СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИИ ОБРАЗЦОВ ВОДНОГО ЛЬДА ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/18 G01N33/487 G01N1/10 

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов особыми способами, а именно к способам анализа образцов льда для биологических исследований.

Способ предназначен для очистки любых образцов (природного и искусственного) - водного льда как атмосферного происхождения, так и замерзшей воды любого водоема от физического, химического и биологического поверхностного загрязнения (клетки, вирусы и ДНК/РНК) с целью изучения его подлинного биологического содержания и разнообразия (микробные клетки или нуклеиновые кислоты). Метод особенно актуален для изучения образцов полярного льда, которые могут представлять как древний ледник атмосферного происхождения, так и замерзшую воду подледниковых озер и водоемов, например, озера Восток в Антарктиде. Деконтаминация льда керна Восток является критической стадией в изучении микробного содержания и разнообразия атмосферного льда и подледниковых водоемов. Необходимость такой тщательной очистки обусловлена также тем, что при глубоком бурении во льду используется жидкость для бурения, состоящая из смеси керосина и фреона, которая образует трудноудаляемую пленку на поверхности льда. Кроме того, манипуляции со льдом в полевых условиях при бурении и дальнейшем хранении образцов далеки от стерильности и вносят дополнительную чужеродную микрофлору и химическое загрязнение.

Биологическими исследованиями образцов природного льда активно ученые занимаются приблизительно последние 10 лет, хотя российские ученые (Абызов С.С. А.С. №1488717, G01N 1/10 [1]) начали подобные исследования в восьмидесятые годы. В настоящее время эта проблема достаточно актуальна по многим причинам как фундаментального, так и прикладного характера. С фундаментальной точки зрения особый интерес представляют микробы, которые могли сохраниться в «древнем» льду (например, в толще Антарктического ледового покрова) возрастом до нескольких миллионов лет, для изучения их эволюционной изменчивости. Также интерес представляют микроорганизмы (психрофилы), живущие при низких температурах, а именно их физиология и метаболизм, позволяющие им функционировать при отрицательных температурах. Для этих целей используют лед керна, начиная с глубины 80-120 м (фирн в Антарктике) до максимальных отметок (3-4 км). Керн льда делят на сегменты определенных размеров, обрабатывают поверхность льда с целью удаления чужеродных микрофлоры и нуклеиновых кислот (эта операция называется деконтаминацией образцов льда), затем проводят биологические исследования жидкости, полученной из деконтаминированных образцов льда.

Для осуществления микробиологических исследований необходимо иметь тщательно обработанный без поверхностного загрязнения лед, т.к. только такой лед может дать достоверную информацию и знания о том, какие именно микробы в нем содержатся.

Кроме того, способ также интересен для биотехнологии в плане поиска новых холодоустойчивых ферментов, что может найти применение во многих областях промышленной биотехнологии, сулящей большие выгоды как в экономике, так и в охране окружающей среды.

Известен способ микробиологических исследований ледниковой толщи Центральной Антарктики, описанный в работе [2] (Известия АН СССР. Серия Биологическая, №6, С.828-836. Абызов С.С., Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б. (1979)). Согласно этому способу для целей микробиологического изучения льда используют настольную установку для приготовления (отбора) проб. Принцип ее действия заключается в асептическом отборе проб из керна льда путем выплавления внутренней его части. При этом наружный не растаявший слой льда, как считают авторы, служит надежным экраном, изолирующим отбираемые из центральных частей керна пробы от окружающей среды и, тем самым, препятствующим попаданию в пробу посторонней микрофлоры. Основной частью установки является литой медный или алюминиевый нагреватель мощностью 1,25 кВт. Его рабочая поверхность выполнена в виде выпуклого конуса с центральным отверстием, благодаря чему вода, образующаяся при плавлении сердцевины образца, стекает через отверстие в нагревателе по водоприемной трубке в стерильную приемную емкость. Нагреватель, плотно закрытый металлической крышкой, вместе с водоприемной трубкой стерилизуют автоклавированием. Непосредственно перед началом отбора пробы торцевую часть керна льда скалывают с целью получения не загрязненного чужеродной микрофлорой участка поверхности. Скалывание производят с использованием специального скалывающего устройства, исключающего контакт торцевой поверхности керна льда с инструментом. После откалывания торец керна быстро опускают на стерильную поверхность нагревателя и при включении последнего производят отбор проб талой воды. Температура на границе «лед-нагреватель» и, следовательно, отбираемой пробы воды колеблется от 6 до 13°С. Верхняя часть водосборной трубки нагревается до 28°С в результате контакта с нагревателем. Температура воды на выходе в стерильный приемник не превышает 18-22°С. Таким образом, из образцов керна льда выплавляют внутреннюю часть, и воду собирают в подготовленные колбы с перетянутым горлышком, которые стерильно присоединяются к установке посредством резиновой трубки перед началом работы. В частности, колбы могут содержать концентрированные питательные растворы, приготовленные с таким расчетом, чтобы после добавления пробы воды среда разбавлялась до нужной концентрации. При этом отбираемая проба служит одновременно и анализируемым материалом, и разбавителем питательной среды.

К недостаткам способа можно отнести недостаточный контроль чистоты, например, резиновой трубки для сбора воды. Дезинфицировать эти трубки путем простого автоклавирования не представляется возможным, ибо известно, что некоторые микробы могут выживать в стандартных условиях процедуры автоклавирования при 121°С [3], а с ДНК вообще ничего не происходит [3]. Это может приводить к артефактам.

Известен способ деконтаминации образцов водного льда, описанный в работе [4]. Christner et al., 2005. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus 174 (2005) 572-584 (Керны атмосферного льда: модельная система для разработки протоколов деконтаминации для внеземных исследований).

Способ заключается в следующем. Вначале для удаления внешнего загрязнения (при бурении) внешнюю часть керна льда (5 мм) в холодных условиях (-10°С) физически удаляют соскабливанием с помощью микротомного ножа, изготовленного из нержавеющей стали и дезинфицированного 95% этиловым спиртом. Затем в биологически чистых условиях (ламинарный бокс класса 100) при -20°С эти образцы льда тщательно промывают 500 мл 95% этилового спирта (-20°С), профильтрованного через фильтр с размером пор 0.2 мкм, а затем еще промывают 500 мл стерильной деионизированной воды (4°С) для удаления следующих 5 мм слоя льда. Очищенные таким образом сегменты льда переносят в полипропиленовых контейнерах в чистый бокс (с перчатками) с позитивным давлением, помещают в стерильные 16 см сита из нержавеющей стали и инкубируют при комнатной температуре до тех пор, пока еще 5 мм льда не будет расплавлено и удалено. Оставшиеся образцы льда (с удалением 15 мм от начального радиуса керна) герметично запаковывают в стерильные полипропиленовые контейнеры и выдерживают в темных условиях при 4°С до полного плавления льда (до 72 часов). Полученный раствор после проведения деконтаминации используют для биологических исследований по известным методикам, например [5].

К недостаткам метода можно отнести то, что при физическом соскабливании верхнего слоя ножом следы жидкости для бурения практически не могут быть удалены полностью, так же как и водорастворимый этиловый спирт, используемый далее, не снимает пленку углеводородов со льда по причине его гидрофильности. Кроме того, этиловый спирт является наиболее эффективным при дезинфекции в концентрации 70%, которую трудно контролировать при обмывке сегментов льда (плавление льда), и ничего не делает с чужеродной ДНК. Так, при использовании данного протокола деконтаминации хемотрофные бактерии рода Sphingomonas (Sph. natatoria и Sph. sp) были вскрыты Б.Кристнером из образцов глубокого антарктического льда [6], [7] (Christner et al., 2001; Christner et al., 2002). Эти же бактерии (виды) были обнаружены в жидкости для бурения [8] (Alekhina et al., 2007). Отметим, что данные бактерии способны деградировать углеводороды нефти. Таким образом, на основе собственных исследований и зная ультранизкое содержание биомассы во льду (меньше 10 клеток/мл), представляется очень вероятным, что образцы льда, проанализированные в способе [4] Б.Кристнером, были недостаточно деконтаминированы. Это могло привести к тому, что на образцах льда остались следы жидкости для бурения, и соответственно, сделаны неточные заключения о статусе данных бактерий как происходящих изо льда.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ деконтаминации образцов водного льда, описанный в работе [9]. S.O.Rogers et al. Comparisons of protocols for decontamination of environmental ice samples for biological and molecular examinations. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 2540-2544. (Сравнение протоколов деконтаминации образцов природного льда для биологических и молекулярных исследований).

Способ заключается в следующем. Наружную обработку льда (дезинфекцию) проводят в стерильном ламинарном боксе. Секции льда погружают полностью в 800 мл 5.25% гипохлорита натрия (неразбавленный продукт для отбеливания «Хлорокс») на 10 с и затем дважды промывают 200 мл стерильной водой (сопротивление 18 мОм, РОУ 1 мкг на литр) (для уничтожения наружной микрофлоры и ДНК). Затем сегменты льда переносят в стерильные воронки и плавят при комнатной температуре в ламинарном боксе. Расплавленная вода последовательно собирается по 20 мл (так называемые «слои»). По мере плавления и сбора воды внутренние слои (последний 5-й), как описано в работе, должны быть наиболее чистыми, т.е. содержать меньше всего чужеродной микрофлоры и не содержать следов дезинфицирующего агента, ингибирующего ДНК анализы (3-й слой и выше). После проведения деконтаминации раствор готов для проведения биологических исследований по известным методикам, например [5].

К основным недостаткам данного способа можно отнести использование раствора гипохлорита натрия при проведении операции дезинфекции. Хорошо известно, что гипохлорит натрия, высвобождая активный хлор, выступает в роли сильнейшего окислителя, приводя к необратимым повреждениям ДНК и любых ферментов, тем самым ингибируя ПЦР (полимеразную цепную реакцию). Соответствующие данные для следовых количеств гипохлорита натрия приведены в самом описании метода [9] (Rogers et al., 2004).

Кроме того, промывка водным раствором гипохлорита натрия не убирает органическую пленку жидкости для бурения с поверхности льда по причине его гидрофильности. Это свидетельствует о недостаточной чистоте проводимой деконтаминации, что искажает достоверность информации в дальнейших анализах льда на микрофлору и микробы.

Задачей данного изобретения является повышение чистоты проведения деконтаминации, что повышает информативность биологических исследований.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе деконтаминации образцов водного льда для биологических исследований, включающем дезинфекцию и удаление чужеродных нуклеиновых кислот с поверхности образцов льда и промывку образцов чистой водой, имеющей сопротивление 18 мОм и содержащей растворенный органический углерод 1 мкг на литр, новым является то, что сначала при -15°С механически очищают внешнюю поверхность образцов от биологических и химических загрязнений продезинфицированным инструментом, и при проведении последующей дезинфекции и удалении чужеродных нуклеиновых кислот с поверхности обработанных образцов дополнительно осуществляют очистку последних от химических загрязнений, для чего поверхностно очищенные сегменты льда обрабатывают ациклически насыщенным углеводородом путем погружения сегментов льда в сосуд с ациклически насыщенным углеводородом, охлажденным до температуры -15°С, после чего сегменты льда погружают во фреон, охлажденный до температуры -15°С для удаления ациклически насыщенного углеводорода, далее сегменты льда озонируют в герметически закрытом алюминиевом боксе с использованием бактерицидной УФ-лампы в течение не менее 30 мин при -15°С, после чего лед обрабатывают дезинфицирующим раствором, не содержащим хлора, в атмосфере воздуха, обработанного до класса чистоты 5 по Международному стандарту ISO 14644-1, и промывку образцов осуществляют вышеуказанной чистой водой, но дополнительно очищенной через мембрану 5 кДа, обеспечивающей порог отсечения 15 пар оснований двунитевой ДНК и менее, сначала путем погружения, затем под протоком, после чего лед помещают в стерильные сосуды, не загрязненные чужеродной ДНК. В качестве ациклически насыщенного углеводорода используют пентан.

Заявляемая совокупность признаков не обнаружена в патентной и научной литературе, что свидетельствует о новизне способа.

В заявляемом способе с целью повышения чистоты проведения деконтаминации введена операция удаления химических загрязнений с поверхности водного льда, возможное попадание которых в исследуемый лед искажает и биологический состав «древнего» льда.

Дальнейшая деконтаминации льда (обработки с целью удаления чужеродной поверхностной микрофлоры, включая ее ДНК) состоит в последовательной обработке сегментов льда в холодных, а затем в особо чистых помещениях, сертифицированных по классу чистоты 10000 и выше.

Подбор обеззараживающих и дезинфицирующих средств и последовательность этих операций были выбраны опытным путем и не являются очевидными для такого вещества как лед при решении задач использования его для проведения биологических исследований. При предлагаемом подборе средств и операций происходит обеззараживание только наружных слоев льда, и не происходит проникновения обеззараживающих средств в кристаллическую матрицу льда, что также повышает чистоту деконтаминации, т.е. сохраняется информация о той микрофлоре, попавшей в ледяную структуру много лет назад, что и дает ответы на многие научные вопросы.

Заявляемый способ заключается в следующем. Сначала удаляют внешние загрязнения с поверхности льда. Для этого в холодных условиях (-15°С) сегменты льда обрабатывают электрической пилой, полотно которой дезинфицируется 96% этиловым спиртом. При этом механически удаляют поверхностный слой льда не менее 2 мм толщиной, загрязненный как буровой жидкостью (жидкостью из смеси авиационного керосина и форана), так и чужеродной микрофлорой. Далее поверхностно очищенные сегменты льда обрабатывают ациклически насыщенным углеводородом, в частности, пентаном (чистотой для газовой хроматографии). Для этого охлажденный пентан (-15°С) наливают в стеклянный цилиндр (промытый средствами ПВА и сполоснутый чистой водой) и сегмент льда помещают в него методом погружения. В результате полностью удаляют следы буровой жидкости (керосин хорошо растворяется в пентане). Затем для удаления остатков пентана сегменты льда погружают во фреон (чистотой для газовой хроматографии), также охлажденный и налитый в стеклянный цилиндр (промытый, как описано выше). Пентан хорошо растворятся во фреоне, тогда как сам фреон быстро испаряется при отрицательной температуре (-15°С). Все манипуляции со льдом проводят в большом герметически закрывающемся контейнере из анодированного алюминия, предварительно охлажденном, внутренняя часть которого стерилизована озонированием. Далее сегменты льда обрабатывают газом-озоном (озонируются), который убивает оставшиеся на поверхности клетки, а также эффективно окисляет (разрушает) любые органические молекулы, включая нуклеиновые кислоты, которые могут находиться на поверхности. Озонирование выполняют в том же самом закрытом алюминиевом боксе при -15°С в течение 30 минут с использованием прибора-озонатора производительностью 10 г озона в час и стандартной бактерицидной УФ-лампы. При этом проникновения озона в кристаллическую матрицу льда, а также межкристаллические пространства (менее 1 мкм) за время обработки не происходит из-за больших размеров молекулы озона [10] (Ikeda et al., 2000). Дальнейшую обработку льда проводят в помещениях, сертифицированных по классу чистоты, а именно, в ламинарном боксе класса 100, установленном в чистых комнатах класса 10000, т.е. в атмосфере воздуха, содержащего менее 100 частиц размером менее 0,5 мкм в кубическом футе (Federal Standart 209), по Международному Стандарту ISO 14644-1 это соответствует 5 классу чистоты (все под позитивным давлением воздуха). Сегменты льда обрабатывают (опрыскивают) коммерческими деконтаминирующими растворами на основе четвертичных солей аммония, не содержащими хлора (например, Proline Biocontol, производства компании Biohit), а затем обмывают путем быстрого (5-10 сек) погружения в воду, электропроводностью не менее 18 МОм, содержащую растворенный органический углерод (РОУ) в количестве не более 2 мкг на литр и дополнительно очищенную через мембрану 5 кДа и менее (порог отсечения 15 пар оснований двунитевой ДНК и менее). На всех этапах используют всякий раз чистые, вновь обработанные стеклянные цилиндры и разовые перчатки класса «чистая комната» и прочее. Заключительная стадия обработки - промывка сегмента льда, осуществляется такой же водой, но под протоком. После этого лед помещают в стерильные сосуды, обработанные согласно протоколам и не загрязненные чужеродной ДНК, и либо замораживают, либо обрабатывают (плавят) далее. Такой лед готов для биологических исследований по известным методикам, например, [5].

Проверка способа выполнена в ПИЯФ РАН в Отделении Молекулярной Радиационной Биофизики.

Для проверки способа использовали следующий вид льда: Антарктический лед из глубокой скважины Восток, ледниковый и конжеляционный (озерный, т.е. замерзшая вода подледникового антарктического озера), ранг глубин от 121 м до 3659 м, возраст льда от 5 тыс.лет до 2 млн.

Проведение протоколов для заявляемой методики: стеклянную посуду, не используемую нигде, кроме целей обработки льда, тщательно моют в ультразвуковой бане в течение 1 часа, споласкивают тщательно чистой водой Millipore MiliQ три раза и окончательно обмывают ультрачистой водой Элга, электропроводностью не менее 18 МегаОм, содержащую растворенный органический углерод (РОУ) в количестве не более 2 мкг на литр и очищенную через мембрану 5 кДа и менее (порог отсечения 15 пар оснований двунитевой ДНК и менее). Все процедуры проводят в атмосфере воздуха, содержащего менее 100 частиц размером менее 0,5 мкм в кубическом футе, что соответствует 5 классу чистоты по Международному Стандарту ISO 14644-1.

Чистота деконтаминации подтверждена нами на практике. Так, тщательно обработанный лед, согласно заявляемому способу деконтаминации, содержал при плавлении менее 20 микробных клеток на мл расплавленной воды, в то время как необработанная поверхность льда, содержащая также следы жидкости для бурения, содержала до 10⁴ микробных клеток на мл расплавленной воды.

Контроль чистоты обработки льда (деконтаминации) осуществлялась также и по двум другим показателям - известным химическим профилям льда [11] (De Angelis et al., 2004), из которых три иона для наиболее чистого озерного льда (аммоний, нитраты и калий) выступают в качестве ионов-индикаторов контаминации, и содержанию растворенного органического углерода (РОУ) [12] (Schock et al., 2005). Для тщательно обработанных сегментов антарктического льда содержание РОУ не превышает 20 мкг/л воды образца [12].

Таким образом, заявляемый способ позволяет провести более качественно деконтаминацию и сделать более точные заключения о статусе данных бактерий как происходящих изо льда.

Способ может быть применен как для научно-биологических исследований, так и для практических целей для поиска новых холодоустойчивых ферментов, что может найти применение во многих областях промышленной биотехнологии.

Источники информации

1. A.C. №1488717, МКИ G01N 1/10.

2. Абызов С.С., Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б. (1979) Известия АН СССР. Серия Биологическая, №6, С.828-836.

3. Kashefi К and Lovley DR (2003) Extending the upper temperature limit for life. Science 301:934.

4. Christner et al., 2005. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus 174(2005) 572-584.

5. Bulat, S.A., Alekhina, I.A., Blot, M., Petit, J.-R., de Angelis, M., Wagenbach, D., Lipenkov, V.Ya., Vasilyeva, L.P., Wloch, D.M., Raynaud, D. and V.V. Lukin (2004) DNA signature of thermophilic bacteria from the aged accretion ice of Lake Vostok, Antarctica: implications for searching for life in extreme icy environments. Int J Astrobiology 3(1):1-12.

6. Christner B.C. (2002) Detection, recovery, isolation and characterization of bacteria in glacial ice and Lake Vostok accretion ice. PhD Thesis, Ohio State University.

7. Christner B.C., Mosley-Thompson E., Thompson L.G. & Reeve J.N. (2001) Isolation of bacteria and 16S rDNAs from Lake Vostok accretion ice. Environ Microbiol 3:570-577.

8. Alekhina LA., D. Marie, J-R. Petit, V.V. Lukin, V.M. Zubkov and S.A. Bulat (2007) Molecular analysis of bacterial diversity in kerosene-based drilling fluid from the deep ice borehole at Vostok, East Antarctica. FEMS Microbiology Ecology 59: 289-299.

9. Rogers S.O. et al. (2004). Comparisons of protocols for decontamination of environmental ice samples for biological and molecular examinations. Appl. Environ. Microbiol. 2540-2544. - Прототип.

10. Ikeda Т., Salamatin A.N., Lipenkov V.Ya., Hondoh T. (2000) Diffusion of air molecules in polar ice sheets. In Hondoh, T. ed. Physics of ice core records. Sapporo, Hokkaido University Press, 393-421.

11. M. De Angelis, J.-R. Petit, J. Savarino, R. Souchez, M.H. Thiemens (2004) Contributions of an ancient evaporitic-type reservoir to subglacial Lake Vostok chemistry. Earth and Planetary Science Letters 222: 751- 765.

12. M.Schock, S.Greilich, D.Wagenbach, S.Preunkert, M.Legrand, J.-R.Petit, J.Flückiger, M.Leuenberger, W.Haeberli, R.Psenner. (2005) Dissolved organic carbon (DOC) in ice samples from non-temperated, polar and Alpine glaciers. Geophysical Research Abstracts, Vol.7, 08.

Способ предусматривает предварительное механическое очищение внешней поверхности образцов льда от биологических и химических загрязнений продезинфицированным инструментом при -15°С. Далее сегменты льда обрабатывают ациклически насыщенным углеводородом, при -15°С путем погружения их в сосуд с ациклически насыщенным углеводородом. В качестве ациклически насыщенного углеводорода используют пентан. После чего сегменты льда погружают во фреон, охлажденный до -15°С, для удаления ациклически насыщенного углеводорода. Образцы льда озонируют в герметически закрытом алюминиевом боксе с использованием бактерицидной УФ-лампы в течение не менее 30 мин при -15°С. После чего в атмосфере воздуха, содержащего менее 100 частиц размером менее 0,5 мкм в кубическом футе, лед обрабатывают дезинфицирующим раствором, не содержащим хлора. Осуществляют промывку образцов льда чистой водой сначала путем погружения, затем под протоком. После чего лед помещают в стерильные сосуды. Чистая вода имеет сопротивление 18 мОм, содержит растворенный органический углерод 1 мкг на литр и дополнительно очищена мембраной с размером пор 5 кДа. Способ позволяет повысить чистоту проведения деконтаминации. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ деконтаминации образцов водного льда для биологических исследований, включающий дезинфекцию и удаление чужеродных нуклеиновых кислот с поверхности образцов льда и промывку образцов чистой водой, имеющей сопротивление 18мОм и содержащей растворенный органический углерод 1 мкг на литр, отличающийся тем, что предварительно при -15°С механически очищают внешнюю поверхность образцов от биологических и химических загрязнений продезинфицированным инструментом, и при проведении последующей дезинфекции и удалении чужеродных нуклеиновых кислот с поверхности обработанных образцов дополнительно осуществляют очистку последних от химических загрязнений, для чего поверхностно очищенные сегменты льда обрабатывают ациклически насыщенным углеводородом путем погружения сегментов льда в сосуд с ациклически насыщенным углеводородом, охлажденным до температуры -15°С, после чего сегменты льда погружают во фреон, охлажденный до температуры -15°С, для удаления ациклически насыщенного углеводорода, далее сегменты льда озонируют в герметически закрытом алюминиевом боксе с использованием бактерицидной УФ-лампы в течение не менее 30 мин при -15°С, после чего лед обрабатывают дезинфицирующим раствором, не содержащим хлора, в атмосфере воздуха, содержащего менее 100 частиц размером менее 0,5 мкм в кубическом футе, и осуществляют промывку образцов вышеуказанной чистой водой, но дополнительно очищенной через мембрану с размером пор 5 кДа, сначала путем погружения, затем под протоком, после чего лед помещают в стерильные сосуды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ациклически насыщенного углеводорода используют пентан.