СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛИФАТИЧЕСКИХ КИСЛОТ С УГЛЕВОДОРОДНОЙ ЦЕПЬЮ С - С И ИХ АМИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, экологии, количественному анализу веществ и может быть использовано для определения наличия и концентрации алифатических кислот с короткой углеводородной цепью и их амидов в водных растворах. Способ относится к разряду биосенсорных и может быть использован, в частности, для определения акрилатов и акриламида, для которых отсутствуют другие биотехнологические методы обнаружения.

В настоящее время для определения различных органических соединений широко используются методы аналитической химии газовая, газожидкостная, тонкослойная хроматография, спектрофотометрия и т.п. Однако с конца 60-х годов наблюдается развитие биосенсорных методов анализа, основанных на использовании физико-химических датчиков в сочетании с различными биологическими объектами (ферментами, клетками, тканями и т.п.) в качестве чувствительных элементов.

Например, известен способ определения капролактама при помощи микробного биосенсора на основе микробных клеток штамма Pseudomonas sp. K14 и электрохимического датчика (Патент ГДР N 282712А5 С 12 Q 1/02, C 12 N 1/20, C 12 M 1/34, заяв. 04.08.88, опубл. 19.09.90).

Известен также способ детекции токсичных субстратов (2,5-дихлоранилина, хлороформа, о-хлорофенола и др.) в воде для контроля сточных вод, поступающих в очистные сооружения, с помощью микробных клеток и кислородного электрода (Патент США N 5, 160, 604 С 12 М 1/34, заявл. 5.2.1991, опубл. 3.11.1992). Данные способы не предназначены для определения алифатических кислот и их амидов.

Известен способ определения уксусной кислоты (Hikuma M. Mirobial electrode sensor for alcohols. //Biotechnol. Bioeng. 1979. N 21. 1845) с помощью биосенсора на основе клеток дрожжей Trichosporon brassicae и кислородного электрода. Для осуществления способа pH пробы поддерживают существенно ниже pK уксусной кислоты (4,75 при 30^oC). Нижняя граница определяемых концентраций уксусной кислоты составляет 5 мг/л. Данным способом можно определять пропионовую, н-бутановую кислоты и этанол.

Однако данным способом невозможно определять амиды вышеуказанных кислот, акриламид, акриловую кислоту, кроме того, способ не обладает достаточной чувствительностью.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения молочной кислоты (Luong J.H.T. Mulchandani A. Groom C.A. The development of an amperometic microbial biosensor using Acetobacter pasteurianus for lactic acid. //J. Biotechnology. 1989. N 10. P, 241 252) с помощью микробного биосенсора на основе клеток штамма Acetobacter pasteurianus и кислородного электрода. Способ включает взаимодействие исследуемой пробы с биоиндикатором - микробными клетками, выращенными на полноценной питательной среде с молочной кислотой и регистрацию изменения концентрации кислорода до и после взаимодействия. По изменению концентрации кислорода в среде судят о наличии и количестве молочной кислоты. Способ осуществляют во фталатном буферном растворе с pH 6, при температуре 26^oC.

Однако данный способ не предназначен для определения амидов и других кислот, кроме молочной; кроме того, способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью, с его помощью определяют молочную кислоту в диапазоне концентрации от 0,1 до 25 мМ.

Целью изобретения является расширение диапазона определяемых соединений: акриловая кислота, акриламид, ацетамид, пропионамид и др. при увеличении чувствительности как минимум на порядок.

Сущность способа заключается в том, что в способе определения алифатических кислот с короткой углеводородной цепью и их амидов, включающем взаимодействие водного раствора исследуемого вещества с биоиндикатором, регистрацию изменения концентрации кислорода в среде до и после вышеназванного взаимодействия и определение наличия и концентрации искомого вещества, осуществляют взаимодействие исследуемого вещества с активированными на солевой среде с искомым соединением клетками микроорганизмов, обладающими выраженной способностью утилизировать данное соединение в качестве единственного источника углерода.

Кроме того, взаимодействие осуществляется с клетками штамма Brevibacterium sp. 13ПА (ВКПМ В-4987) при температуре 15-50^oC и pH среды 5,5-9,0.

Другой модификацией является взаимодействие с клетками штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes КМ6П (ВКПМ В-4418) или Rhodococcus rhodochrous М8 (ВКПМ S-926).

В научно-технической и патентной литературе не обнаружены способы с подобной совокупностью признаков. Полученный результат, обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях. Преимуществами способа является возможность детектировать различные соединения алифатических кислот с короткой углеводородной цепью и их амиды (например, акриловую кислоту и акриламид) и высокая чувствительность по отношению к определяемым веществам.

Способ заключается в следующем.

Предварительно нарабатывают биомассу клеток штамма, обладающего способностью утилизировать определяемое соединение в качестве единственного источника углерода. Биомассу нарабатывают по принятой для этого штамма технологии.

Спецификой данного способа является операция подготовки биоиндикатора. В зависимости от объекта исследования: (амиды, кислоты, амиды и кислоты) биомассу инкубируют в среде неидентичного состава: для амидов солевая среда с амидом; для кислот солевая среда или солевая среда с кислотой; для амидов и кислот солевая среда с амидом.

Далее биомассу отделяют центрифугированием от среды, отмывают и приводят в рабочую готовность, определив предварительно концентрацию клеток в суспензии с целью оценки необходимого количества биоиндикатора для проведения анализа.

Готовят эталонную среду, как правило, буферный раствор, для последующего сравнения по параметрам с потенциально исследуемой средой.

Следующим этапом определения искомого вещества является взаимодействие эталонной среды с биоиндикатором и снятие временной зависимости изменения концентрации кислорода в эталонной среде и в среде с биоиндикатором. Данный прием необходим для оценки эндогенной респираторной активности клеток. Это можно осуществить, например, с помощью кислородного электрода (типа Кларка) и другого необходимого технического оснащения (см. пример ниже).

Заключительной стадией способа является взаимодействие пробы водного раствора исследуемого объекта и биоиндикатора и снятие временной зависимости изменения концентрации кислорода до и после этого взаимодействия, которая характеризует респираторную активность клеток по отношению к определяемым соединениям. По разности значений респираторной активности клеток в присутствии исследуемой пробы и без нее определяют наличие и концентрацию искомых соединений.

Пример 1. Индикация акриламида в промышленных сточных водах.

Предварительно получают биомассу клеток штамма Brevibacterium sp. 13ПА (ВКПМ В-4987) следующим образом: свежую 24-х часовую культуру, выращенную на 2% МПА при 30^oC, смывают с агара 0,97% раствором NaCl и засевают на плотную среду следующего состава: 1,5% МПА, 5 г/л акриламида, pH 7,5. Культивирование проводят в термостате при температуре 30^oC.

Для получения биоиндикатора суточную культуру смывают с агара 0,97%-ным раствором NaCl и вносят в коническую колбу на 250 мл, содержащую 50 мл солевой среды (0,01 М фосфатный буфер, pH 7,5, 0,232 г/л MgSO₄, 0,392 г/л ЭДТА и 5 г/л акриламида), до конечной концентрации клеток 2 г/л. Инкубирование клеток осуществляют на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при 28^oC в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием, например, на центрифуге К-24 (ГДР) при 10000 об/мин в течение 5 мин, отмывают и ресуспендируют 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5. По оптической плотности клеточной суспензии, измеренной при длине волны 540 нм, l 0,5 см, против фосфатного буфера, определяют концентрацию клеток. Для штамма Brevibacterium sp. 13ПА 1 ед. оптической плотности соответствует 0,67 г сухого веса клеток в 1 л. Полученный таким образом биоиндикатор используют для определения акриламида.

В качестве эталонного раствора используют 0,01 М фосфатный буфер с pH 7,5, насыщенный кислородом. Его помещают в термостатируемую ячейку объемом 1 мл, снабженную магнитной мешалкой. В ячейку вставляют кислородный электрод, на который подают напряжение 0,6 V. В качестве потенциостата и самописца используют, например, полярограф Radelkis OH-105 (Венгрия). В буферном растворе концентрация кислорода практически не меняется, регистрируют неизменную во времени силу тока 12 мкА. Определение проводят при 35^oC.

Через 3 мин в ячейку шприцем-дозатором вводят биоиндикатор до конечной концентрации клеток 1 г/л. По изменению силы тока во времени определяют эндогенную респираторную активность клеток, она имеет значение 0,24 мкА/мин.

Через 3-5 мин в ячейку вводят пробу (10 мкл) сточных вод. Предварительно проведенный химический анализ сточных вод выявил присутствие 1 г/л акриламида. После добавления пробы скорость потребления клетками кислорода меняется, респираторная активность принимает значение 0,69 мкА/мин. Разность в скорости потребления кислорода микробными клетками в буферном растворе до и после добавления пробы, приведенная к количеству клеток специфическая респираторная активность имеет значение 0,45 мкА/мин•мг сухого веса клеток, что говорит о присутствии в данной пробе акриламида.

Пример 2. Определение концентрации акриламида в промышленных сточных водах.

Получают биомассу клеток Brevibacterium sp. 13ПА и готовят биоиндикатор, как показано в примере 1.

Готовят серию стандартных растворов акриламида с концентрациями (г/л): 1,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0. Для каждого раствора не менее пяти раз проводят определение специфической респираторной активности, как показано в примере 1. Концентрация акриламида в ячейке составляет для каждого стандартного раствора соответственно (г/л): 0,01; 0,025; 0,05; 0,075; 0,10. Полученные зависимости специфической респираторной активности клеток от концентрации эталонных растворов представлены в табл. 1.

Линейный участок зависимости респираторной активности клеток от концентрации внесенного акриламида находится в интервале концентраций 0,001-0,1 г/л, минимальная определяемая концентрация 0,01 г/л. Как показано в примере 1, респираторный ответ клеток на введение образца сточных вод составляет 0,45 мкА/мин•мг сухого веса клеток. По полученной калибровочной зависимости определяется концентрация акриламида, она составляет 1 г/л.

Пример 3. Индикация и определение концентрации акриловой кислоты.

Получают биомассу клеток Brevibacterium sp. 13ПА и готовят биоиндикатор как показано в примере 1.

Готовят серию стандартных растворов акриловой кислотой с концентрациями (г/л): 1,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0. Для каждого раствора не менее пяти раз проводят определение специфической респираторной активности, как показано в примере 1. Концентрация акриловой кислоты в ячейке составляет для каждого стандартного раствора соответственно (г/л): 0,01; 0,025; 0,05; 0,075; 0,10. Полученные зависимости специфической респираторной активности клеток от концентрации эталонных растворов представлены в табл. 2.

Линейный участок зависимости респираторной активности клеток от концентрации внесенной акриловой кислоты находится в интервале концентраций 0,01-0,1 г/л, минимальная определяемая концентрация 0,001 г/л. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о возможности индикации и количественного определения акриловой кислоты.

Пример 4. Исследование оптимального значения pH среды при проведении анализа.

Получают биомассу клеток Brevibacterium sp. 13ПА и готовят биоиндикатор, как показано в примере 1. Однако при определении специфической респираторной активности используют буферные растворы с различным pH (0,01 М HCl-глициновый буфер pH 3,3; 0,01 М фосфатный буфер pH 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 0,01 М NaOH-глициновый буфер pH 8,5; 9,0; 11,0). Все остальные условия эксперимента соответствуют условиям, описанным в примере 1. В измерительную ячейку вводится раствор акриламида или акриловой кислоты до их конечной концентрации в ячейке 0,1 г/л. Результаты экспериментов приведены в табл. 3.

Таким образом, из полученных данных следует, что оптимальным значением pH для измерения специфической респираторной активности клеток данного штамма является диапазон pH 6,0 8,0.

Пример 5. Исследование оптимальной температуры среды при проведении анализа.

Получают биомассу клеток Brevibacterium sp. 13ПА и готовят биоиндикатор как показано в примере 1. Однако определение специфической респираторной активности клеток проводится при различных температурах (10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 50; 55^oC). Все остальные условия эксперимента соответствуют условиям, описанным в примере 1. В измерительную ячейку вводится раствор акриламида или акриловой кислоты до их конечной концентрации в ячейке 0,1 г/л. Результаты экспериментов приведены в табл. 4.

Таким образом, из полученных данных следует, что оптимальным значением температуры для измерения специфической респираторной активности данного штамма является диапазон 25-35^oC.

Пример 6. Индикация уксусной кислоты клетками штамма Brevibacterium sp. 13ПА.

Индикацию уксусной кислоты проводят аналогично индикации акриловой кислотой, как показано в примере 3. Раствор уксусной кислоты вносят в ячейку до конечной концентрации 0,01 г/л. Специфическая респираторная активность составляет 0,18 мкА/мин•мг сухого веса клеток.

Пример 7. Индикация ацетамида клетками штамма Brevibacterium sp. 13ПА.

Индикацию ацетамида проводят аналогично индикации акриламида, как показано в примере 1, но вместо промышленных сточных вод в ячейку вносят раствор ацетамида до конечной концентрации 0,01 г/л. Специфическая респираторная активность составляет 0,32 мкА/мин•мг сухого веса клеток.

Пример 8. Индикация акриламида и акриловой кислоты клетками штамма Rhodococcus rhodochrous М8.

Предварительно получают биомассу клеток штамма R.rhodochrous М8 (ВКПМ S-926) следующим образом: производят засев культуры на среду, состоящую из глюкозы 10 г/л, мочевины 12 г/л, дрожжевого экстракта 1,5 г/л, KH₂PO₄ 0,1 г/л, K₂HPO₄ 0,1 г/л, MgSO₄ 1 г/л, CoCl₂ 0,01 г/л pH 7,2. Культивирование проводят при круговом перемешивании 120 об/мин (30^oC).

Для получения биоиндикатора 2-суточную культуру центрифугируют, отмывают и переносят на солевую среду (0,01 М фосфатный буфер, 0,01 г/л CoCl₂, 0,232 г/л MgSO₄, 0,392 г/л ЭДТА, 5,0 г/л акриламида pH 7,2), до конечной концентрации клеток 2 г/л. Инкубирование клеток осуществляют на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при 28^oC в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием, например, на центрифуге К-24 (ГДР) при 10000 об/мин в течение 5 мин, отмывают и ресуспендируют 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2. По оптической плотности клеточной суспензии, измеренной при длине волны 540 нм, l 0,5 см, против фосфатного буфера, определяют концентрацию клеток.

Специфическую респираторную активность клеток данного штамма по отношению к акриламиду или акриловой кислоте определяют, как показано в примерах 1 и 3. При концентрации акриламида и акриловой кислоты 0,1 г/л специфическая респираторная активность клеток составляет соответственно 0,32 и 0,30 мкА/мин•мг сухого веса клеток.

Пример 9. Индикация акриламида и акриловой кислоты клетками штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes КМ6П.

Биомассу клеток штамма P.pseudoalcaligenes КМ6П (ВКПМ В-4418) получают культивированием на 2% МПА при 30^oC. Биоиндикатор получают, инкубируя биомассу в среде следующего состава: фосфатный буфер 0,01 М pH 7,2, 0,23 г/л MgSO₄, 0,392 ЭДТА, 0,1 г/л акриловой кислоты и готовят для измерения респираторной активности клеток, как показано в примере 8.

Специфическую респираторную активность клеток данного штамма по отношению к акриламиду или акриловой кислоте определяют, как показано в примерах 1 и 3. При концентрации акриламида и акриловой кислоты 0,1 г/л специфическая респираторная активность клеток составляет соответственно 0,25 и 0,40 мкА/мин•мг сухого веса клеток.

Пример 10. Индикация уксусной кислоты клетками штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes КМ6П.

Биоиндикатор готовят, как показано в примере 9. Измерения проводят, как показано в примере 1. Специфическая респираторная активность составляет 0,50 мкА/мин•мг сухого веса клеток при концентрации уксусной кислоты в ячейке 0,1 г/л
Пример 11. Индикация бутирамида клетками штамма Rhodococcus rhodochrous М8.

Биоиндикатор готовят, как показано в примере 8. Измерения проводят, как показано в примере 1. Специфическая респираторная активность составляет 0,20 мкА/мин•мг сухого веса клеток при концентрации бутирамида в ячейке 0,05 г/л.

Пример 12. Индикация пропионовой кислоты клетками Pseudomona psseudoalcaligenes КМ6П.

Биоиндикатор готовят, как показано в примере 9. Измерения проводят, как показано в примере 1. Специфическая респираторная активность составляет 0,30 мкА/мин•мг сухого веса клеток при концентрации пропионовой кислоты в ячейке 0,1 г/л.

Пример 13. Индикация пропионамида клетками штамма Rhodococcus rhodochrous М8.

Биоиндикатор готовят как показано в примере 8. Измерения проводят как показано в примере 1. Специфическая респираторная активность составляет 0,23 мкА/мин•мг сухого веса клеток при концентрации пропионамида в ячейке 0,01 г/л.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в том, что он расширяет класс биосенсорных способов для определения органических соединений, а именно, позволяет определять алифатические кислоты с короткой углеводородной цепью и их амиды, в частности, акриловую кислоту и акриламид, и увеличивает чувствительность определения.

Использование: изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, экологии, количественному анализу веществ и может быть использовано для определения наличия и концентрации алифатических кислот с короткой углеводородной цепью и их амидов в водных растворах. Сущность изобретения: способ включает взаимодействие водного раствора исследуемого вещества с биоиндикатором, регистрацию изменения концентрации кислорода в среде до и после вышеназванного взаимодействия и определение по изменению концентрации кислорода наличия концентрации искомого вещества, взаимодействие осуществляют на солевой среде с искомым соединением, а в качестве биоиндикатора используют клетки микроорганизмов, в частности, клетки штамма Brevibacterium species ВКПМ В-4987 или штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes ВКПМ В-4418, или штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ S-926. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ определения алифатических кислот с углеводородной цепью С₁ С₄ и их амидов, включающий взаимодействие водного раствора исследуемого вещества с клетками микроорганизмов, регистрацию изменения концентрации кислорода в среде с последующим обнаружением искомого вещества и его количественным определением, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют с активированными на солевой среде с искомым соединением клетками микроорганизмов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют с клетками штамма бактерий Brevibacterium species ВКПМ В-4987 при температуре 15 50^oС и pН среды 5,5 9,0. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют с клетками штамма бактерий Pseudomonas pseudoalcaligenes ВКПМ В-4418 или штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ S-926.