СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИЛОВ АЛИФАТИЧЕСКИХ КИСЛОТ С УГЛЕВОДОРОДНОЙ ЦЕПЬЮ C-C В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, количественного анализа веществ и может быть использовано для определения наличия и концентрации нитрилов органических кислот в водных растворах. Заявляемый способ относится к разряду биосенсорных и может быть использован, в частности, для определения акрилонитрила, высокотоксичного и широко распространенного в химической промышленности соединения.

Биосенсорные способы основаны на использовании физико-химических датчиков в сочетании с различными биологическими объектами (ферментами, клетками, тканями и т.п.) в качестве чувствительных элементов.

Известен способ определения нитрилов ароматических карбоновых кислот (Liu T. Z. , Wang Y., Kounaves S.P., Brush E.J. Determination of organonitriles using enzyme-based selectivity mechanisms. 1. An ammonia gas sensing electrode-based sensor for benzonitrile. // Anal. Chem. -1993. -Vol.65. -N 21. -P.3134-3136.) с помощью биосенсора на основе фермента нитрилазы, выделенного из микробных клеток шт. Rhodococcus sp. и аммонийного электрода. В данном способе нитрилаза катализировала гидролиз бензонитрила до бензойной кислоты и аммония, ионы последнего регистрировались ион-селективным электродом. Способ осуществлялся в диапазоне pH 6-9. Концентрационная зависимость сенсорного сигнала имела линейный характер в диапазоне концентраций бензонитрила 0,5 - 10 мМ.

В данном способе не проводят определение нитрилов алифатических кислот, подготовка биологической компоненты сенсора требует применения сложной и дорогостоящей процедуры выделения фермента из микробных клеток. Кроме того, можно отметить недостаточную чувствительность способа.

Известен способ определения нитрилов алифатических карбоновых кислот в водных растворах с помощью ВЭЖХ-анализа (Suzuki G., Inour T. Определение алифатических нитрилов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием. "Бунсеки кагаку", 1985, 35, N 7, с.614-617). В данном способе нитрилы предварительно электролитически восстанавливают до соответствующих аминов и далее превращают в дансильные производные действием 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорида в слабощелочном растворе при 20^oC. Анализ проводят на колонке (15 см x 4,6 мм), содержащей Лихросорб RD-8, используют флуориметрический детектор (366/510 нм).

В данном способе проводят сложную предподготовку исследуемой пробы и используют дорогостоящую аппаратуру.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения акрилонитрила (Горцева Л. В., Тарасова Н.А., Шутова Т.В., Холодова А.П. Определение акрилонитрила в полимерных материалах, водных и масляных вытяжках из них газохроматографическим методом. "Гигиена и санитария", 1987, N 4, с. 61-62). В данном способе исследуемый объект, например водный раствор, содержащий акрилонитрил, нагревают до 90^oC в герметично закрытом сосуде в течение 30 мин для перехода акрилонитрила в газовую фазу и отбирают часть паровоздушной смеси (2 см³) для проведения ГЖХ-анализа. В хроматографической колонке концентрирование акрилонитрила, что приводит к высокой чувствительности метода, предел обнаружения в водной среде составляет 0,008 мг/л. Определения проводят на хроматографе "Цвет-100", оснащенном пламенно-ионизационным детектором.

Данный способ предназначен для селективного определения акрилонитрила, его миграции из полимерных материалов в воздух, водную и масляную среды. Для проведения анализа требуется сложная подготовка пробы, в результате которой акрилонитрил переводится из жидкой в газообразную фазу. Кроме того, способ предполагает применение сложного дорогостоящего оборудования.

Задачей изобретения является расширение диапазона определяемых соединений: акрилонитрил, ацетонитрил, пропионитрил и др., определение их концентрации непосредственно в водных растворах без предварительной подготовки пробы при увеличении экономичности способа.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения нитрилов алифатических карбоновых кислот с углеводородной цепью C₁-C₄ в водных растворах, осуществляют взаимодействие водного раствора искомого вещества с активированными на солевой среде микробными клетками, способными использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии, и проводят обнаружение и определение содержания искомого вещества по изменению респираторной активности микробных клеток.

Кроме того, в качестве микробных клеток используют клетки бактериального штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes ВКПМ-4418, солевая среда дополнительно содержит акрилонитрил и определение искомого вещества проводят при температуре 15-50^oC и pH среды 5,0-9,0.

В другой модификации способа в качестве микробных клеток используют клетки бактериального штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ B-S926.

В известной авторам научно-технической и патентной литературе не обнаружены способы с подобной совокупностью признаков. Полученный результат, обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях. Преимуществами заявляемого способа является возможность определять нитрилы алифатических карбоновых кислот с углеводородной цепью C₁-C₄ (например, акрилонитрил) непосредственно в водных растворах, отсутствие предварительной подготовки пробы, а также его простота и экономичность.

Способ заключается в следующем.

Получают биомассу клеток бактериального штамма, способных использовать нитрилы алифатических карбоновых кислот в качестве единственного источника углерода и энергии.

Микробные клетки активируют путем инкубирования в солевой среде или в среде с добавлением нитрила. Далее биомассу отделяют центрифугированием от среды, отмывают, ресуспендируют в буферном растворе и определяют концентрацию клеток в суспензии. Полученную суспензию клеток используют в качестве биологически чувствительного элемента.

Готовят эталонную среду, например, буферный раствор, для последующего сравнения по параметрам с потенциально исследуемой средой.

Затем в эталонную среду вводят суспензию микробных клеток и определяют их эндогенную респираторную активность по изменению силы тока (ΔI₁) за фиксированный промежуток времени (Δt₁) , например, за 3-5 мин. Это можно осуществить, например, с помощью кислородного электрода (типа Кларка) и другого необходимого технического оснащения (см. пример ниже).

Заключительной стадией способа является введение пробы водного раствора исследуемого объекта в среду с микробными клетками и определение респираторной активности клеток путем регистрации изменения силы тока (ΔI₂) за фиксированный промежуток времени (Δt₂) , например, за 3-5 мин.

Разность значений респираторной активности клеток в присутствии исследуемой пробы и без нее, приведенная к массе использованных микробных клеток (m), обозначается как специфическая pеспиpатоpная активность (СРА), по значению которой определяют наличие и концентрацию искомых соединений.

CPA = (ΔI₂/Δt₂ - ΔI₁/Δt₁) / m , (1)
где
ΔI₁/Δt₁ - эндогенная респираторная активность клеток;
ΔI₂/Δt₂ - респираторная активность клеток в присутствии определяемого вещества;
m - масса микробных клеток.

Пример 1. Индикация акрилонитрила в водном растворе.

Биологически чувствительный элемент получают следующим образом. Выращивают клетки бактериального штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes ВКПМ B-4418 на 2% МПА при 30^oC в течение 24 ч. Для активирования микробных клеток культуру смывают с агара 0,97%-ным раствором NaCl и вносят в коническую колбу на 250 мл, содержащую 50 мл солевой среды (0,01 М фосфатный буфер, pH 7,2, 0,1 г/л MgSO4, 1г/л акрилонитрила) до конечной концентрации клеток 0,2 г сухого веса/л. Инкубирование клеток осуществляют на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при 30^oC в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием, например, на центрифуге K-24 ГДР при 10000 об/мин в течение 5 мин, отмывают и ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2. По оптической плотности клеточной суспензии, измеренной при длине волны 540 нм, 1 = 0,5 см, против фосфатного буфера, определяют концентрацию клеток. Для данного бактериального штамма 1 ед. оптической плотности соответствует 0,16 г сухого веса клеток/л. Полученную суспензию микробных клеток используют для определения акрилонитрила.

В качестве эталонного раствора используют 0,01 М фосфатный буфер с pH 7,2, насыщенный кислородом. Его помещают в термостатируемую ячейку объемом 1 мл, снабженную магнитной мешалкой. В ячейку вставляют кислородный электрод, на который подают напряжение -0,6 V. В качестве потенциостата и самописца используют, например, полярограф Radelkis OH-105 (Венгрия). В буферном растворе концентрация кислорода практически не меняется, регистрируют неизменный во времени электрический сигнал (I = 18 мкА). Определение проводят при 35^oC.

Через 3 мин в ячейку шприцем-дозатором вводят суспензию клеток до конечной концентрации клеток 0,1 г/л. По изменению силы тока во времени определяют эндогенную респираторную активность клеток: I₁/t₁ = 0,32 мкА/мин.

Через 3-5 мин в ячейку вводят пробу (10 мкл) водного раствора акрилонитрила, создавая в ячейке его концентрацию 0,1 мМ. После добавления пробы регистрируют изменение силы тока во времени и определяют респираторную активность клеток: I₁/t₂ = 1,08 мкА/мин.

По формуле (1) определяют специфическую респираторную активность клеток: СРА = 7,6 мкА/мин•мг сухого веса клеток, что говорит о присутствии в данной пробе акрилонитрила.

Пример 2. Определение концентрации акрилонитрила в водном растворе.

Готовят биологически чувствительный элемент на основе клеток бактериального штамм Ps.pseudoalcaligenes ВКПМ B-4418, как показано в примере 1.

Готовят серию стандартных растворов акрилонитрила с концентрациями (мМ): 2; 4; 6; 8; 10; 14; 20; 100; 200. Для каждого раствора не менее пяти раз проводят определение СРА, как показано в примере 1. Концентрация акрилонитрила в ячейке составляет для каждого стандартного раствора соответственно (в мМ): 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,14; 0,20; 1,0; 2,0. Полученные зависимости СРА клеток от концентрации эталонных растворов представлены в табл. 1.

Линейный участок зависимости респираторной активности клеток от концентрации внесенного акрилонитрила составляет 0,02-0,10 мМ. Как показано в примере 1, респираторный ответ клеток на введение водного раствора акрилонитрила составляет 7,6 мкА/мин•мг сухого веса клеток. По полученной калибровочной зависимости концентрация акрилонитрила составляет 0,1 мМ.

Пример 3. Определение диапазона pH среды для осуществления способа определения нитрилов.

Готовят биологически чувствительный элемент на основе клеток бактериального штамма. Ps. pseudoalcaligenes ВКПМ B-4418, как показано в примере 1. Однако при определении СРА используют буферные растворы с различным pH (0,01 М HCl-глициновый буфер pH 4,5; 5,0; 0,01 М фосфатный буфер pH 6,0; 7,0; 8,0; 0,01 М NaOH-глициновый буфер pH 9,0 и 10,0). Все остальные условия эксперимента соответствуют условиям, описанным в примере 1. В измерительную ячейку вводится раствор акрилонитрила до конечной концентрации в ячейке 0,1 мМ. Среднее значение СРА для каждого значения pH вычисляют по результатам 3 опытов. Результаты экспериментов приведены в табл. 2.

Таким образом, из полученных данных следует, что определение нитрилов можно проводить в среде с pH 5,0 - 9,0. Оптимальными для проведения анализа являются значения pH среды 7,0 - 8,0.

Пример 4. Определение температурного интервала для осуществления способа определения нитрилов.

Готовят биологически чувствительный элемент на основе клеток бактериального штамма Ps.pseudoalcaligenes ВКПМ B-4418, как показано в примере 1. Однако определение специфической респираторной активности клеток проводится при различных температурах (12; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 50; 55^oC). Все остальные условия эксперимента соответствуют условиям, описанным в примере 1. В измерительную ячейку вводится раствор акрилонитрила до конечной концентрации в ячейке 0,1 мМ. Среднее значение СРА для каждой температуры вычисляют по результатам 3 опытов. Результаты экспериментов представлены в табл. 3.

Из полученных данных следует, что определение респираторной активности клеток можно проводить в интервале температур 15 - 50^oC. Но оптимальной для проведения анализа, на наш взгляд, является температура 30 - 35^oC. Температура 40^oC и выше влияет на работу кислородного электрода и, как следствие, на характер электрического сигнала.

Пример 5. Индикация других нитрилов клетками штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes ВКПМ B-4418
Готовят биологически чувствительный элемент и проводят измерение респираторной активности клеток в присутствии определяемого нитрила, как показано в примере 1, среднее значение СРА вычисляют по результатам 3 опытов. Концентрация нитрила в ячейке - 1 мМ. Результаты экспериментов представлены в табл. 4.

Пример 6. Индикация нитрилов клетками бактериального штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ B-S926
Биологически чувствительный элемент получают следующим образом. Выращивают клетки бактериального штамма R.rhodochrous ВКПМ B-S926, на 2% МПА с ацетамидом 2,5 г/л при 30^oC в течение 48 ч. Для активирования микробных клеток культуру смывают с агара 0,97%-ным раствором NaCl и вносят в коническую колбу на 250 мл, содержащую 50 мл солевой среды (0,01 М фосфатный буфер, pH 7,2, 0,1 г/л MgSO₄) до конечной концентрации клеток 0,8 г сухого веса/л. Инкубирование клеток осуществляют на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при 30^oC в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием, например, на центрифуге K-24 (ГДР) при 10000 об/мин в течение 5 мин, отмывают и ресуспендируют 0,01 М в фосфатном буфере, pH 7,2. По оптической плотности клеточной суспензии, измеренной при длине волны 540 нм, l = 0,5 см, против фосфатного буфера, определяют концентрацию клеток. Для штамма R. rhodochrous M8 1 ед. оптической плотности соответствует 0,4 г сухого веса клеток в 1 л. Полученную суспензию клеток используют для определения нитрилов.

Специфическую респираторную активность клеток данного штамма по отношению к нитрилам определяют, как показано в примере 1, среднее значение СРА вычисляют по результатам 3 опытов. Концентрация нитрила в ячейке - 1 мМ. Концентрация клеток в ячейке - 1 г сухого веса/л. Результаты экспериментов представлены в табл.5.

Заявляемое изобретение позволяет определять нитрилы алифатических карбоновых кислот с углеводородной цепью C₁-C₄, в частности, акрилонитрил непосредственно в водных растворах исключает сложную подготовку проб, упрощает проведение анализа и увеличивает его экономичность. Кроме того, заявляемое изобретение расширяет класс биосенсорных способов определения органических соединений.

Способ предназначен для определения наличия и концентрации нитрилов алифатических кислот в водных растворах. Анализируемый водный раствор приводят во взаимодействие с активированными на солевой основе микробными клетками, способными использовать алифатический нитрил в качестве единственного источника углерода и энергии. Обнаружение и определение нитрила проводят по изменению респираторной активности микробных клеток. Использование изобретения позволяет расширить диапазон определяемых нитрилов. 2 з. п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ определения нитрилов алифатических кислот с углеводородной цепью C₁ - C₆ в водных растворах, отличающийся тем, что осуществляют взаимодействие водного раствора искомого вещества с активированными на солевой среде микробными клетками, способными использовать его в качестве единственного источника углерода энергии, и проводят обнаружение и определение содержания искомого вещества по изменению респираторной активности микробных клеток. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микробных клеток используют клетки бактериального штамма pseudoalcaligenes ВКПМ В-4418, солевая среда дополнительно содержит акрилонитрил и определение искомого вещества проводят при 15 - 50^oC и pH среды 5,0 - 9,0. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микробных клеток используют клетки бактериального штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ В-S 926.