 60 мкм или плотность заполнения меньше 0,1 г/см³, может нежелательно уменьшаться эффективность удаления патологического прионного белка и удаления лейкоцитов.

Пористая мембрана или материал, обладающий губчатой структурой, содержащий трехмерную сеть протяженных пор, используемый в качестве покрытого носителя, предпочтительно имеет средний диаметр поры 1 мкм или более и 60 мкм или менее, предпочтительно 5 мкм или более и 50 мкм или менее, более предпочтительно 10 мкм или более и 40 мкм или менее. Если средний диаметр пор меньше 1 мкм, фильтр может забиваться клетками крови или может нежелательно вызываться потеря давления. Если средний диаметр поры больше 60 мкм, нежелательно уменьшается эффективность удаления лейкоцитов.

Термин «патологический прионный белок» в настоящем изобретении означает вариантный прионный белок, про который известно, что он вызывает заболевание, называемое губчатой энцефалопатией, у людей и животных. Патологический прионный белок обладает той же аминокислотной последовательностью, что и нормальный прионный белок, но обладает измененной конформацией, обогащенной β-слоями, и устойчив к протеазе К. Патологический прионный белок может инфицировать животных, что приводит к развитию скрейпи, которая представляет собой инфекционное дегенеративное заболевание нервной системы овец и коз, и BSE у крупного рогатого скота. В случае человека патологические прионные белки могут вызывать спонтанную болезнь Крейцфельда-Якоба (sCJD), ятрогенную болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера (GSS), фатальную семейную бессонницу (FFI), куру и вариантную CJD, которая передается через мясо, зараженное BSE. Патологические прионные белки, использующиеся в настоящем изобретении, включают все типы патологических прионных белков, которые могут вызывать любое или все вышеперечисленные заболевания у любого животного, в особенности у человека и домашних животных. В действительности, согласно докладу Samuel Coker на Cambridge Healthtech Institut's 10^th Annual Transmissible Spongiform Encephalopathies - The Definitive American TSE Meeting в марте 2006 г., патологические прионные белки, полученные из варианта скрейпи CJD и спонтанной CJD, могут быть удалены с помощью фильтра (LAPRF, производство Pall) в одинаковой степени, не отмечалось значительной разницы в коэффициентах удаления. В соответствии с этим можно предположить, что белковые структуры патологических прионных белков в отношении эффективности удаления с помощью фильтра практически одинаковы даже у различных видов животных или при различных заболеваниях, и что коэффициент удаления патологического прионного белка, полученного из человеческого материала, можно вычислить на основе коэффициента удаления патологического прионного белка, полученного из материала животных.

Термин «фильтр» в настоящем изобретении означает продукт, полученный путем заполнения контейнера для продукта крови, имеющего входной и выходной порты, покрытым носителем согласно настоящему изобретению, также может присутствовать носитель, улавливающий мелкие агрегаты, на входной или выходной стороне продукта крови.

Материал контейнера может представлять собой твердую смолу или гибкую смолу. В случае твердой смолы примеры могут включать феноловую смолу, акриловую смолу, эпоксидную смолу, формальдегидную смолу, мочевинную смолу, кремниевую смолу (силикон), акрилонитрил-бутадиен-стиреновую смолу, нейлон, твердый полиуретан, поликарбонат, винилхлорид, полиэтилен, полипропилен и полиэстер, и т.д. В случае гибкой смолы могут использоваться материалы, полученные путем формирования входного и выходного порта для продукта крови на листах из гибкой синтетической смолы, с последующим свариванием получившихся частей на периферии, или формованный цилиндрический продукт, имеющий входной и выходной порты для продукта крови. В случае, когда материал прикрепляется к контейнеру с покрывающим носителем, предпочтительны материалы, обладающие сходными тепловыми и электрическими свойствами. Примеры подходящих материалов включают полиолефины, такие как мягкий поливинилхлорид, полиуретан, сополимер этилена и винилацетата, полиэтилен и полипропилен, термопластичные эластомеры, такие как гидрированный сополимер стирен-бутадиен-стирен, сополимер стирен-изопрен-стирен или его гидрированные продукты, и смеси термопластичного эластомера и пластификатора, такого как полиолефин или этилен-этилакрилат или подобных. Из этих материалов предпочтительны мягкий поливинилхлорид, полиуретан, сополимер этилена и винилацетата, полиолефин и термопластический эластомер, содержащий их в качестве главного компонента, в особенности предпочтительны мягкий поливинилхлорид и полиолефин.

Не существует особых ограничений на вид формы контейнера при условии, что контейнер имеет форму, включающую входной порт для продукта крови и выходной порт для продукта крови, из которого были удалены патологический прионный белок и лейкоциты, однако форма предпочтительно зависит от формы носителя. Например, при использования носителя в форме пластины, контейнер может иметь плоскую форму, включающую полигональную форму, такую как форму четырехугольника или шестиугольника, или закругленную форму, такую как круглая форма или овальная форма. Более точно контейнер включает входной контейнер, включающий входной порт для продукта крови и выходной контейнер, включающий выходной порт для продукта крови, и обладает формой, где оба контейнера прилегают к носителю с двух сторон напрямую или через несущее тело и делят внутренность носителя на две части, формируя таким образом плоский фильтр. В качестве альтернативы при использовании носителя цилиндрической формы предпочтительна цилиндрическая форма контейнера. Более точно контейнер включает цилиндрическое тело, в которое упакован носитель, входной конец которого включает входной порт для продукта крови, а выходной конец включает выходной порт для продукта крови. Контейнер имеет форму, внутренность которой разделена на две части путем процесса заливки, так что жидкость, введенная через входной порт, течет с внешней периферии на внутреннюю периферию (или с внутренней периферии на внешнюю периферию) цилиндрического носителя, формируя таким образом цилиндрический фильтр.

Термин «продукт крови» в настоящем изобретении в общем случае означает жидкость, включающую цельную кровь, которая может содержать патологический прионный белок, или один или несколько компонентов крови, полученные из цельной крови, или жидкость, полученную путем добавления к жидкости антикоагулянта или раствора консерванта. Специфические примеры включают но не ограничиваются продуктом цельной крови, продуктом эритроцитов, продуктом тромбоцитов, продуктом плазмы, промытой суспензией эритроцитов, размороженным концентрированным раствором эритроцитов, синтетической кровью, обогащенной эритроцитами плазмой и лейкоцитной пленкой.

Термин «продукт цельной крови» в настоящем изобретении означает продукт крови, полученный путем добавления раствора консерванта или антикоагулянта, такого как цитрат-фосфат-декстроза (CPD), цитрат-фосфат-декстроза-аденин-1 (CPDA-1), цитрат-фосфат-2-декстроза (CP2D), цитрат декстрозы формула А (ACD-A), цитрат декстрозы формула B (ACD-B) или гепарин, к цельной крови, полученной от донора.

Ниже описан способ удаления патологического прионного белка из продукта крови согласно настоящему изобретению, обращая особое внимание на процедуры. Вначале описывается воплощение способа получения различных продуктов крови, который не ограничивает намеренно настоящее изобретение.

(Получение продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка)

К собранной цельной крови добавляют консервирующий раствор антикоагулянта, такого как CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, ACD-B или гепарин и полученный раствор фильтруют с использованием фильтра согласно настоящему изобретению, для удаления патологического прионного белка из цельной крови, таким образом получая продукт цельной крови, не содержащий патологического прионного белка.

Продукт цельной крови фильтруют через систему, включающую, по крайней мере, пакет, содержащий продукт крови, фильтр и пакет для сбора продукта крови, не содержащего патологического прионного белка, асептически соединенного шлангами в указанном порядке (см. чертеж). Система может подсоединяться к игле для сбора крови, к пакету для сбора крови, к пакету для разделения компонентов после центрифугирования или шлангу для забора продукта крови, оставшегося в фильтре. Патологический прионный белок может быть удален путем фильтрации, проведенной путем подвода крови к фильтру через шланг от пакета, содержащего продукт крови, помещенного выше, чем фильтр, с помощью силы тяжести, или путем провода продукта крови через прибор, такой как насос, от входного порта фильтра под повышенным давлением и/или от выходного порта фильтра под пониженным давлением. Способ фильтрации может применяться не только к продуктам цельной крови, но также и к другим продуктам крови.

В случае удаления патологического прионного белка до хранения для получения продукта крови, не содержащего патологического прионного белка, патологический прионный белок удаляют с использованием фильтра согласно настоящему изобретению при комнатной температуре или при охлаждении в течение 72 часов, более предпочтительно в течение 24 часов, в особенности предпочтительно в течение 12 часов, наиболее предпочтительно в течение 8 часов после сбора цельной крови, которая затем хранится при комнатной температуре или при охлаждении. В случае удаления патологического прионного белка после хранения с целью получения продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, патологический прионный белок удаляют с помощью фильтра предпочтительно за 24 часа до использования. В настоящем изобретении возможно приготовить продукт цельной крови, не содержащий патологического прионного белка и лейкоцитов.

(Получение продукта эритроцитов, не содержащего патологического прионного белка)

К собранной цельной крови добавляют раствор консерванта или антикоагулянта, такого как CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, ACD-B или гепарин. Примеры способа последовательного разделения на компоненты включают способ, включающий удаление патологического прионного белка из цельной крови с последующим центрифугированием; и способ, включающий центрифугирование цельной крови с последующим удалением патологического прионного белка из эритроцитов или эритроцитов и лейкоцитной пленки (ниже обозначенной как «BC»).

В случае, когда центрифугирование проводят после удаления патологического прионного белка из цельной крови, продукт эритроцитов, не содержащий патологического прионного белка, получают путем получения продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, аналогично получению продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, центрифугирования продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, и сбора концентрированных эритроцитов в нижнем уровне.

В случае, когда цельную кровь центрифугируют до удаления патологического прионного белка, можно применять два варианта условий центрифугирования: мягкие условия центрифугирования для разделения крови на эритроциты и богатую тромбоцитами плазму (PRP) и жесткие условия центрифугирования для разделения крови на эритроциты, BC и бедную тромбоцитами плазму (PPP). При необходимости добавляют раствор консерванта, такой как солевой раствор аденина, глюкозы и маннитола (SAGM), аддитивный раствор-1 (AS-1), аддитивный раствор-3 (AS-3), аддитивный раствор-5 (AS-5), или маннитол-аденин-фосфат (MAP) к эритроцитам, отделенным и отобранным от цельной крови, или эритроцитам, содержащим BC, и продукт эритроцитов может фильтроваться с использованием фильтра согласно настоящему изобретению для получения таким образом продукта эритроцитов, не содержащего патологического прионного белка.

При получении продукта эритроцитов, не содержащего патологического прионного белка, центрифугирование проводится в течение предпочтительно 72 часов, более предпочтительно 48 часов, в особенности предпочтительно 24 часов, наиболее предпочтительно 12 часов после сбора цельной крови при комнатной температуре или при охлаждении. В случае, когда патологический прионный белок удаляют перед хранением, продукт цельной крови, не содержащий патологического прионного белка, приготовляют путем удаления патологического прионного белка с помощью фильтра в течение предпочтительно 120 часов, более предпочтительно 72 часов, в особенности предпочтительно 24 часов, наиболее предпочтительно 12 часов после забора крови из продукта эритроцитов, хранящегося при комнатной температуре или при охлаждении. В случае, когда патологический прионный белок удаляют после хранения, патологический прионный белок удаляют из продукта эритроцитов, хранящегося при комнатной температуре или при охлаждении, предпочтительно в течение 24 часов перед использованием, получая таким образом продукт эритроцитов, не содержащий патологического прионного белка.

(Получение продукта тромбоцитов, не содержащего патологического прионного белка)

К собранной цельной крови добавляют консервирующий раствор антикоагулянта, такого как CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, ACD-B или гепарин.

Примеры способа последовательного разделения на компоненты включают: способ, включающий удаление патологического прионного белка из цельной крови с последующим центрифугированием; и способ, включающий центрифугирование цельной крови с последующим удалением патологического прионного белка из PRP или тромбоцитов.

В случае, когда центрифугирование проводится после удаления патологического прионного белка из цельной крови, продукт тромбоцитов, не содержащий патологического прионного белка, получают путем получения продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, таким же образом, как при получении продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, центрифугирования цельной крови, не содержащей патологического прионного белка, сбора PRP в верхнем слое, центрифугирования верхнего слоя и сбора концентрированных тромбоцитов (PC) в нижнем слое.

В случае, когда цельную кровь центрифугируют до удаления патологического прионного белка, можно применять два варианта условий центрифугирования: мягкие условия центрифугирования для разделения крови на эритроциты и PRP и жесткие условия центрифугирования для разделений крови на эритроциты, BC и PPP. В случае мягких условий центрифугирования продукт тромбоцитов, не содержащий патологического прионного белка, получают путем фильтрования PRP, отделенной от цельной крови, с использованием фильтра для удаления патологического прионного белка, повторного центрифугирования фильтрата и сбора PC в нижнем уровне, или путем центрифугирования PRP для отделения тромбоцитов от PPP и фильтрования PC в нижнем уровне с использованием фильтра для удаления патологического прионного белка. В случае жестких условий центрифугирования продукт тромбоцитов, не содержащий патологического прионного белка, готовится путем добавления, при необходимости, раствора консерванта или плазмы к BC, отделенной от цельной крови и собранной в количестве от одной до нескольких десятков единиц, центрифугирования раствора, сбора верхнего слоя для получения концентрированных тромбоцитов и фильтрации тромбоцитов с использованием фильтра для удаления патологического прионного белка.

При получении продукта тромбоцитов, не содержащего патологического прионного белка, цельную кровь, хранящуюся при комнатной температуре, собирают в течение 24 часов, более предпочтительно 12 часов, в особенности предпочтительно 8 часов после сбора цельной крови. В случае удаления патологического прионного белка продукт цельной крови, не содержащий патологического прионного белка, готовят путем удаления патологического прионного белка при помощи фильтра в течение предпочтительно 120 часов, более предпочтительно 78 часов, в особенности предпочтительно 24 часов, наиболее предпочтительно 12 часов после сбора продукта тромбоцитов, который затем хранят при комнатной температуре. В случае, когда патологический прионный белок удаляют после хранения, патологический прионный белок удаляют при помощи фильтра из продукта тромбоцитов, хранящегося при комнатной температуре или при охлаждении, в течение 24 часов перед использованием, получая таким образом продукт тромбоцитов, не содержащий патологического прионного белка.

(Получение продукта плазмы, не содержащего патологического прионного белка)

К собранной цельной крови добавляют консервирующий раствор антикоагулянта, такого как CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, ACD-B или гепарин.

Примеры способа последовательного разделения на компоненты включают: способ, включающий удаление патологического прионного белка из цельной крови с последующим центрифугированием; и способ, включающий центрифугирование цельной крови с последующим удалением патологического прионного белка из PPP или PRP.

В случае, когда центрифугирование проводится после удаления патологического прионного белка из цельной крови, продукт плазмы, не содержащий лейкоцитов, получают путем получения продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, таким же образом, как при получении продукта цельной крови, не содержащего патологического прионного белка, центрифугирования цельной крови, не содержащей патологического прионного белка и сбора плазмы в верхнем слое.

В случае, когда цельную кровь центрифугируют до удаления патологического прионного белка, можно применять два варианта условий центрифугирования: мягкие условия центрифугирования для разделения крови на эритроциты и PRP и жесткие условия центрифугирования для разделения крови на эритроциты, BC и PPP. В случае мягких условий центрифугирования продукт плазмы, не содержащий патологического прионного белка, получают путем фильтрации PRP при помощи фильтра для удаления патологического прионного белка, после фильтрации PRP, повторного центрифугирования фильтрата и сбора PPP в супернатанте, или путем разделения PRP на PPP и тромбоциты путем центрифугирования и фильтрования PPP с использованием фильтра для удаления патологического прионного белка. В случае жестких условий центрифугирования продукт плазмы, не содержащий патологического прионного белка, готовится путем фильтрования PPP при помощью фильтра для удаления патологического прионного белка.

При получении продукта плазмы, не содержащего патологического прионного белка, цельную кровь, хранящуюся при комнатной температуре или при охлаждении, центрифугируют предпочтительно в течение 72 часов, более предпочтительно 48 часов, в особенности предпочтительно 24 часов, наиболее предпочтительно 12 часов после сбора цельной крови. В качестве альтернативы продукт плазмы, не содержащий патологического прионного белка, готовят путем удаления патологического прионного белка при помощи фильтра в течение предпочтительно 120 часов, более предпочтительно 72 часов, в особенности предпочтительно 24 часов, наиболее предпочтительно 12 часов после сбора продукта крови из продукта плазмы, который затем хранят при комнатной температуре или при охлаждении. В случае, когда патологический прионный белок удаляют после хранения, патологический прионный белок удаляют при помощи фильтра из продукта плазмы, хранящегося при комнатной температуре или при охлаждении, предпочтительно в течение 24 часов перед использованием, получая таким образом продукт плазмы, не содержащий патологического прионного белка.

Термин «фильтр для удаления лейкоцитов» в настоящем изобретении означает фильтр, способный удалять лейкоциты при фильтрации продукта крови на уровне 99% или более, предпочтительно 99,9% или более, более предпочтительно 99,99% или более. В случае, когда эффективность фильтра выражается как эффективность удаления лейкоцитов, фильтр показывает величину, рассчитанную по нижеприведенной формуле (1). Таким образом, фильтр обладает эффективностью удаления лейкоцитов, равной 2 или более, предпочтительно 3 или более, более предпочтительно 4 или более.

Эффективность удаления лейкоцитов = -Log₁₀ {[концентрация лейкоцитов (клеток в мкл) в крови после фильтрации]/ [концентрация лейкоцитов (клеток в мкл) крови до фильтрации]} (1).

Способ стерилизации фильтра согласно настоящему изобретению включает: газовую стерилизацию этиленоксидом; стерилизацию облучением, такую как стерилизацию γ-облучением или электронным лучом; и стерилизацию автоклавированием. Более предпочтительна стерилизация облучением или автоклавированием. Для достижения высокой эффективности удаления лейкоцитов из продукта цельной крови фильтр предпочтительно подвергают как стерилизации облучением, так и стерилизации автоклавированием. Между стерилизацией облучением и стерилизацией автоклавированием нет очередности, однако более предпочтительно, чтобы стерилизация автоклавированием проводилась до стерилизации облучением. Использование носителя, покрытого полимером, подвергаемого стерилизации автоклавированием, может уменьшить количество патологического прионного белка, адсорбирующегося на носителе, покрытом полимером, в продукте цельной крови. Возможно это вызвано конкурентной адсорбцией с белками в продукте цельной крови, поскольку стерилизация автоклавированием не вызывает никаких изменений химических свойств полимера на поверхности носителя. С другой стороны, в случае стерилизации облучением высокая эффективность удаления приона может быть достигнута даже в продукте цельной крови. Причина этого неясна, но можно предположить, что стерилизация фильтра облучением вызывает изменения химических свойств полимера на поверхности носителя, что приводит к предпочтительному заряду и балансу композиции трех элементов полимера для адсорбции патологического прионного белка. Однако примечательно, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что высокая эффективность удаления патологического прионного белка из продукта цельной крови может быть достигнута даже после стерилизации автоклавированием, при условии, что она проводится после стерилизации облучением. Ожидается, что если стерилизация автоклавированием проводится после стерилизации облучением, сохраняется специфичность адсорбции патологического прионного белка, что позволяет достичь высокой эффективности удаления патологического прионного белка вне зависимости от стерилизации автоклавированием. В случае использования встроенной системы, если фильтр подвергается предварительной стерилизации облучением, высокая эффективность удаления патологического прионного белка может достигаться даже после стерилизации автоклавированием.

[Примеры]

Настоящее изобретение описывается более детально в примерах, которые не ограничивают намеренно настоящее изобретение.

Численные значения, используемые в примерах и сравнительных примерах, были получены нижеприведенными способами.

(Удельная площадь поверхности материала фильтра)

Термин «удельная площадь поверхности (м²/г)» в настоящем изобретении означает площадь поверхности на единицу массы нетканого материала, определенного способом адсорбции газа (способ BET) при помощью Accusorb 2100 (производство Shimadzu Corp) или его аналога. Удельную площадь поверхности определяют следующим образом: трубку для образцов заполняют 0,50-0,55 г носителя; из трубки удаляют воздух при пониженном давлении 1·10^-4 мм рт. ст. (при комнатной температуре) в течение 20 часов в приборе Accusorb; адсорбируют газ криптон, для которого известна площадь адсорбции как газа-адсорбата к поверхности нетканого материала при температуре, эквивалентной температуре жидкого азота; подсчитывают полную площадь поверхности в нетканом материале на основе адсорбированного количества; и делят полную площадь поверхности на массу нетканого материала.

(Измерение среднего диаметра волокна)

Делали электронно-микроскопические фотографии пяти случайных точек на нетканом материале. На каждую фотографию накладывали прозрачный лист с нанесенной сеткой. Измеряли диаметр нити в точках пересечения с сеткой (n=100) и определяли диаметр путем преобразования измеренного диаметра, используя в качестве масштаба полистиреновый латекс с известным диаметром.

(Количество полимера на единицу площади общей площади поверхности материала)

Термин «общая площадь поверхности (м²) материала» в настоящем изобретении означает величину, полученную с помощью умножения массы материала (г) на удельную площадь поверхности (м²/г) материала. Количество полимера (мг/м²) на единицу площади (м²) общей площади поверхности материала согласно настоящему изобретению определяют с помощью ЯМР-анализа раствора определенной площади (массы) материала, растворенного в дейтерированном растворителе, общем для носителя и покрывающего агента. Например, предписанное количество материала, включающего полиэстерный нетканый материал, покрытый полимером, содержащим метилметакрилат, диметиламиноэтилметакрилат и 2-гидроксиметакрилат, растворяли в дейтерированном 1,1,1,3,3,3-гексафторо-2-пропаноле. Определяли отношение сигналов, явно относящихся к нетканому материалу (т.е. протону на бензольном кольце), и сигналов, явно относящихся к покрывающему материалу (т.е. протону на метильной группе, соседней с метилметакрилатом). Далее определяли количество полимера на единицу массы нетканого материала из отношения интенсивности и композиции сополимеризации покрывающего материала, определенной отдельно. Количество полимера на единицу массы нетканого материала может быть преобразовано в количество полимера на общую площадь поверхности материала, используя удельную площадь поверхности материала, наполняющего фильтр.

(Анализ фильтрации крови: Примеры 1-13 и Сравнительные Примеры 1-9)

Для оценки крови в качестве продуктов крови использовались продукты эритроцитов, каждый продукт получали следующим путем: непосредственно после сбора крови к 100 мл крови добавляли 14 мл раствора CPD, служащего антикоагулянтом; смешивали смесь; хранили смесь в холодильнике в течение 72 часов; центрифугировали смесь; к отделенным эритроцитам, содержащим BC, добавляли SAGM; и оставляли смесь на 1 час (ниже обозначается как «нефильтрованная кровь»).

Фильтр, используемый для оценки, получали путем заполнения контейнера полиэстерным нетканым материалом С (средний диаметр волокна 1,2 мкм, масса субстрата на единицу площади 40 г/м², удельная площадь поверхности 1,47 м²/г), покрытым полимером, полученным в каждом из примеров и сравнительных примеров (без покрытия в Сравнительном Примере 6). Колонку (эффективная площадь фильтрации 1,3 см²) заполняли восемью покрытыми неткаными материалами, и ко входу колонки подсоединяли шприц, заполненный кровью до фильтрации через винилхлоридный шланг (внутренний диаметр 3 мм, внешний диаметр 4,2 мм). Далее кровь прогоняли через колонку со скоростью потока 0,175 мл/мин при помощи шприцевого насоса в холодильнике и собирали в количестве 3 мл (ниже обозначена как «фильтрованная кровь»). Покрытые нетканые материалы (без покрытия в Сравнительном Примере 6) подвергали стерилизации γ-облучением при 25 кГр в Примерах 1-5 и 11 и Сравнительных Примерах 1-9; стерилизации электронным лучом при 30 кГр в Примерах 8 и 12; стерилизации автоклавированием при 115°С в течение 59 минут в Примерах 6, 7, 10 и 13; стерилизации электронным лучом при 30 кГр и последующей стерилизации автоклавированием при 115°C в течение 59 минут в Примере 9; и не подвергали стерилизации в Сравнительном примере 10.

[Эффективность удаления лейкоцитов]

Эффективность удаления лейкоцитов рассчитывали по вышеприведенной формуле (1), основываясь на концентрациях лейкоцитов до и после фильтрации. Концентрации лейкоцитов измеряли способом проточной цитометрии (на приборе FASCcalibur, производство Becton Dickinson) в 100 мкл каждого образца крови при помощью набора Leucocount, включающего бусины (производство Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.).

[Давление при обработке крови]

Давление при обработке крови измеряли в конце фильтрации при помощи индикатора давления, соединенного со шлангом на входной стороне колонки.

[Уровень гемолиза в крови после фильтрации]

Уровень гемолиза в крови после фильтрации подсчитывали, основываясь на уровне свободного гемоглобина в плазме по отношению к тотальному уровню гемоглобина в продукте эритроцитов по прошествии 42 дней после фильтрации.

Более точно способ вычисления уровня гемолиза заключается в следующем:

(1) Содержание тотального гемоглобина (г/дл) и уровень гематокрита (%) в продукте эритроцитов после фильтрации определяли при помощи автоматического счетчика клеток крови.

(2) Собирали образец продукта эритроцитов после фильтрации в количестве 2 мл и центрифугировали при 1750g в течение 10 мин.

(3) Измеряли величины поглощения супернатанта путем сканирования длин волн между 630 нм и 500 нм при помощи спектрофотометра.

(4) Концентрацию свободного гемоглобина в плазме измеряли согласно способу, описанному в Clin. Biochem. 8, 96-102 (1975).

(5) Уровень гемолиза рассчитывали согласно приведенной ниже формуле (2).

Уровень гемолиза (%)=(100-уровень гематокрита (%))·(концентрация свободного гемоглобина (г/дл))/концентрация тотального гемоглобина (г/дл) (2).

(Оценка эффективности удаления патологического прионного белка: Примеры 1-13 и Сравнительные примеры 1, 3, 5-8 и 10)

[Подготовка фильтра]

Полиэстерный нетканый материал P (средний диаметр волокна 12 мкм, масса субстрата на единицу площади 30 г/м², удельная площадь поверхности 0,24 м²/г), полиэстерный нетканый материал А (средний диаметр волокна 2,5 мкм, масса субстрата на единицу площади 60 г/м², удельная площадь поверхности 0,8 м²/г), полиэстерный нетканый материал B (средний диаметр волокна 1,8 мкм, масса субстрата на единицу площади 60 г/м², удельная площадь поверхности 1,1 м²/г) и полиэстерный нетканый материал C (средний диаметр волокна 1,2 мкм, масса субстрата на единицу площади 40 г/м², удельная площадь поверхности 1,47 м²/г), покрытые полимером, изготовленным в каждом из примеров и сравнительных примеров (без покрытия в сравнительном примере 6), использовали в качестве фильтрующего материала. Фильтрующие материалы P, A, B и C формовали в порядке P-A-B-C с входной стороны, и далее с выходной стороны формовали B' (фильтрующий материал, идентичный В), A' (фильтрующий материал, идентичный А), и P' (фильтрующий материал, идентичный P), получая таким образом фильтр, обладающий симметричной структурой P-A-B-C-B'-A'-P'. Полученный фильтрующий материал заключали между листами гибкой винилхлоридной смолы с портами, служащими для входа и выхода крови, периферическую границу между фильтрующим материалом и гибким листом склеивали и объединяли при помощи высокочастотной сварочной установки, получая таким образом фильтр с эффективной площадью фильтрации 56 см².

Полученные фильтры подвергали стерилизации γ-облучением при 25 кГр в Примерах 1-5 и 11 и Сравнительных Примерах 1-9; стерилизации электронным лучом при 30 кГр в Примерах 8 и 12; стерилизации автоклавированием при 115°С в течение 59 минут в Примерах 6, 7, 10 и 13; стерилизации электронным лучом при 30 кГр и последующей стерилизации автоклавированием при 115°C в течение 59 минут в Примере 9; и не подвергали стерилизации в Сравнительном примере 10.

[Получение мозга хомяка, инфицированного скрейпи]

Патологический прионный белок Sc237, выделенный из пассажа хомяка 263K для развития скрейпи, прививали хомяку, и по прошествии 65-70 дней мозг хомяка выделяли и использовали в качестве мозга хомяка, инфицированного скрейпи.

[Получение гомогената]

Мозг хомяка, инфицированный скрейпи, соницировали в растворе сахарозы с концентрацией 320 мМ для получения гомогената с массово-объемной концентрацией (г/100 мл раствора), равной 10% (далее обозначена как мас./об.%). Гомогенат центрифугировали при 4°С и 80g в течение 1 минуты и использовали в качестве гомогената для прибавления (далее сокращено до «гомогенат»).

[Получение микросомальной фракции]

Гомогенат центрифугировали при 5000g в течение 20 минут, супернатант далее центрифугировали при 100000g в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в растворе (150 мМ NaCl, 20 мМTris-HCl, pH 7,4), суспензию центрифугировали при 100000g в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в PBS pH 7,4 (физраствор с фосфатным буфером) для получения микросомальной фракции для добавления (ниже сокращено до «микросомальная фракция»).

[Способ 1 определения концентрации протеазы К: Примеры 1, 2, 4 и 13]

(Образец, не обработанный протеазой К)

50 мкл Гомогената и 50 мкл продукта эритроцитов, содержащего гомогенат, смешивали по отдельности каждый с 450 мкл буфера для образцов, полученные смеси инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут или при 70-80°C в течение 10-15 минут.

(Образец, обработанный протеазой К)

50 мкл Гомогената и 50 мкл продукта эритроцитов, содержащего гомогенат, смешивали по отдельности с растворами, содержащими протеазу К в различных концентрациях и 0,6-1% саркозила, смеси инкубировали при 37°С±4°С в течение 1 часа ± 5 минут. К смесям добавляли 300 мкл буфера для образцов и смеси инкубировали по отдельности при 100°С±5°С в течение 5-10 минут или при 70-80°С в течение 10-15 минут.

Образцы, не обработанные протеазой К и обработанные протеазой К, анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа для определения минимальных концентраций протеазы К для того, чтобы белки, способные неспецифически реагировать с антителом, и нормальный прионный белок полностью деградировались протеазой К и не детектировались, в то время как патологический прионный белок детектировался.

[Способ 2 определения концентрации протеазы К: Примеры 3 и 6 и Сравнительные примеры 5, 6 и 10]

(Образец, не обработанный протеазой К)

5 мл Продукта крови, содержащего микросомальную фракцию, и 5 мл продукта крови, содержащего нормальный прионный белок, центрифугировали по отдельности при 4000g в течение 20 минут. После этого 3 мл супернатантов центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов и инкубировали суспензии при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

(Образец, обработанный протеазой К)

5 мл Продукта крови, содержащего микросомальную фракцию, и 5 мл продукта крови, содержащего нормальный прион, центрифугировали по отдельности при 4000g в течение 20 минут. Растворы с разной концентрацией протеазы К смешивали с 3 мл супернатантов, и смеси центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С с течение 5-10 минут.

Образцы, не обработанные протеазой К, и образцы, обработанные протеазой К, анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа для определения минимальных концентраций протеазы К для того, чтобы белки, способные неспецифически реагировать с антителом, и нормальный прионный белок полностью деградировались протеазой К и не детектировались, в то время как патологический прионный белок детектировался.

[Способ 3 определения концентрации протеазы К: Пример 5 и Сравнительные Примеры 1, 3, 7 и 8]

(Образец, не обработанный протеазой К)

50 мкл Плазмы, содержащей микросомальную фракцию, и 50 мкл плазмы по отдельности смешивали с 50 мкл буфера для образцов, и смеси инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

(Образец, обработанный протеазой К)

Растворы с различной концентрацией протеазы К смешивали с 3 мл плазмы, содержащей гомогенат, полученный из мозга хомяка, инфицированного скрейпи, и 3 мл плазмы, содержащей микросомальную фракцию, полученную из мозга хомяка, инфицированного скрейпи, и смеси центрифугировали при 20000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. После центрифугирования к полученным осадкам добавляли 100 мкл буфера для образцов и оставляли при 100°С±5°С в течение 5-10 минут для прохождения реакции.

Образцы, не обработанные протеазой К, и образцы, обработанные протеазой К, анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа для определения минимальных концентраций протеазы К для того, чтобы белки, способные неспецифически реагировать с антителом, и нормальный прион полностью деградировались протеазой К и не детектировались, в то время как патологический прионный белок детектировался.

[Cпособ 4 определения концентрации протеазы К: Примеры 7-9]

Продукт цельной крови после удаления лейкоцитов центрифугировали при 4000g в течение 30 минут, и к 11,7 мл полученного супернатанта добавляли 1,3 мл микросомальной фракции (ниже обозначено как «нефильтрованная кровь с добавками»), в то время как к 12 мл супернатанта не добавляли никаких веществ (ниже обозначено как «нефильтрованная кровь без добавок»).

(Образец, не обработанный протеазой К)

3 мл Нефильтрованной крови с добавками и 3 мл нефильтрованной крови без добавок центрифугировали по отдельности при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

(Образец, обработанный протеазой К)

1-2% (мас./об) Саркозила и растворы протеазы К с разными концентрациями смешивали с 3 мл нефильтрованной крови с добавками или 3 мл нефильтрованной крови без добавок, и смеси центрифугировали при 100000g при 4°С±2°С в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали по отдельности при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

Образцы, не обработанные протеазой К, и образцы, обработанные протеазой К, анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа для определения минимальных концентраций протеазы К для того, чтобы белки, способные неспецифически реагировать с антителом, и нормальный прионный белок не детектировались из-за обработки протеазой К, в то время как патологический прионный белок детектировался.

[Cпособ 5 определения концентрации протеазы К: Примеры 10-12]

Продукт эритроцитов после удаления лейкоцитов центрифугировали при 4000g в течение 30 минут, и к 11,7 мл полученного супернатанта добавляли 1,3 мл микросомальной фракции (ниже обозначено как «нефильтрованная кровь с добавками»), в то время как к 12 мл супернатанта не добавляли никаких веществ (ниже обозначено как «нефильтрованная кровь без добавок»).

(Образец, не обработанный протеазой К)

3 мл Нефильтрованной крови с добавками и 3 мл нефильтрованной крови без добавок центрифугировали по отдельности при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

(Образец, обработанный протеазой К)

1-2% (мас./об) Саркозила и растворы протеазы К с разными концентрациями смешивали с 3 мл нефильтрованной крови с добавками или 3 мл нефильтрованной крови без добавок, и смеси центрифугировали при 100000g при 4°С±2°С в течение 1 часа. Полученные осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали по отдельности при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

Образцы, не обработанные протеазой К, и образцы, обработанные протеазой К, анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа для определения минимальных концентраций протеазы К для того, чтобы белки, способные неспецифически реагировать с антителом, и нормальный прионный белок не детектировались из-за обработки протеазой К, в то время как патологический прионный белок детектировался.

[Тест 1 эффективности удаления патологического прионного белка: Примеры 1, 2, 4 и 13]

Приобретали и использовали продукт эритроцитов, полученный согласно Европейскому стандарту. Гомогенат добавляли к продукту эритроцитов в количестве 13 мл по отношению к 1 единице продукта эритроцитов при комнатной температуре, получая таким образом нефильтрованную кровь с добавками. Полученный раствор фильтровали при помощи фильтра, включающего полиэстерный нетканый материал С, покрытый полимерами, полученными в Примерах 1, 2, 4 и 13 с помощью силы притяжения с высоты 100 см, и кровь собирали, получая таким образом фильтрованную кровь с добавками. Вначале нефильтрованную кровь с добавками и фильтрованную кровь с добавками растворяли в клеточном лизате (полученном путем растворения 11,45 г оксалата аммония, 433 мг дигидрофосфата калия и 567 мг моногидрофосфата натрия в 1 л дистиллированной воды для инъекций). Как нефильтрованную кровь с добавками, так и фильтрованную кровь с добавками смешивали с клеточным лизатом в объемном соотношении 1:3 и растворяли смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. После растворения трижды проводили соникацию (каждый раз по 15±5 сек при уровне мощности 50±10%) с перерывами по 30±10 сек. К нефильтрованной крови с добавками и фильтрованной крови с добавками добавляли раствор протеазы К с концентрацией, определенной по способу 1 определения концентрации протеазы К, и 0,6-1% саркозила, расщепление протеазой К проводили при 37°С±3°С в течение 1 часа ±5 минут, и затем останавливали путем добавления 10 мМ Pefabloc. Далее получившуюся смесь центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа, добавляли 500 мкл буфера для образцов к полученным осадкам и далее инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут или при 70-80°С в течение 10-15 минут.

[Тест 2 эффективности удаления патологического прионного белка: пример 3 и сравнительные примеры 5 и 6]

Приобретали и использовали продукт эритроцитов, не содержащий лейкоцитов, изготовленный согласно Европейскому стандарту. Продукт хранили в течение 1-2 дней в холодильнике при 4°С, добавляли 12 мл микросомальной фракции к 1 единице продукта эритроцитов, не содержащего лейкоцитов, при комнатной температуре, получая таким образом нефильтрованную кровь с добавками. Полученный раствор фильтровали при помощи фильтра, включающего полиэстерный нетканый материал С, покрытый полимерами, полученными в Примере 3 и Сравнительных Примерах 5 и 6 (не покрытый полимером в Сравнительном Примере 6) с помощью силы притяжения с высоты 100 см, и кровь собирали, получая таким образом фильтрованную кровь с добавками. Нефильтрованную кровь с добавками и фильтрованную кровь с добавками центрифугировали при 4000g в течение 30 минут, супернатанты разделяли на аликвоты. К супернатантам добавляли протеазу К в концентрации 1000 мкг/мл, и смеси центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. После центрифугирования осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

[Тест 3 эффективности удаления патологического прионного белка: Пример 5 и Сравнительные Примеры 1, 3, 7 и 8]

Приобретали свежезамороженную плазму, изготовленную согласно Европейскому стандарту. В день фильтрации плазму размораживали при 37°С и добавляли микросомальную фракцию в объеме 8,6% по отношению к массе плазмы, получая таким образом нефильтрованную кровь с добавками. Нефильтрованную кровь с добавками (150±2 г) фильтровали при помощи фильтра, включающего полиэстерный нетканый материал, покрытый полимерами, полученными в Примере 5 и Сравнительных Примерах 1, 3, 7 и 8 с помощью силы притяжения с высоты 100 см, и кровь собирали, получая таким образом фильтрованную кровь с добавками. К 100 мкл нефильтрованной крови с добавками и фильтрованной крови с добавками добавляли протеазу К в концентрации 600 мкг/мл, смеси центрифугировали при 20000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. Осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

[Тест 4 эффективности удаления патологического прионного белка: Пример 6 и Сравнительный Пример 10]

Приобретали и использовали продукт цельной крови, не содержащий лейкоцитов, изготовленный согласно Европейскому стандарту. Полученный таким образом продукт цельной крови хранили в течение одного дня в холодильнике при 4°С, и к 1 единице продукта цельной крови, не содержащего лейкоцитов, добавляли 28 мл микросомальной фракции, получая таким образом нефильтрованную кровь с добавками. Полученный раствор фильтровали при помощи фильтра, включающего полиэстерный нетканый материал, покрытый полимером, полученным в Примере 6, и фильтра, используемого в Сравнительном Примере 10, с помощью силы притяжения с высоты 100 см, и кровь собирали, получая таким образом фильтрованную кровь с добавками. Нефильтрованную кровь с добавками и фильтрованную кровь с добавками центрифугировали при 4000g в течение 30 минут, супернатанты разделяли на аликвоты. К супернатантам добавляли протеазу К в концентрации 1000 мкг/мл, и смеси центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. После центрифугирования осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

[Тест 5 эффективности удаления патологического прионного белка: Примеры 7, 8, и 9]

Приобретали и использовали продукт цельной крови, не содержащий лейкоцитов, изготовленный согласно Европейскому стандарту. Продукт хранили в течение 1-3 дней в холодильнике при 4°С, и три единицы продукта эритроцитов помещали в один пакет для крови. Далее добавляли 84 мл микросомальной фракции при комнатной температуре, получая таким образом нефильтрованную кровь с добавками. Нефильтрованную кровь с добавками делили на три части, и полученную нефильтрованную кровь с добавками фильтровали при помощи фильтра, включающего полиэстерный нетканый материал С, покрытый полимером, полученным в каждом из Примеров 7, 8 и 9, с помощью силы притяжения с высоты 100 см, и кровь собирали, получая таким образом фильтрованную кровь с добавками. Нефильтрованную кровь с добавками и фильтрованную кровь с добавками центрифугировали при 4000g в течение 30 минут, супернатанты разделяли на аликвоты. К супернатантам добавляли протеазу К до концентрации 25 ед/мл, и смеси центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. После центрифугирования осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

[Тест 6 эффективности удаления патологического прионного белка: Примеры 10, 11 и 12]

Приобретали и использовали продукт эритроцитов, не содержащий лейкоцитов, изготовленный согласно Европейским стандартам. Продукт хранили в течение 2-4 дней в холодильнике при 4°С, и к 1 единице продукта эритроцитов, не содержащего лейкоцитов, добавляли 9,5 мл микросомальной фракции при комнатной температуре, получая таким образом нефильтрованную кровь с добавками. Полученный раствор фильтровали при помощи фильтра, включающего полиэстерный нетканый материал С, покрытый полимерами, полученными в каждом из Примеров 10, 11 и 12 и с помощью силы притяжения с высоты 100 см, и кровь собирали, получая таким образом фильтрованную кровь с добавками. Нефильтрованную кровь с добавками и фильтрованную кровь с добавками центрифугировали при 4000g в течение 30 минут, супернатанты разделяли на аликвоты. К супернатантам добавляли протеазу К до концентрации 25 ед/мл, и смеси центрифугировали при 100000g и 4°С±2°С в течение 1 часа. После центрифугирования осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов, и суспензии инкубировали при 100°С±5°С в течение 5-10 минут.

[Анализ титра патологического прионного белка]

Продукты крови нефильтрованной крови с добавками и фильтрованной крови с добавками добавляли к буферу для образцов, смеси нагревали и далее выявляли патологический прионный белок с помощью стандартного способа Вестерн-блоттинга, используя в качестве первых антител антитела 3F4, специфически связывающиеся с прионным белком. Анализ всех продуктов нефильтрованной крови с добавками и фильтрованной крови с добавками повторяли несколько раз в серии непрерывных троекратных разведений, ED₅₀ определяли по Spearman (Brit. J. Of Psychology 1908; 2: 227 ff.) и Kaerber (Naunyn Schmiedeberg's Arch. Exp. Path. Pharmak. 1931; 152: 380 ff.). Далее все величины приводили к ED₅₀ на единицу объема (1 мл), логарифм этой величины принимался за титр. Способ расчета ED₅₀ приведен ниже.

[Формула 1]

Y₀ - положительная экспонента наивысшего разведения образца, показывающего положительные результаты теста во всех параллельных разведениях;

d - логарифм шага разведения;

ΣY_i - сумма процентного содержания образцов, где патологический прионный белок выявлялся при разведении образца в Y₀ раз или более.

[Эффективность удаления патологического прионного белка]

Эффективность удаления патологического прионного белка рассчитывали по следующей формуле (4).

Эффективность удаления патологического прионного белка = титр патологического прионного белка в нефильтрованной крови с добавками - титр патологического прионного белка в фильтрованной крови с добавками (4)

[Пример 1]

Полимеризацию проводили путем добавления по каплям раствора этанола, полученного путем растворения полимеризуемых мономеров и инициирующего диазо-соединения в этаноле, используемом в качестве растворителя для полимеризации, при помешивании, при 78°С в атмосфере азота.

Заряженные полимеризуемые мономеры включают 20 молярных процентов метилметакрилата (ниже обозначенного как «ММА»), используемого в качестве гидрофобного полимеризуемого мономера, 5 молярных процентов диметиламиноэтилметакрилата (ниже обозначенного как «DM»), используемого в качестве полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, 75 молярных процентов 2-гидроксиэтилметакрилата (ниже обозначенного как «HEMA»), используемого в качестве мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть. Раствор полимера очищали с помощью избытка воды и высушивали при пониженном давлении. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Результаты практически совпадали с композицией заряженного полимеризуемого мономера, с композициями сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере, равными 20 молярных процентов, 5 молярных процентов и 75 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 210000. В качестве покрывающего растворителя использовался этанол, использовалась концентрация полимера 0,8 мас./об.%. Раствором полимера в вышеприведенной концентрации покрывали полиэстерный нетканый материал С, используемый в качестве материала. Покрытое количество составляло 21 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 1 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,12, 9,8 кПа, 0,2% и 2,0 или более соответственно.

[Пример 2]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 20 молярных процентов MMA, 13 молярных процентов DM и 67 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 20 молярных процентов, 13 молярных процентов и 67 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 250000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 22 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 1 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,68, 8,1 кПа, 0,5% и 2,0 или более соответственно.

[Пример 3]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 210000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 2 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,68, 11,4 кПа, 0,4% и 3,8 соответственно.

[Пример 4]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 40 молярных процентов MMA, 5 молярных процентов DM и 55 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 40 молярных процентов, 5 молярных процентов и 55 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 170000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 22 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 1 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,17, 12,5 кПа, 0,3% и 2,0 или более соответственно.

[Пример 5]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 40 молярных процентов MMA, 13 молярных процентов DM и 47 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 40 молярных процентов, 13 молярных процентов и 47 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 180000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 22 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 3 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,68, 10,9 кПа, 0,5% и 2,4 соответственно.

[Пример 6]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 210000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 4 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,86, 13,2 кПа, 0,4% и 1,5 соответственно.

[Пример 7]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 210000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 5 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,12, 11,5 кПа, 0,3% и 1,2, соответственно.

[Пример 8]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 210000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 5 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,68, 12,0 кПа, 0,3% и 1,6 соответственно.

[Пример 9]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 210000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 5 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,43, 11,8 кПа, 0,2% и 1,7 соответственно.

[Пример 10]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов этилметакрилата (обозначенного ниже как «EMA»), 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации ЕMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 220000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 19 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 6 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,22, 10,5 кПа, 0,3% и 4,1 или более соответственно.

[Пример 11]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов диэтиламиноэтилметакрилата (далее обозначаемого как «DE») и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации EMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 200000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 6 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,58, 12,3 кПа, 0,4% и 4,1 или более соответственно.

[Пример 12]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 60 молярных процентов гидроксипропилметакрилата (далее обозначаемого как «HPMA»). Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HPMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 280000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 22 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 6 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,83, 15,0 кПа, 0,2% и 4,1 или более соответственно.

[Пример 13]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 40 молярных процентов бутилакрилата (далее обозначаемого как «BA»), используемого в качестве гидрофобного полимеризуемого мономера, 10 молярных процентов диэтиламиноэтилакрилата (далее обозначаемого как «DEA»), используемого в качестве полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и 50 молярных процентов гидроксибутилакрилата (далее обозначаемого как «HBA»), используемого в качестве мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации BA, DEA и HPA в полимере составляли 40 молярных процентов, 10 молярных процентов и 50 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 150000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 21 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 1 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,75, 11,5 кПа, 0,3% и 2,0 или более соответственно.

[Сравнительный Пример 1]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 3 молярных процентов DM и 67 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 3 молярных процентов и 67 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 200000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 19 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 3 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,88, 10,2 кПа, 0,2% и 0,5 соответственно. В случае, когда композиция полимеризации полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, составляла менее 5 молярных процентов, понижалась адсорбция патологического прионного белка, что приводило к уменьшению эффективности удаления патологического прионного белка.

[Сравнительный пример 2]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 16 молярных процентов DM и 54 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 16 молярных процентов и 54 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 190000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 21 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора и уровень гемолиза после фильтрации тестировали описанными выше способами. Давление во время обработки крови и уровень гемолиза составляли 11,8 кПа, 2,3% соответственно. В случае фильтрации при охлаждении при повышении в композиции сополимеризации полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, наблюдался гемолиз, так что уровень гемолиза не соответствовал стандарту (0,8%).

[Сравнительный Пример 3]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 15 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 75 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 15 молярных процентов, 10 молярных процентов и 75 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 220000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 20 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 3 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,11, 7,8 кПа, 0,3% и 0,5 соответственно.

[Сравнительный Пример 4]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 45 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов DM и 45 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, DM и HEMA в полимере составляли 45 молярных процентов, 10 молярных процентов и 45 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 180000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 22 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора и уровень гемолиза после фильтрации тестировали описанными выше способами. Однако тест был прекращен из-за низкой текучести продукта крови, высокого давления во время обработки (более 60 кПа) и опасения поломки шланга и шприца, так что измерение эффективности удаления лейкоцитов и уровня гемолиза не представлялось возможным.

[Сравнительный Пример 5]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 3 молярных процентов DM и 97 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации DM и HEMA в полимере составляли 3 молярных процента и 97 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 550000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С с удельной площадью поверхности 1,47 м²/г, средним диаметром волокон 1,2 мкм и массой на единицу площади 40 г/м². Покрытое количество составляло 7 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 2 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,92, 6,8 кПа, 0,2% и 0,2 соответственно.

[Сравнительный Пример 6]

Использовали полиэстерный нетканый материал С с удельной площадью поверхности 1,47 м²/г, средним диаметром волокна 1,2 мкм и массой на единицу площади 40 г/м² без полимерного покрытия. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 2 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 4,55, 20,3 кПа, 0,2% и 0,0 соответственно.

[Сравнительный Пример 7]

В качестве кислого мономера использовали метакриловую кислоту, содержащую карбоксильную группу (далее обозначена «МАА»).

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 30 молярных процентов MMA, 10 молярных процентов МАА и 60 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA, MAA и HEMA в полимере составляли 30 молярных процентов, 10 молярных процентов и 60 молярных процентов, соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 230000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С. Покрытое количество составляло 22 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 3 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 5,36, 10,0 кПа, 0,4% и 0,0 соответственно. Полимер, содержащий кислый мономер, оказался неэффективным в отношении удаления патологического прионного белка.

[Сравнительный пример 8]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 10 молярных процентов DM и 90 молярных процентов HEMA. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации DM и HEMA в полимере составляли 10 молярных процентов и 90 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 500000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С с удельной площадью поверхности 1,47 м²/г, средним диаметром волокна 1,2 мкм и массой на единицу площади 40 г/м² в качестве материала. Покрытое количество составляло 18 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора, уровень гемолиза после фильтрации и эффективность удаления патологического прионного белка по способу 3 тестировали описанными выше способами. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время обработки крови, уровень гемолиза и эффективность удаления патологического прионного белка составляли 3,75, 15,0 кПа, 0,3% и 0,5 соответственно.

[Сравнительный Пример 9]

Полимеризацию, очистку и сушку проводили аналогично Примеру 1, за исключением использования отношения заряда мономеров 90 молярных процентов MMA и 10 молярных процентов DM. Композицию сополимеризации полимера анализировали с помощью 1Н-ЯМР. Композиции сополимеризации MMA и DM в полимере составляли 90 молярных процентов и 10 молярных процентов соответственно. Средний молекулярный вес (Mw) составлял 240000. Раствором полимера в концентрации 0,8 мас./об.% в этаноле, использующемся как покрывающий растворитель, покрывали полиэстерный нетканый материал С с удельной площадью поверхности 1,47 м²/г, средним диаметром волокна 1,2 мкм и массой на единицу площади 40 г/м² в качестве материала. Покрытое количество составляло 21 мг/м² на единицу площади на всей площади поверхности материала. Эффективность удаления лейкоцитов, давление во время сбора и уровень гемолиза после фильтрации тестировали описанными выше способами. Однако тест был прекращен из-за низкой текучести продукта крови, высокого давления во время обработки (более 60 кПа) и опасения поломки шланга и шприца, так что измерение эффективности удаления лейкоцитов и уровня гемолиза не представлялось возможным.

[Сравнительный Пример 10]

Проводили тест 4 эффективности удаления патологического прионного белка с использованием имеющегося в продаже фильтра для удаления лейкоцитов для продукта цельной крови (WBF2, производство Pall), и эффективность удаления патологического прионного белка составила 0,4.

В Таблице 1 приведены результаты Примеров и Сравнительных Примеров. В Таблице 1 стерилизация электронным лучом и стерилизация автоклавированием обозначаются как EB и AC соответственно.

Применимость в промышленности

Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови согласно настоящему изобретению применим для предотвращения переноса при переливании крови трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), вызываемой патологическим прионным белком в клинической области переливания крови, и для предотвращения побочных эффектов переливания крови, вызванных лейкоцитами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ удаления патологического прионного белка из продукта крови. Осуществляют фильтрацию продукта крови через фильтр, заполненный носителем, покрытым полимером. Данный полимер образован тремя элементами: элементом, происходящим из гидрофобного полимеризуемого мономера, элементом, происходящим из полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и элементом, происходящим из полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть в качестве баланса. После фильтрации проводят сбор продукта крови. Способ обеспечивает эффективное удаление патологического прионного белка из продукта крови с одновременным удалением лейкоцитов. Эффективность удаления патологического прионного белка составляет от 1,2 до 4,1 и более. 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови, отличающийся тем, что включает
фильтрацию продукта крови через фильтр, заполненный носителем, покрытым полимером, образованным тремя элементами, включающими 20 мол.% или более и 40 мол.% или менее элемента, происходящего из гидрофобного полимеризуемого мономера, 5 мол.% или более и 13 мол.% или менее элемента, происходящего из полимеризуемого мономера, содержащего основную азотсодержащую часть, и элемента, происходящего из полимеризуемого мономера, содержащего протонную нейтральную гидрофильную часть в качестве баланса; сбор профильтрованного продукта крови.

2. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.1, отличающийся тем, что продукт крови представляет собой продукт цельной крови, и фильтр подвергают стерилизации облучением и затем стерилизации автоклавированием.

3. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.2, отличающийся тем, что облучение представляет собой γ-лучи или электронные лучи.

4. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что полимер представляет собой полимер винилового типа.

5. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.1, отличающийся тем, что гидрофобный полимеризуемый мономер, полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, и полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, представляют собой производные акриловой кислоты и/или производные метакриловой кислоты.

6. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.5, где основная азотсодержащая часть представляет собой третичную аминогруппу.

7. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.5, где протонная нейтральная гидрофильная часть представляет собой гидроксильную группу.

8. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.5, где основная азотсодержащая часть представляет собой третичную аминогруппу, а протонная нейтральная гидрофильная часть представляет собой гидроксильную группу.

9. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.1, где гидрофобный полимеризуемый мономер, полимеризуемый мономер, содержащий основную азотсодержащую часть, и полимеризуемый мономер, содержащий протонную нейтральную гидрофильную часть, представляют собой производные акриловой кислоты и/или производные метакриловой кислоты, а фильтр представляет собой фильтр для удаления лейкоцитов.

10. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.9, где основная азотсодержащая часть представляет собой третичную аминогруппу.

11. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.9, где протонная нейтральная гидрофильная часть представляет собой гидроксильную группу.

12. Способ удаления патологического прионного белка из продукта крови по п.9, где основная азотсодержащая часть представляет собой третичную аминогруппу, а протонная нейтральная гидрофильная часть представляет собой гидроксильную группу.