СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОДЕ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТАХ Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/46 G01N31/22 

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды.

Известен селективный иммуноферментный способ определения ингибитора холинэстеразы, предусматривающий последовательный синтез гаптена (соединения, близкого по структуре к аналиту), его конъюгата с белком для получения антигена с последующей иммунизацией полученным антигеном животных и выделением антител [1]. Данный способ является аналогом предлагаемого.

Способ-аналог дорогой, трудоемкий, для его осуществления необходимо несколько часов.

Более близким к предлагаемому является способ определения ингибитора холинэстеразы, предусматривающий измерение степени поляризации флуоресценции комплекса антитела с трассером (соединения гаптена с флуоресцентной меткой) в отсутствии и присутствии анализируемой пробы [2]. Этот способ принят нами в качестве прототипа.

Способ-прототип, как и способ-аналог предусматривает синтез гаптена, антигена на его основе, иммунизацию животных, получение антител и т.д., то есть также является дорогим и сложным в исполнении. Стоимость анализа по способу-прототипу возрастает в связи с необходимостью использования моноклональных антител, поскольку при использовании поликлональных антител способ малоспецифичен. Однако даже использование моноклональных антител не обеспечивает высокую селективность анализа.

Указанные выше недостатки ведут к увеличению как трудоемкости, так и стоимости анализа. Предлагаемое решение направлено на уменьшение стоимости и времени, необходимого на проведение анализа, а также на упрощение технологии анализа.

Технический результата достигается тем, что в предлагаемом экспресс-способе вместо комплекса антитела с трейсером используется комплекс холинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором.

Нами установлено, что интенсивность флуоресценции фермент-ингибиторного комплекса холинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором снижается в присутствии в анализируемой пробе необратимого ингибитора холинэстеразы. Аналогичный эффект наблюдается и при воздействии необратимого ингибитора на комплекс ацетилхолинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором. Однако использование в качестве реагента ацетилхолинэстеразы в данном случае не представляется целесообразным по причине низкой стабильности ее растворов.

В качестве обратимых ингибиторов-фотолюминофоров в составе комплекса с холинэстеразой нами исследованы этакридин, аминостигмин, физостигмин и др. При наличии в пробе в качестве аналита необратимого ингибитора (I_ан) будет наблюдаться снижение интенсивности флуоресценции в результате образования фермент-ингибиторного комплекса с ингибитором-аналитом в соответствии со следующей системой уравнений:
E+I_об ⇄ EI_об; (1)
E+l_ан ⇄ EI_ан (2)
Холинэстераза отличается высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к ингибиторам. Как известно, скорость образования фермент-ингибиторного комплекса холинэстераза-ингибитор очень высока, равновесие в такой системе устанавливается за доли секунды. При этом с увеличением токсичности ингибитора холинэстеразы возрастает скорость образования фермент-ингибиторного комплекса. Особенно чувствителен предлагаемый способ по отношению к необратимым ингибиторам холинэстеразы, поскольку по мере связывания фермента в соответствии с уравнением
E + I_необ ⇄ [EI_необ--->EI_необ + p_i (3)
будет иметь место диссоциация флуоресцирующего комплекса холинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором и равновесие в системе будет смещаться в сторону образования комплекса холинэстеразы с ингибитором-аналитом, что приведет к снижению интенсивности флуоресценции реакционного раствора.

Пример 1
Определение параоксона
Реактивы и приборы
Для работы использовались следующие реактивы и препараты: Параоксон, получен от фирмы "Сигма" (ФРГ); фармакопейный препарат этакридин; препараты холинэстеразы, получены от Института вакцин и сывороток им. Мечникова, г. Пермь.

Исследования проводили на спектрофлуориметре фирмы Hitachi при длине возбуждающего света λ_ex 360 нм. Регистрация аналитического эффекта проводилась при длине волны 510 нм (эта длина волны соответствует максимуму интенсивности флуоресценции этакридина) при 20^oC.

Количественные соотношения реагентов выбраны таким образом, чтобы вся холинэстераза была связана комплекс с этакридином, не допуская при этом его значительного избытка.

Рабочие растворы
1. Фосфатный буфер; pH 7,5; 0,07 моль/л
2. Раствор холинэстеразы в фосфатном буфере; 1,25 AE/мл
3. Раствор этакридина; 0,05 мг/мл
4. Раствор параоксона; 1·10^-4 мг/мл
Ход анализа
В пробирку вносили 0,4 мл раствора холинэстеразы и 0,1 мл раствора этакридина, реакционный раствор перемешивали и вносили 2 мл анализируемого раствора параоксона (в случае контрольного опыта, вместо анализируемой пробы вносили 2 мл дистиллированной воды). Реакционный раствор перемешивали, переливали в кювету и регистрировали интенсивность флуоресценции реакционного раствора.

Во всех опытах интенсивность флуоресценции реакционного раствора возрастала мгновенно и последующие 5 мин изменение интенсивности флуоресценции не наблюдалось. Интенсивность флуоресценции оценивалась в условных единицах, за 100% принята исходная интенсивность комплекса холинэстеразы с этакридином.

Результаты анализа приведены ниже в табл. 1.

Приведенные в таблице данные позволяют сделать заключение о низкой погрешности результатов анализа предлагаемым бессубстратным способом. Предлагаемый экспресс-способ осуществляется в однофазной системе, не требует предварительной пробоподготовки, прост в исполнении, позволяет определять концентрацию аналита в течение нескольких минут.

Таким образом, совокупность существенных признаков предлагаемого решения (использование холинэстеразы вместо антитела и обратимого ингибитора-фотолюминофора) обеспечивает достижение заявленного технического результата: уменьшение стоимости и времени, необходимого для анализа, а также упрощение технологии анализа.

В табл. 2 сопоставлены существенные признаки способа-прототипа и предлагаемого способа.

Использованные литературные источники
1. Jean-Mare Grognet et al. Production and characterization of antibodies directed against organophosphorus nerve agent VX. Arch. Toxicol. 1993, c. 67, 66-77.

2. Уильямз А. Т.Р. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ// Новые методы иммуноанализа/ Под редакцией Коллинз У.П. М.:Мир, c. 1991.138.

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано в охране окружающей среды. Измеряют интенсивность флуоресценции комплекса холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-фотолюминофором в среде буфера в присутствии и в отсутствие анализируемой пробы воды (водного экстракта). Содержание аналита в анализируемой пробе определяют по предварительно установленной зависимости интенсивности флуоресценции комплекса холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-фотолюминофором от концентрации необратимого ингибитора холинэстеразы. Использование бессубстрактного экспресс-способа анализа необратимых ингибиторов холинэстеразы в воде и водных экстрактах не требует предварительной пробоподготовки, осуществляется в однофазной системе, упрощает исполнение, позволяет определить концентрацию аналита в пробе в течение нескольких минут. 2 табл.

Способ определения необратимых ингибиторов холинэстеразы в воде и водных экстрактах, включающий измерение интенсивности флуоресценции комплекса белка с фотолюминофором в среде буфера в присутствии и в отсутствие анализируемой пробы воды (водного экстракта), отличающийся тем, что в качестве комплекса белка с фотолюминофором используют комплекс холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-фотолюминофором, а содержание аналита в анализируемой пробе определяют по предварительно установленной зависимости интенсивности флуоресценции комплекса холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-фотолюминофором от концентрации необратимого ингибитора холинэстеразы.