Настоящее изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, в частности, фосфорорганическими инсектицидами и карбаматами.
Высокая токсичность и кумулятивное действие многих фосфорорганических ингибиторов (ФОИ) холинэстеразы (ChE) обусловливают актуальность создания чувствительных технических средств, предназначенных для мониторинга окружающей воздушной среды на наличие ингибиторов ChE.
В полевых условиях целесообразно использование для определения ингибиторов ChE наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации аналитических технических средств типа биосенсор - устройства, состоящего из активного компонента и преобразователя аналитического эффекта в регистрируемый сигнал (световой, звуковой и т.п.). Активный компонент биосенсора (БС) играет, в основном, роль «узнающего» агента, который специфически взаимодействует с определяемым веществом, например фермент - субстрат, фермент - ингибитор и др. Этой роли хорошо соответствует ChE, отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к ее ингибиторам. Для преобразования аналитического эффекта в информационный сигнал используют, как правило, оптические схемы.
Из оптических БС наибольшей чувствительностью к ФОИ отличаются БС, основанные на регистрации в качестве аналитического отклика флуоресценции. Известны оптические БС определения ингибиторов ChE, основанные на использовании флуоресцентной метки, являющейся обратимым ингибитором ChE [1, 2]. Например, для анализа проб воды в качестве активного компонента оптического БС используется комплекс ацетилхолинэстеразы (AChE) и флуоресцеинизоцианата (FITC), иммобилизованный на волокнах кварца [1]. Активность AChE контролируют по рН-зависимости флуоресцентного сигнала комплекса FITC-AChE, иммобилизованого на поверхности волокна. В результате ферментативного гидролиза субстрата (ацетилхолина) ацетилхолинэстеразой образуются протоны, которые ингибируют AChE, меченную FITC, и это вызывает тушение флуоресценции реакционного раствора. Обратимые ингибиторы эдрофониум и карбамат неостигмин в концентрации 0.1 мМ ингибируют AChE, меченную FITC, что ведет к уменьшению степени тушения флуоресценции. Степень снижения интенсивности флуоресценции обратно пропорциональна концентрации этих ингибиторов. Такой БС определяет концентрации ФОИ (эхотиофат и параоксон) в интервале нМ-мкМ.
Недостатком данного БС является его низкая специфичность, высокая чувствительность к кислым реагентам, которые могут присутствовать в анализируемом воздухе и, таким образом, вносить определенную погрешность в результаты анализа. Перечисленные недостатки такого БС не дают возможность использовать его для определения ингибиторов ChE в воздушной среде и проведения мониторинга.
Наиболее близким к предлагаемому аналитическому устройству является оптический БС для определения ингибиторов ChE в воздухе, активный компонент которого выполнен из комплекса этого фермента с обратимым ингибитором-люмогеном If, иммобилизованного на нейтральной подложке [2]. Интенсивность флуоресценции If, например N-метилакридина, снижается при воздействии ChE, что обусловлено образованием нефлуоресцирующего фермент-ингибиторного комплекса [ChE-If]. В свою очередь, при воздействии нефлуоресцирующего необратимого ингибитора In, например O,O-диизопропилфторфосфата, наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции. Наблюдаемый эффект обусловлен фосфорилированием ChE с высокой скоростью, что ведет к смещению равновесия в сторону диссоциации комплекса [ChE-If], увеличению концентрации свободного обратимого флуорофора-ингибитора If и, как следствие, к увеличению интенсивности флуоресценции реакционного раствора. Преимуществом данного БС является несущественное влияние повышенной кислотности атмосферного воздуха благодаря использованию в активном компоненте буфера с высокой буферной емкостью.
Однако этот БС не отвечает современным требованиям по чувствительности. Данный БС принят в качестве прототипа.
Предлагаемое решение направлено на увеличение чувствительности БС к ингибиторам ChE.
Технический результат достигается тем, что в предлагаемом БС активный компонент представляет собой иммобилизированный на подложке интенсивно флуоресцирующий комплекс, образованный AChE и флуорогеном из группы индикаторов типа "молекулярный ротор" (MR). Известен ряд таких флуорогенов MR, например пропидиум, галламин, тиофлавин Т (ТФ) и др. [3], интенсивность флуоресценции которых, например ТФ, увеличивается в присутствии AChE на два-три порядка [3]. При воздействии ФОИ на активный компонент происходит снижение интенсивности флуоресценции комплекса [AChE-ТФ] пропорционально концентрации необратимого ингибитора. В то же время установлено увеличение скорости ингибирования AChE фосфорорганическими ингибиторами в присутствии некоторых MR, например пропидиума или ТФ. Эти свойства MR позволили предложить в качестве активного компонента БС использовать комплекс [AChE-MR], отличающийся более высокой чувствительностью и меньшим временем отклика аналитического эффекта к необратимым ингибиторам ChE по сравнению с активным компонентом БС прототипа.
Кроме того, в оптическую часть БС предлагается внести лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель, что позволит увеличить чувствительность БС в целом.
Конструкция оптической части БС представлена на чертеже в виде блок-схемы.
Пример. Изготовление активного компонента
Использовались следующие реактивы фирмы "Sigma": ацетилхолинэстераза угря, тиофлавин Т, Na2HPO4, KH2PO4, параоксон, N-изопропилакриламид, N,N'-метилен-бисакриламид.
Иммобилизацию комплекса АХЭ с тиофлавином проводили в 0.03 М трис-HCI буфере (рН 7) при 4°С.
В 1 мл 0.03 М трис-HCI буфера (рН 7), содержащего 200 мг N-изопропилакриламида, АХЭ (20 Е/мл) и 1 мМ тиофлавина, добавляли при 4°С и перемешивании 0.02 мл раствора N,N'-метилен-бисакриламида (18 мг/мл), наносили на поверхность нейтральной полимерной пленки и проводили полимеризацию в течение 20 мин при УФ-облучении.
Анализ результатов определения необратимого ингибитора параоксона биосенсором-прототипом и предлагаемым биосенсором приведен таблице 1.
Из представленных в таблице 1 данных следует, что чувствительность к параоксону предложенного активного компонента существенно выше, чем прототипа.
Таким образом, активный компонент биосенсора на основе иммобилизированного на подложке интенсивно флуоресцирующего комплекса, образованного AChE и флуорогеном из группы индикаторов типа "молекулярный ротор" (MR), позволяет повысить интенсивность флуоресценции на два-три порядка и обладает способностью ускорять необратимое ингибирование AChE, что позволило сконструировать БС, более чувствительный к необратимым ингибиторам, в том числе и фосфорорганическим ингибиторам, по сравнению с БС прототипом.
В таблице 2 сопоставлены существенные признаки БС прототипа и предлагаемого БС.
Использованные литературные источники
1. Rogers K.R, Сао С.J, Valdes J.J, Eldefrawi A.T, Eldefrawi M. E. Fundam Appl Toxicol 1991. v.16, p.810-20.
2. Патент РФ №2198394, 18.12.2003. МПК7 C12Q 1/46, G01N 21/76.
3. De Ferrari G.V., Mallender W.D., Inestrosa N.C., Rosenberry T.L. J.Biol. Chem. 2001. v.276, p.23282-23287.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОДЕ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТАХ | 1999 |
|
RU2165458C1 |
КОМПЛЕКТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ТОКСИНОВ ГРИБА БЛЕДНОЙ ПОГАНКИ Amanita phalloides | 2000 |
|
RU2208784C2 |
Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе | 2016 |
|
RU2654294C2 |
ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ | 2000 |
|
RU2198394C2 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КРОВИ | 1998 |
|
RU2153675C2 |
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, СВЯЗАННЫЕ СО СЛИЯНИЕМ АЛК, ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА | 2010 |
|
RU2562144C2 |
РЕПРЕЗЕНТАТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА | 2016 |
|
RU2743169C2 |
IL-1 АЛЬФА И БЕТА БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ДОМЕНАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2011 |
|
RU2627171C2 |
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ СВЯЗЫВАНИЯ СФИНГОЗИН-1-ФОСФАТА | 2007 |
|
RU2460541C2 |
СВЯЗЫВАЮЩИЕ IL-1 БЕЛКИ | 2011 |
|
RU2615173C2 |
Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, в частности, фосфорорганическими инсектицидами и карбаматами. Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе включает оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного на нейтральной подложке комплекса, включающего холинэстеразу и флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор» (MR), который интенсивно флуоресцирует с этим ферментом в составе комплекса ацетилхолинэстераза-молекулярный ротор. В качестве флуорогенного индикатора используют тиофлавин Т, интенсивность флуоресценции которого в присутствии ацетилхолинэстеразы увеличивается более чем в 1000 раз. Кроме того, ускоряется необратимое ингибирование ацетилхолинэстеразы, вследствие чего биосенсор по изобретению является более чувствительным к необратимым ингибиторам, в том числе и к ингибиторам холинэстеразы. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.
1. Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе, включающий оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного на нейтральной подложке комплекса, отличающийся тем, что указанный комплекс представляет собой интенсивно флуоресцирующий комплекс, включающий холинэстеразу и флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор».
2. Оптический биосенсор по п.1, отличающийся тем, что флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор» представляет собой тиофлавин Т.
3. Оптический биосенсор по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что он включает лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель.
ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ | 2000 |
|
RU2198394C2 |
De Ferrari G.V., Mallender W.D., Inestrosa N.C., Rosenberry T.L., J.Biol | |||
Chem., 2001, June, 29, v.276, p.23282-23287 | |||
Зарубежная наука и техника, вып | |||
Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб | 1921 |
|
SU23A1 |
Новости науки и техники | |||
Rogers K.R., Cao C.J., Valdes J.J., Eldefrawi А.Т., Eldefrawi М.Е., Fundam Appl Toxicol, 1991, v.16, p.810-820. |
Авторы
Даты
2010-04-10—Публикация
2007-07-31—Подача