КОМПЛЕКТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ТОКСИНОВ ГРИБА БЛЕДНОЙ ПОГАНКИ Amanita phalloides Российский патент 2003 года по МПК G01N31/22 G01N21/78 G01N33/02 

Настоящее изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды высокотоксичными грибами, в частности грибами бледной поганки Amanita phalloides.

Известно, что токсическое действие бледной поганки обусловлено ингибированием фермента ДНК полимеразы. Главной причиной летального исхода при отравлении грибами бледной поганки является токсическое действие токсинов семейства аманитинов, отличающихся наиболее высокой токсичностью среди токсинов бледной поганки. Так, токсичность аманитина составляет 0,1 мг/кг живого веса для человека.

Высокая токсичность бледной поганки ставит перед необходимостью контролировать наличие токсинов этого гриба. В этих целях предложен ряд инструментальных аналитических методик, реализуемых на сложных дорогих аналитических приборах [1, 2] . Однако эти методики трудоемки, технология их проведения сложна. Так, например, определение токсинов бледной поганки аманитинов по реакции Шифовых оснований [1] предусматривает добавление к извлечению из бледной поганки 1% раствора диметиламинобензальдегида в концентрированной серной кислоте и проведение реакции в течение суток с последующей экстракцией хлороформом и т. д. Анализ с реактивом Шталя [2] требует нагревания на водяной бане и регистрации аналитического эффекта по интенсивности флуоресценции.

Предлагаемое решение направлено на создание простого в эксплуатации технического средства анализа токсинов бледной поганки, доступного каждому грибнику.

В полевых и домашних условиях, условиях леса целесообразно использование для определения токсинов бледной поганки наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации технических средств типа "индикаторный билет".

Предложен ряд простейших технических средств на основе фермента холинэстеразы сыворотки крови лошади для определения фосфорорганических инсектицидов [3-5] . Эти технические средства также позволяют обнаруживать токсины бледной поганки, но только в больших концентрациях, что не соответствует высокой токсичности аманитинов.

Известен комплект для индикации ингибиторов холинэстеразы [3], состоящий из двух- или трехстворчатой подложки, на которой зафиксированы ферментный и субстратный элементы, изолированные друг от друга масками из фольги, контейнер с дистиллированной водой.

Конструкция комплекта предусматривает расположение вокруг обоих элементов кромки, выступающей над уровнем подложки. Причем диаметры кромок вокруг субстратного и ферментного элементов выполнены в таких размерах, чтобы достигалось совмещение этих элементов при сложении билета пополам. Контейнер с водой размещен под ферментным элементом или на соседней (третьей) створке.

В состав комплекта также входит блок для предохранения от нарушения масок из фольги, изолирующих ферментный и субстратный элементы, а также контейнер с водой, в процессе хранения.

Устройство для совмещения ферментного и субстратного элементов выполнено в виде щипцов для колки орехов.

Данный комплект принят в качестве аналога предлагаемого технического решения. Аналог [1] имеет ряд недостатков. Для производства аналога [1] необходима сложная технология, что существенно его удорожает.

Известно также техническое средство, названное авторами "биосенсор" [4], представляющее собой два элемента. Ферментный элемент, содержащий ацетилхолинэстеразу, изготовлен из хлопковой ткани, модифицированной окислением перекисью водорода в щелочной среде в присутствии хлорида магния. Второй элемент изготовлен из фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором субстрата ацетилтиохолинийодида и реактива на тиольную группу 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) (далее по тексту реактива Эллмана).

Ферментный элемент изготовляют путем погружения полоски из модифицированной хлопковой ткани в буферный раствор ацетилхолинэстеразы (далее по тексту АХЭ) на 30 мин с последующей сушкой его на воздухе. Аналогично, путем погружения фильтровальной бумаги в спиртовый раствор ацетилтиохолинйодида и реактива Эллмана (с последующей сушкой на воздухе при 20^oС) получают субстрат-индикаторный элемент. Анализ зараженности пробы проводят погружением ферментного элемента в анализируемую воду (водную вытяжку) на 30 минут, затем вынимают, совмещают с субстрат-индикаторным элементом и визуально наблюдают изменение окраски: в случае желтого окрашивания элемента делают заключение об отсутствии в пробе ингибитора ХЭ, отсутствие желтого окрашивания является критерием наличия в пробе ингибитора ХЭ.

Представленный выше "биосенсор" для определения ингибиторов ХЭ принят нами в качестве ближайшего аналога (далее по тексту прототипа).

В качестве наиболее существенного недостатка прототипа следует отметить его низкую чувствительность по отношению к токсинам бледной поганки.

Предлагаемое решение направлено на снижение предела обнаружения токсинов бледной поганки и погрешности результатов анализа при снижении затрат на анализ за счет использования относительно недорогих реактивов.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом комплекте индикаторный элемент импрегнирован реактивом на токсины бледной поганки - аманитины. Аманитины являются сильными ингибиторами ДНК полимеразы. Исследования показали возможность создания комплекта для высокочувствительного обнаружения токсинов бледной поганки аманитинов на основе полимеразной цепной реакции. Однако для реализации полимеразной цепной реакции (ПЦР) необходимы дорогие ДНК-полимераза и реактивы. Более доступным является реактив на аминогруппу ангидро-бис-индандион (биндон).

Предлагаемый комплект состоит из двух элементов: "индикаторного билета" (фиг. 1) и "буферного билета" (фиг. 2), заключенных в герметичную упаковку из пищевой фольги. "Билеты" представляют собой индикаторный или буферный элемент, соответственно, фиксированный на подложке из нейтральной прозрачной пленки (позиция 2 фиг.1, 2). Наличие прозрачной подложки позволяет проводить наблюдение за изменением окраски индикаторного элемента не разнимая "билетов".

Индикаторный элемент (фиг. 1 позиция 1) представляет собой полоску пористого материала, импрегнированного ангидро-бис-индандионом. Буферный элемент (фиг. 2 позиция 1) представляет собой полоску пористого материала, пропитанного буферным раствором (рН 6, 7).

Достоинством предлагаемого комплекта является равномерность распределения реагента по поверхности индикаторного элемента, что достигается благодаря пропитке ленты из хроматографической бумаги (или ленты из другого пористого материала) в специальном устройстве (производства КБ Тулаавтоматика), модифицированном путем замены пропиточной ванны открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по различным каналам могут подаваться пропиточные растворы. Пропитка ленты пропиточными рецептурами осуществляется при перемещении ленты из хроматографической бумаги с постоянной скоростью под открытым реактором (Описание устройства описанного открытого реактора представлено в авторском свидетельстве СССР 1384637, приоритет от 27 августа 1986 года). В данном случае для подачи в открытый реактор пропиточных растворов использовался перистальтический насос. Предложенный способ обеспечивает равномерность нанесения пропиточной рецептуры на ленту.

Пример 1.

Изготовление индикаторного элемента
Использованные реагенты и материалы:
ангидро-бис-индандион;
лента из хроматографической бумаги;
Рабочие растворы:
раствор ангидро-бис-индандиона в этиловом спирте, 0,02%.

Ленту из бумаги для хроматографии шириной 15 мм пропитывали 0,02% раствором ангидро-бис-индандиона в этиловом спирте на пропиточном устройстве для пропитки лент, модифицированном путем замены пропиточной ванны открытым реактором с дисковой мешалкой. Сушка ленты в пропиточном устройстве осуществлялась при 75-80^oС. Из ленты нарезали "индикаторные элементы" длиной в 4 см.

Для удобства в работе индикаторный элемент фиксирован на ленте из прозрачной нейтральной пленки, например полимерной, шириной 2 см и длиной 6 см. Изготовленный таким образом "индикаторный билет" представлен на фиг. 1.

Пример 2
Изготовление элемента, пропитанного буферным раствором
Использованные реагенты и материалы:
фосфатный буфер, 0,07 моль/л, рН 6,7;
лента из хроматографической бумаги.

Рабочие растворы:
фосфатный буфер, 0,07 моль/л, рН 6,7.

Ленту из бумаги для хроматографии шириной 15 мм пропитывали фосфатным буфером на пропиточном устройстве для пропитки лент, модифицированном путем замены пропиточной ванны открытым реактором с дисковой мешалкой. Сушка ленты в пропиточном устройстве осуществлялась при 95-100^oС. Из ленты нарезали "буферные элементы" длиной в 5 см.

Для удобства в работе буферный элемент фиксирован на ленте из прозрачной нейтральной пленки, например полимерной, шириной 2 см и длиной 6 см. Изготовленный таким образом "индикаторный билет" представлен на фиг. 2.

Пример 3
Пробоподготовка грибов для анализа:
5-6 г грибов, предназначенных для анализа, мелко нарезают, заливают 10 мл воды, тщательно перемешивают 10-15 мин, 10-15 мин дают взвеси отстояться.

Пример 4
Определение содержания аманитипов и водной вытяжке из грибов:
После снятия с "индикаторного" и "буферного билетов" защитной упаковки, "буферный билет" погружали в извлечение из гриба (или наносили 3-4 капли анализируемой пробы на "буферный билет"). Затем совмещали пропитанный извлечением из гриба "буферный билет" с "индикаторным билетом" и через 5 минут наблюдали сине-фиолетовое окрашивание при наличии в извлечении из гриба аманитинов, т.е. бледной поганки. Отсутствие сине-фиолетового окрашивания позволяет сделать заключение об отсутствии в анализируемой пробе аманитинов. Чувствительность анализа по β-аманитину составляет (1-5) мг/мл.

Существенные признаки прототипа и предлагаемого комплекта представлены в таблице.

Таким образом, совокупность существенных признаков предлагаемого решения (использование для импрегнирования индикаторного элемента ангидро-бис-индандиона - реактива на аминогруппу, а также изготовление индикаторных элементов путем равномерного нанесения на ленту из хроматографической бумаги (или другого пористого материала) аналитических рецептур в пропиточном устройстве с открытым реактором обеспечивает достижение заявленного технического результата: снижения предела обнаружения токсинов бледной поганки - аманитинов и погрешности результата анализа.

Использованные источники
1. Алексеев В.Т. Клиническая медицина. 1993. т. 71. 5, с.63-65.

2. Белов Н.В. Методологичекие основы познания биологических особенностей грибов. Донецк 1997, с. 30.

3. WO 85/04424, 10 Oktober 1985, C 12 Q 1/46, С 12 N 11/12, Detector kit for indication of nerve gases and other cholinesterase-inhibitors.

4. WO 94/05808, 17 March 1994, C 12 Q 1/46, C 12 N 11/12, Biosensor for and distinguishing between cholinesterases inhibitors.

5. Авторское свидетельство СССР 1384637, приоритет от 27 августа 1986 года.

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды высокотоксичными грибами, в частности грибами бледной поганки Amanita phalloides. Комплект состоит из двух "билетов": "индикаторного билета", импрегнированного ангидро-бис-индандионом, и "буферного билета". Оба "билета" изготовлены из пористого материала, пропитанного требуемым раствором и зафиксированного на ленте из прозрачной нейтральной пленки. Комплект позволяет снизить предел обнаружения токсинов бледной поганки - аманитинов, снизить погрешность результатов анализа. Комплект дешев, что делает его доступным для каждого грибника. 2 ил., 1 табл.

Комплект для обнаружения токсинов гриба бледной поганки Amanita phalloides, включающий индикаторный элемент, импрегнированный аналитическим реагентом, и элемент, пропитанный буферным раствором, отличающийся тем, что индикаторный элемент импрегнирован аналитическим реагентом на токсины бледной поганки аманитины ангидро-бис-индандионом.