СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2008 года по МПК A61K36/534 A61K36/185 A61K36/28 A61P29/00 

Изобретение относится к фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.

Воспаление, как общебиологическая реакция на различные патогенные раздражители, лежит в основе многочисленной группы заболеваний и нередко приводит к потере трудоспособности и инвалидизации населения. Применение синтетических препаратов с противовоспалительным действием в эксперименте и клинике сопровождается развитием выраженных побочных реакций и осложнений. Недостатки используемых средств и возрастающие требования современной терапии актуализируют изыскание новых, эффективных и малотоксичных антифлогистиков среди лекарственных растений, которые могли бы оказывать комплексное действие, обеспечивать пролонгированный эффект с минимумом побочных явлений и возможностью длительного применения.

Целью предлагаемого способа является повышение выхода экстрактивных веществ за счет использования смеси из широко распространенных видов растительного сырья. Технический результат изобретения - получение средства из смеси растительного состава, обладающего противовоспалительной активностью.

Указанная цель достигается посредством того, что способ включает экстракцию 80%-ным и 40%-ным раствором этанола высушенной и измельченной до размера частиц 0,5-2,0 мм смеси следующего растительного состава:

черные листья бадана толстолистного - 3,0 ч.

цветки ромашки аптечной - 2,8 ч.

трава тысячелистника обыкновенного - 2,4 ч.

листья мяты перечной - 1,8 ч.

Растительную смесь экстрагируют дважды 80% этанолом в соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Спиртовые извлечения объединяют, удаляют спирт, оставшийся шрот экстрагируют дважды 40% этанолом при 90±5°С в соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) при постоянном помешивании в течение 1 ч. Спиртовые извлечения объединяют, удаляют спирт, водный экстракт объединяют с водным остатком после экстракции 80% этанолом, концентрируют до 1/5 первоначального объема. Конечный продукт получают сепарированием и затем высушиванием сгущенного экстракта в вакуум-сушильном шкафу. Предлагаемый способ получения суммы экстрактивных веществ достаточно прост, не требует трудоемких затрат, позволяет получить продукт постоянного состава.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию «новизна». Для доказательства существенности предложенных признаков способа, а именно концентрации экстрагента, соотношения сырье:экстрагент, длительности и кратности процесса экстракции были проведены серии экспериментов, данные которых представлены ниже.

Измельчение сырья проводили согласно требованиям ГФ XI издания. Выбор оптимальных параметров экстракции контролировали по выходу действующих веществ - каротиноидов и полифенолов. Содержание каротиноидов в извлечениях определяли спектрофотометрическим [О.В.Евдокимова, И.А.Самылина, О.В.Нестерова. Определение содержания], полифенолов (дубильных веществ) - титриметрическим [Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа. МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина. - 1987. - 337 с.] методами.

Для определения полноты извлечения экстрактивных веществ из растительной смеси проведена последовательная исчерпывающая экстракция смеси растворителями разной полярности в аппарате Сокслета. Для этого 30,0 г растительной смеси, измельченной до размера частиц 0,5 мм, поместили в пакетик из фильтровальной бумаги, пакетик поместили в аппарат Сокслета, экстрагировали последовательно гексаном, хлороформом, 96% этанолом, 40% этанолом и кипящей водой до полного истощения сырья. Получено 0,86 г (2,87%) маслянистого остатка гексанового: 2,61 г (8,7%), маслянистого хлороформного: 6,37 г (21,23%), маслянистого 96% спиртового: 4,33 г (14,43%), 40% спиртового и 1,44 г (4,80%) водного извлечения. Общий выход экстрагируемых липофильных и гидрофильных веществ составил 52,03%. Большая часть экстрактивных веществ (68,5% от суммы экстрагируемых всеми растворителями веществ) извлекается спиртом высокой и средней (96% и 40%) концентрации.

Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья горячей водой, этиловым спиртом различной концентрации: 20, 40, 60, 80, 96%. Результаты анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние концентрации экстрагента на выход каротиноидов и полифеноловЭкстрагентВыход экстрактивных веществ, %Выход каротиноидов, мг %Выход полифенолов, %Вода (90-100°С)32,07-4,32Этанол 20%30,07-4,6840%30,010,225,6460%27,340,735,3080%24,204,763,4896%9,75,982,01Примечание: прочерк означает, что вещества не обнаружены.

Установлено, что каротиноиды наиболее полно извлекаются спиртом высокой концентрации - 80-96% этанолом, а 40% этанол экстрагирует максимальное количество полифенолов. Извлечения, полученные экстракцией 96% спиртом после удаления спирта, представляют собой маслянистую массу, плохо смешивающуюся с водным остатком 40%-ного этанольного извлечения. Для извлечения каротиноидов выбран 80% этанол, для полифенолов - 40% этанол.

Для изучения влияния степени измельчения растительной смеси на выход каротиноидов и полифенолов смесь измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мм. Установлено, что оптимальной степенью измельчения для растительной смеси является размер частиц 0,5-2,0 мм (табл.2).

Таблица 2
Выход каротиноидов и полифенолов в зависимости от степени измельчения сырьяСтепень измельчения сырья, ммВыход каротиноидов, мг %Выход полифенолов, %0,55,086,281,04,875,822,04,715,623,04,025,165,03,254,72

Проведено изучение зависимости выхода действующих веществ от соотношения сырье:экстрагент, данные анализа представлены в таблице 3. Оптимальное соотношение составляет 1:(10-12), дальнейшее увеличение объема экстрагента нецелесообразно, так как выход действующих веществ существенно не повышается.

Таблица 3
Выход каротиноидов и полифенолов в зависимости от соотношения сырье:экстрагентСоотношение сырье:экстрагентВыход каротиноидов, мг %Выход полифенолов, %1:84,714,421:104,915,011:114,985,941:125,136,341:155,206,451:205,826,93

Изучена зависимость выхода полифенолов от температуры экстракции. Настаивание смеси проводили при температуре 40; 60; 80; 90; 100 (кипящая водяная баня) °С. Оптимальный температурный режим экстракции составляет 90±5°С, при котором достигается максимальный выход полифенолов (табл.4). Учитывая термолабильность каротиноидов, извлечение их проводят при комнатной температуре.

Таблица 4
Выход полифенолов в зависимости от температуры экстракцииТемпература экстракции, °СВыход полифенолов, %40±54,7260±55,2580±55,7590±55,94100 (кипящая водяная баня)6,03

Продолжительность настаивания и кратность числа экстракции определены отдельно для экстракции 80% и 40% этанолом (табл.5-6).

1. Экстракция растительной смеси 80% этанолом. К 5,0 г (точная навеска) смеси приливали 50 мл 80% этанола, экстрагировали в течение 2 ч при постоянном помешивании на механической мешалке. Через определенный промежуток времени (1 ч; 2 ч; 4 ч; 6 ч) извлечение фильтровали (I контакт фаз). В тех же условиях проводили последующие 2 экстракции шрота, добавляя каждый раз 80% этанол в объеме, равном слитому (II и III контакт фаз). В извлечениях определяли содержание каротиноидов. Установлено, что при постоянном помешивании в течение 2 ч растительной смеси извлекается до 75% каротиноидов, при втором контакте фаз - 21% (табл.5). Для полноты извлечения каротиноидов достаточно двукратной экстракции 80% этанолом в течение 2 ч при постоянном помешивании.

Таблица 5
Выход каротиноидов в зависимости от времени и кратности экстракцииВремя экстракции, часВыход каротиноидов, мг %I контакт фазII контакт фазIII контакт фаз1 ч3,321,240,602 ч5,071,410,254 ч5,171,400,206 ч5,211,440,19

2. Экстракция 40% этанолом. К 5,0 г (точная навеска) смеси приливали 50 мл 40% этанола, колбу присоединяли с обратным холодильником, экстрагировали на водяной бане при температуре 90±5°С. Через определенный промежуток времени (0,5 ч; 1 ч; 1,5 ч; 2 ч, 2,5 ч; 3,0 ч) извлечение фильтровали (I контакт фаз). В тех же условиях провели последующие 2 экстракции шрота, прибавляя каждый раз 40% этанол в объеме, равном слитому (II и III контакт фаз). В извлечениях определяли содержание полифенолов. Установлено, что 40% этанол при температуре 90±5°С в течение 1 ч извлекает до 79% полифенолов, при втором контакте фаз - 16%, при третьем - 5% (табл.6). Для полноты извлечения полифенолов достаточно двукратной экстракции 40% этанолом в течение 1 ч при температуре 90±5°С.

В результате проведенных анализов установлено, что оптимальными условиями экстрагирования растительной смеси являются: 80% этанол для извлечения каротиноидов при комнатной температуре, 40% этанол для извлечения полифенолов при температуре 90±5°С, соотношение сырье:экстрагент - 1:(10-12), степень измельчения сырья - 0,5-2,0 мм, кратность экстракции - 4 (по две экстракции 80%-ным в течение 2 ч каждая и 40%-ным этанолом в течение 1 ч каждая).

Таблица 6
Выход полифенолов в зависимости от времени и кратности экстракцииВремя экстракции, часВыход полифенолов, %I контакт фазII контакт фазIII контакт фаз0,5 ч4,800,910,351,0 ч5,751,160,291,5 ч5,731,130,212,0 ч5,661,230,332,5 ч5,761,210,343,0 ч5,811,360,27

Предлагаемый способ позволяет получить продукт постоянного состава с выраженной противовоспалительной активностью, что обусловливается большим содержанием липофильных и гидрофильных веществ. В полученных сухих экстрактах определено содержание каротиноидов, аскорбиновой кислоты, флавоноидов в пересчете на рутин, антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-дигликозид, полифенолов по методикам ГФ XI изд. Полученный по предложенному способу сухой экстракт (условно названный «Фитокол») представляет собой негигроскопичный порошок темно-коричневого цвета со специфическим запахом, содержит 9,77±0,17% полифенолов в пересчете на таннин; 16,29±0,07 мг % каротиноидов в пересчете на β-каротин; 6,58±0,05% аскорбиновой кислоты; 1,35±0,01% антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-дигликозид; 0,14±0,01% флавоноидов в пересчете на рутин.

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1. 1000 г растительной смеси, состоящей из 300 г черных листьев бадана толстолистного, 280 г цветков ромашки аптечной, 240 г травы тысячелистника обыкновенного, 180 г листьев мяты, измельченных до размера частиц 0,5 мм, загружали в экстрактор, заливали 10,0 л 80% этилового спирта, экстрагировали при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение сливали в сборник, отфильтровывали под вакуумом. Объем слива - 7,87 л, шрот заливали 80% спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 2 ч. Второе извлечение отфильтровывали, объем II слива - 7,60 л. Объединенный 80% спиртовый экстракт (15,47 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся шрот заливали 10,0 л 40% этилового спирта, экстрагировали при температуре 90±5°С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Третье извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 9,80 л. Шрот заливали 40% этиловым спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 1 ч. Четвертое извлечение сливали, отфильтровывали, объем слива - 9,70 л. Объединенный 40% этанольный экстракт (19,50 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта, водный остаток объединяли с водным остатком 80% этанольного экстракта, очищали на сепараторе от балластных веществ и растительной пыли. Кубовой остаток от четырех извлечений упаривали до сиропообразного состояния (1,5 л), высушивали в вакуум-сушильном шкафу в течение 8 ч при температуре 60±5°С. Получили 350,0 г сухого экстракта темно-коричневого цвета, выход - 35,0% от массы исходного сырья. Потеря в массе при высушивании - 3,45%.

Изучение острой токсичности водного раствора фитокола при однократном внутрибрюшинном и внутрижелудочном способе введения проводили на крысах обоего пола линии Wistar массой 140-150 г с использованием пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1963. - С.81-107]. Наблюдение за общим состоянием животных и их поведением осуществляли в течение 14 дней. Одновременно регистрировали наблюдаемые признаки интоксикации: общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие судорог, нарушение координации движений, изменение тонуса скелетных мышц, реакцию на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние шерстного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, потребление корма, частоту мочеиспускания и окраску мочи. Также регистрировали сроки развития интоксикации и гибели животных. Погибших в эксперименте животных вскрывали и проводили макроскопический осмотр внутренних органов, а также осуществляли патоморфологическое исследование жизненно важных органов (степень кровенаполнения органов, наличие изъязвлений слизистых оболочек и др.).

В результате проведенных исследований установлено, что при однократном внутрибрюшинном введении фитокола DL₅₀ составляла 2500 мг/кг (2440,1÷2670). Животные погибали преимущественно через 1-3 суток с момента введения испытуемого фитоэкстракта. В первые часы после введения фитокола в высоких дозах наблюдались признаки интоксикации в виде тахикардии, учащения дыхания, снижения двигательной активности, потери аппетита. В последующем у животных, получавших высокие дозы испытуемого фитоэкстракта, дыхание становилось поверхностным, появлялась цианостичность видимых слизистых оболочек, подергивания отдельных групп мышц, а также развивались судороги клонико-тонического характера. Гибель животных наступала при остановке дыхания. При макроскопическом и микроскопическом осмотре внутренних органов погибших крыс отмечались гемодинамические нарушения во внутренних органах в виде полнокровия сосудов с явлениями стаза, мелкоточечных кровоизлияний под плевру легких и эпикард, в легких встречались крупные и мелкие геморрагические участки, по краям легких наблюдали явления очаговой эмфиземы.

При однократном внутрижелудочном введении фитокола во всех исследованных дозах (от 500 до 8000 мг/кг) гибели животных в течение всего периода наблюдения (14 суток) не отмечали. Максимальная доза фитокола составила 8000 мг/кг (максимальное количество испытуемого фитосредства, растворение которого возможно в объеме воды, исходя из расчета 10 мл/кг). При введении высоких доз фитокола (7500 - 8000 мг/кг) в течение первых двух суток у животных наблюдали признаки общей интоксикации в виде гиподинамии, потери аппетита, незначительного учащения дыхания. В последующие дни наблюдения признаки интоксикации животных не регистрировались и DL₅₀ установить не удавалось.

Таким образом, при внутрижелудочном введении фитокол характеризуется хорошей переносимостью и относится к малотоксичным веществам - IV классу токсичности по классификации токсичности химических веществ, принятой в России и ВОЗ [Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М., 1973. - Вып.13. - С.47-51].

В дальнейшем исследовали противовоспалительную активность фитокола с использованием моделей асептического воспаления, позволяющих оценить его влияние на основные стадии воспалительного процесса: экссудацию, альтерацию и регенерацию. Также исследовали анальгезирующее действие фитокола.

Полученные данные обработаны статистически с использованием U-критерия Манна-Уитни [Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М., 2000. - 263 с.]. Различия считали достоверными при Р≤0,05.

Изучено влияние фитокола на экссудативную фазу воспалительного процесса.

Антиэкссудативную активность фитокола определяли на модели острого асептического воспаления задней конечности крыс с применением флогогенного агента формалина. Исследование проведено на крысах обоего пола линии Wistar массой 160-170 г. Воспроизведение острого асептического воспаления конечности осуществляли по методу Ю.В.Стрельникова [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.]. Фитокол вводили внутрижелудочно в дозах 250 (1/10 DL₅₀), 200 и 150 мг/кг в объеме 10 мл/кг за 3 часа до субплантарного введения крысам в правую заднюю лапку 0,1 мл 3% раствора формалина, а затем через 5 и 18 часов после этого. Животным контрольной группы по аналогичной схеме в равном объеме вводили воду очищенную. В качестве препарата сравнения использовали сбор, состоящий из травы зверобоя продырявленного, листьев мяты перечной, цветков ромашки аптечной, плодов укропа огородного, корней и корневищ валерианы обыкновенной [Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия. - Новосибирск, 2003. - 368 с.]. Указанный сбор назначали в виде отвара в объеме 10 мл/кг по аналогичной схеме. Через 24 часа после введения формалина проводили оценку антиэкссудативного эффекта фитокола онкометрическим методом с использованием формулы:

% угнетения отека = Р_к-Р/Р_к, где:

Р_к - разность объема лапок с отеком и без отека у животных контрольной группы;

Р - разность объема лапок с отеком и без отека у животных опытной группы, получавших фитокол.

Полученные данные приведены в таблице 7.

Таблица 7
Влияние фитокола на экссудативную фазу воспаления при формалиновом отеке лапок у крысГруппы животныхДоза, мг/кгРазность объема лапок с отеком и без отека, мл% угнетения отекаКонтрольная (формалин + вода очищенная)-0,75±0,04-Опытная 1 (формалин + фитокол)2500,50±0,01*34,0Опытная 2 (формалин + фитокол)2000,58±0,02*23,0Опытная 3 (формалин + фитокол)1500,60±0,01*20,0Опытная 4 (формалин + калефлон)1000,61±0,02*19,0*Примечание: - здесь и далее разность достоверна по сравнению с контролем при Р≤0,05

Из приведенных в таблице 7 данных следует, что фитокол в дозах от 150 до 250 мг/кг оказывает антиэкссудативное действие, снижая выраженность отечности лапок крыс на 20,0-34,0% по сравнению с показателями у крыс контрольной группы, причем наиболее выраженный антиэкссудативный эффект фитокола проявляется в дозе 250 мг/кг. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовали указанную дозу фитокола. Препарат сравнения калефлон также оказывает антиэкссудативное действие, но в менее выраженной степени.

Пример 2. 1000 г растительной смеси, состоящей из 300 г черных листьев бадана толстолистного, 280 г цветков ромашки аптечной, 240 г травы тысячелистника обыкновенного, 180 г листьев мяты, измельченных до размера частиц 1,0 мм, загружали в экстрактор, заливали 11,0 л 80% этилового спирта, экстрагировали при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение сливали в сборник, отфильтровали под вакуумом. Объем слива - 8,50 л, шрот заливали 80% спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 2 ч. Второе извлечение отфильтровали, объем II слива - 8,90 л. Объединенный 80% спиртовый экстракт (16,80 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся шрот заливали 11,0 л 40% этилового спирта, экстрагировали при температуре 90±5°С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Третье извлечение сливали, отфильтровали под вакуумом, объем слива - 10,60 л. Шрот заливали 40% этиловым спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 1 ч. Четвертое извлечение сливали, отфильтровали, объем слива - 10,20 л. Объединенный 40% этанольный экстракт (20,80 л) упарили на роторном испарителе для удаления спирта, водный остаток объединили с водным остатком 80% этанольного экстракта, очистили на сепараторе от балластных веществ и растительной пыли. Кубовой остаток от четырех извлечений упарили до сиропообразного состояния (1,6 л), высушили в вакуум-сушильном шкафу в течение 8 ч при температуре 60±5°С. Получили 323,0 г сухого экстракта темно-коричневого цвета, выход - 32,3% от массы исходного сырья. Потеря в массе при высушивании - 2,15%.

Изучено влияние фитокола на фазу альтерации воспалительного процесса. Опыты проведены на крысах обоего пола линии Wistar массой 150-170 г. Моделирование воспалительного процесса осуществляли по методу Менкина [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.] путем подкожного введения 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты (СН₃СООН) в область спины с предварительно выстриженной шерстью. Одновременно с этим крысам внутрибрюшинно вводили раствор декстрана в дозе 300 мг/кг. Первое внутрижелудочное введение фитокола в дозе 250 мг/кг в объеме 10 мл/кг осуществляли за 1 час до введения уксусной кислоты, а затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 25 дней. Животные контрольной группы получали воду очищенную по аналогичной схеме в эквиобъемных количествах. В качестве препарата сравнения использовали сбор, состоящий из травы зверобоя продырявленного, листьев мяты перечной, цветков ромашки аптечной, плодов укропа огородного, корней и корневищ валерианы обыкновенной [Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия. - Новосибирск, 2003. - 368 с.]. Указанный сбор назначали в форме отвара в объеме 10 мл/кг по аналогичной схеме. На 2, 9 и 25 сутки эксперимента оценивали площадь некротизированной ткани планиметрическим методом. Полученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8
Влияние фитокола на процессы альтерации и регенерации при остром асептическом воспалении у крысГруппы животныхПлощадь альтерации, см²2 сутки9 сутки25 суткиКонтрольная (СН₃СООН + вода очищенная)3,35±0,032,99±0,051,41±0,01Опытная 1 (СН₃СООН + фитокол)2,68±0,05*1,72±0,04*1,05±0,03*Опытная 2 (СН₃СООН + препарат сравнения)2,99±0,042,68±0,041,48±0,02

Как следует из данных, приведенных в таблице 8, введение фитокола в указанной дозе крысам оказывает антиальтеративное действие, снижая степень деструкции ткани при воздействии флогогенного агента уже на ранних сроках наблюдения. Так, через 2 и 9 суток после введения уксусной кислоты площадь альтерации уменьшается на 20 и 43% соответственно по сравнению с показателями у крыс контрольной группы. Препарат сравнения оказывает менее выраженное антиальтеративное действие.

Пример 3. 1000 г растительной смеси, состоящей из 300 г черных листьев бадана толстолистного, 280 г цветков ромашки аптечной, 240 г травы тысячелистника обыкновенного, 180 г листьев мяты, измельченных до размера частиц 2,0 мм, загружали в экстрактор, заливали 12,0 л 80% этилового спирта, экстрагировали при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение сливали в сборник, отфильтровывали под вакуумом. Объем слива - 9,45 л, шрот заливали 80% спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 2 ч. Второе извлечение отфильтровывали, объем II слива - 9,30 л. Объединенный 80% спиртовый экстракт (18,75 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся шрот заливали 12,0 л 40% этилового спирта, экстрагировали при температуре 90±5°С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Третье извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 11,80 л. Шрот заливали 40% этиловым спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 1 ч. Четвертое извлечение сливали, отфильтровывали, объем слива - 11,50 л. Объединенный 40% этанольный экстракт (23,30 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта, водный остаток объединяли с водным остатком 80% этанольного экстракта, очищали на сепараторе от балластных веществ и растительной пыли. Кубовой остаток от четырех извлечений упаривали до сиропообразного состояния (1,5 л), высушивали в вакуум-сушильном шкафу в течение 8 ч при температуре 60±5°С. Получали 328,0 г сухого экстракта темно-коричневого цвета, выход - 32,8% от массы исходного сырья. Потеря в массе при высушивании - 2,07%.

Изучено влияние фитокола на пролиферативные процессы при воспалительном процессе. Эксперименты проведены на крысах линии Wistar обоего пола массой 170-180 г. Воспалительную реакцию вызывали по методу Тринус и соавт. [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.]: стерильные ватные шарики массой 15 мг имплантировали под кожу крыс в области спины в асептических условиях. Фитокол вводили внутрижелудочно в дозе 250 мг/кг в объеме 10 мл/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней (опытная группа 1). Животным контрольной группы вводили в эквиобъемных количествах по аналогичной схеме воду очищенную В качестве препарата сравнения использовали сбор в форме отвара в объеме 10 мл/кг (опытная группа 2), состоящий из травы зверобоя продырявленного, листьев мяты перечной, цветков ромашки аптечной, плодов укропа огородного, корней и корневищ валерианы обыкновенной [Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия. - Новосибирск, 2003. - 368 с.]. Через 7 суток извлекали гранулемы и проводили взвешивание на аналитических весах в сыром виде (сразу после извлечения) и после высушивания при температуре 70°С в течение 24 часов (до постоянной массы). Пролиферативную реакцию оценивали по разнице между массой сухой гранулемы и исходной массой ватного шарика (15 мг), а антиэкссудативную активность - по разнице между массой влажной и сухой гранулем. Полученные данные приведены в таблице 9.

Таблица 9
Влияние фитокола на течение хронической пролиферативной фазы воспаления у крысГруппы животныхРазница между массой сухой гранулемы и исходной массой ватного шарика, мгРазница между массой влажной и сухой гранулем, мгКонтрольная40,20±1,61235,22±6,31Опытная 138,23±1,64264,00±8,27Опытная 238,64±2,04223,23±10,21

В результате исследований установлено (табл.9), что фитокол в дозе 250 мг/кг практически не влияет на образование фиброзно-грануляционной ткани на фоне хронического пролиферативного воспаления у крыс

Изучали влияние фитокола на порог болевой чувствительности с использованием модели патологической боли «корчи» [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.]. В экспериментах использовали крыс обоего пола линии Wistar массой 160-170 г. Модель воспроизводили однократным внутрибрюшинным введением 0,75% раствора уксусной кислоты. Фитокол вводили крысам внутрь в дозе 250 мг/кг в объеме 10 мл/кг за 45-60 минут до введения уксусной кислоты. Контрольной группе крыс вводили воду очищенную в аналогичных условиях в эквиобъемных количествах. Через 10 минут после введения уксусной кислоты регистрировали количество специфических ноцицептивных ответов типа «корчи» у контрольных и опытных животных. Выраженность анальгезии оценивали по формуле:

А=(Р_к-Р_о)Р_к×100%, где

А - коэффициент анальгезии;

Р_к - количество ответов типа «корчи» за 10 минут у животных в контроле;

Р_о - количество ответов типа «корчи» у животных опытной группы после введения исследуемого фитосредства. Результаты эксперимента представлены в таблице 10.

Таблица 10
Влияние фитокола на развитие уксусных «корчей» у крысГруппы животныхЛатентный период, минКоличество «корчей», у.е.Анальгетический эффект, %Контрольная6,22±0,1151,60±0,96-Опытная11,22±0,93*20,42±0,39*61

Результаты исследований показали, что фитокол в дозе 250 мг/кг проявляет анальгезирующую активность. После введения фитокола на 80% увеличивается латентный период появления «корчей», а количество специфических ноцицептивных ответов на химический раздражитель снижается на 61%.

Таким образом, данные проведенных исследований показывают, что испытуемый экстракт «фитокол» в дозе 250 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, оптимизируя течение воспалительной реакции, что, очевидно, обусловлено наличием в нем комплекса липофильных и гидрофильных биологически активных веществ.

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительной смеси, содержащей, мас.ч.: черные листья бадана толстолистного - 3,0; цветы ромашки аптечной - 2,8; траву тысячелистника обыкновенного - 2,4; листья мяты перечной - 1,8. Растительную смесь, измельченную до размера частиц 0,5-2,0 мм, дважды экстрагируют 80%-ным этанолом при комнатной температуре при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) в течение 2 ч, затем дважды 40%-ным этанолом при температуре 90±5°С в течение 1 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, объединяют, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу для получения сухого экстракта. Полученное средство проявляет выраженную противовоспалительную активность. 10 табл.

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют смесь, содержащую, мас.ч.:

черные листья бадана толстолистного3,0цветы ромашки аптечной2,8траву тысячелистника обыкновенного2,4листья мяты перечной1,8

измельченную до размера частиц 0,5-2,0 мм, экстракцию проводят дважды 80%-ным этанолом при комнатной температуре при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) в течение 2 ч, третью и четвертую экстракцию проводят 40%-ным этанолом при температуре 90±5°С в течение 1 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, объединяют, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу.