СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/00 C12N11/00 

Настоящее изобретение относится к микробиологии, точнее к способам выращивания культур микроорганизмов.

Известен способ выращивания клеток микроорганизмов в жидкой питательной среде [1] при стационарном культивировании в заданном незаменяемом объеме питательной среды или при проточном культивировании (в хемостате), когда в хемостат подается чистая питательная среда и в то же время из него отводится такой же объем питательной среды с размножившимися микроорганизмами, в результате чего устанавливается динамическое равновесие, и непрерывный отбор биомассы микроорганизмов компенсируется ее приростом. Очевидно, что в жидкой питательной среде, где непрерывно происходят свободное конвекционное перемешивание слоев питательной среды и диффузионное перемещение отдельных клеток, последние всегда ориентированы относительно друг друга случайным образом, эта ориентация непрерывно меняется и взаимная однородная ориентация клеток микроорганизмов отсутствует.

Известен способ выращивания клеток на поверхности твердых питательных сред, когда клетки помещают для размножения на поверхность среды и питательные вещества поступают к высеянным на поверхность среды клеткам за счет диффузии из толщин твердой среды. В этом случае клеточная биомасса представляет собой пласт или отдельные колонии со слоистой структурой, состоящей из отдельных неподвижных клеток, которые в слабой степени могут быть ориентированы относительно ближайших соседей (ближний порядок) и ориентированы совершенно случайным образом относительно большинства остальных клеток (дальний порядок) [2].

Известен также способ выращивания некоторых одноклеточных микроорганизмов (и культур дедифференцированных клеток многоклеточных организмов) в жидких питательных средах на помещенных в эти среды твердых сферических гранулах - стеклянных или сформированных из синтетических или природных полимеров (например, декстрана). При этом происходит адгезия клеток из жидкой питательной среды и их рост на поверхности гранул [3]. В этом случае клетки на поверхности каждой гранулы остаются неподвижными относительно поверхности гранулы, однако при этом они располагаются на поверхности гранулы случайным образом, и какая-либо однородная ориентация клеток относительно друг друга на поверхности каждой гранулы отсутствует. Более того, все гранулы произвольным образом перемещаются и вращаются относительно друг друга в жидкой питательной среде. Таким образом, и при этом способе культивирования нет однородной ориентации клеток относительно друг друга.

Наиболее близким техническим решением является способ культивирования на твердой питательной среде, когда отдельные клетки биомассы неподвижны относительно среды и относительно друг друга. Этим обеспечивается неизменность ориентации клеток данного образца на твердой питательной среде относительно направления внешнего ориентированного поля при заданном положении образца. Однако при этом, как указывалось выше невозможно достигнуть однородной ориентации клеток относительно друг друга и, следовательно, одинаковой ориентации всех клеток относительно направления внешнего ориентированного поля [2].

Тем не менее, в ряде случаев, например, при изучении воздействия внешних ориентированных полей, в том числе электромагнитных, на биомембраны, требуется полностью однородная или близкая к однородной взаимная ориентация неподвижных отдельных клеток (например, бактерий и других микроорганизмов). В этом случае поворотом препарата с клетками и фиксацией его в определенном положении можно задавать различную выбранную ориентацию клеток и клеточных мембран относительно ориентации внешнего поля и изучать эффекты взаимной ориентации клеток и поля.

Задачей данного изобретения является создание способа получения культур однородно ориентированных клеток одноклеточных микроорганизмов. Решение поставленной задачи достигается тем, что в известном способе получения культур клеток одноклеточных микроорганизмов, заключающемся в культивировании клеток микроорганизмов в питательной среде, новым является то, что в питательную среду вводят пакет из параллельно ориентированных микроволокон, выполненных из стекла или другого смачиваемого водой материала. На фиг. 1 представлена схема заявляемого способа, где в питательной среде (1) с внесенными в нее клетками одноклеточных микроорганизмов (3) и пакетом микроволокон (2) последние адсорбируют клетки (3) одинаковым образом, а именно с ориентацией их длинной оси вдоль оси микроволокон (2) за счет адгезии и сил поверхностного натяжения на границе раздела "волокно-жидкость" (а). При размножении клеток в этих условиях их однородная ориентация сохраняется (б).

Предлагаемый способ позволяет получить однородно ориентированные клетки одноклеточных микроорганизмов. Применение микроволокон для решения вышеуказанной задачи не известно. Ранее для решения подобной задачи использовались ткани многоклеточных организмов, состоящие из естественно однородно ориентированных клеток, например клеток хориоидного сплетения мозга млекопитающих [4].

В заявляемом способе клетки одноклеточных микроорганизмов культивируют в жидкой или твердой питательной среде, причем эта питательная среда (1) с внесенными в нее клетками одноклеточных микроорганизмов пропитывает пакет (2) из параллельно ориентированных микроволокон, выполненных из стекла или другого смачиваемого водой материала и имеющих сечение любой формы, преимущественно круглое. За счет адгезии на поверхности волокон и сил поверхностного натяжения на границе раздела "волокно-жидкость" клетки (3) прикрепляются к поверхности волоки параллельно их продольной оси. При делении образующиеся клетки-потомки также остаются адгезированными на поверхности микроволокон и сохраняют ту же ориентацию. В результате получается культура однородно ориентированных клеток одноклеточных микроорганизмов.

В случае использования твердой среды, например на основе агар-агара, пакет микроволокон пропитывается питательной средой с внесенными в нее клетками за счет капиллярных сил, возникающих в пакете из-за малого зазора между отдельными микроволокнами.

Поворотом и различным расположением емкости с микроволокнами в питательной среде может быть задана любая выбранная ориентация клеток относительно ориентации внешнeгo поля. Состав питательной среды не имеет принципиального значения.

Способ был апробирован на примере клеток кишечной палочки Escherichia coli. Суспензией клеток в питательной жидкой среде пропитывали пакет микроволокон (стекловолокно), представляющий собой жгут, втянутый в стеклянную трубку, чтобы избежать высыхания препарата во время инкубирования в термостате. Исходная концентрация клеток в жидкой среде составляла от 10⁵ до 10⁶ 1/мл среды. Инкубирование прекращали по достижении концентрации размножившихся клеток, равной от 10⁷ до 10⁸ 1/мл. Образец помещали под микроскоп и фотографировали. Как следует из фиг. 2, размножившиеся клетки в культуре расположены в виде тяжей, параллельных отдельным микроволокнам.

ЛИТЕРАТУРА
1. Методы общей бактериологии. Изд-во "Мир", М., 1983. Т. 1, с. 374-441.

2. Методы общей бактериологии. Изд-во "Мир" М., 1983. Т. 1, с. 356-373.

3. "Cell Culture Reagents". Sigma Corp. Issue. 1990, p. 97.

4. Бреслер С.Е., Бреслер В М., Васильева Н.Н, Казаков Э.Н. ДАН. 1978, т. 242, с. 465-468.

Изобретение относится к микробиологии. Способ включает культивирование клеток одноклеточных микроорганизмов в жидкой или твердой питательной среде. Предварительно в питательную среду помещают пакет из параллельно ориентированных микроволокон, выполненных из стекла или другого смачиваемого водой материала. Способ обеспечивает получение культур однородно ориентированных клеток одноклеточных микроорганизмов. 2 ил.

Способ получения культур клеток одноклеточных микроорганизмов, заключающийся в культивировании клеток одноклеточных микроорганизмов в питательной среде, отличающийся тем, что в жидкую или твердую питательную среду вводят пакет из параллельно ориентированных микроволокон, выполненных из стекла или другого смачиваемого водой материала.