ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ Российский патент 2010 года по МПК G01N21/76 C12Q1/46 

Описание патента на изобретение RU2386120C2

Настоящее изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, в частности, фосфорорганическими инсектицидами и карбаматами.

Высокая токсичность и кумулятивное действие многих фосфорорганических ингибиторов (ФОИ) холинэстеразы (ChE) обусловливают актуальность создания чувствительных технических средств, предназначенных для мониторинга окружающей воздушной среды на наличие ингибиторов ChE.

В полевых условиях целесообразно использование для определения ингибиторов ChE наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации аналитических технических средств типа биосенсор - устройства, состоящего из активного компонента и преобразователя аналитического эффекта в регистрируемый сигнал (световой, звуковой и т.п.). Активный компонент биосенсора (БС) играет, в основном, роль «узнающего» агента, который специфически взаимодействует с определяемым веществом, например фермент - субстрат, фермент - ингибитор и др. Этой роли хорошо соответствует ChE, отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к ее ингибиторам. Для преобразования аналитического эффекта в информационный сигнал используют, как правило, оптические схемы.

Из оптических БС наибольшей чувствительностью к ФОИ отличаются БС, основанные на регистрации в качестве аналитического отклика флуоресценции. Известны оптические БС определения ингибиторов ChE, основанные на использовании флуоресцентной метки, являющейся обратимым ингибитором ChE [1, 2]. Например, для анализа проб воды в качестве активного компонента оптического БС используется комплекс ацетилхолинэстеразы (AChE) и флуоресцеинизоцианата (FITC), иммобилизованный на волокнах кварца [1]. Активность AChE контролируют по рН-зависимости флуоресцентного сигнала комплекса FITC-AChE, иммобилизованого на поверхности волокна. В результате ферментативного гидролиза субстрата (ацетилхолина) ацетилхолинэстеразой образуются протоны, которые ингибируют AChE, меченную FITC, и это вызывает тушение флуоресценции реакционного раствора. Обратимые ингибиторы эдрофониум и карбамат неостигмин в концентрации 0.1 мМ ингибируют AChE, меченную FITC, что ведет к уменьшению степени тушения флуоресценции. Степень снижения интенсивности флуоресценции обратно пропорциональна концентрации этих ингибиторов. Такой БС определяет концентрации ФОИ (эхотиофат и параоксон) в интервале нМ-мкМ.

Недостатком данного БС является его низкая специфичность, высокая чувствительность к кислым реагентам, которые могут присутствовать в анализируемом воздухе и, таким образом, вносить определенную погрешность в результаты анализа. Перечисленные недостатки такого БС не дают возможность использовать его для определения ингибиторов ChE в воздушной среде и проведения мониторинга.

Наиболее близким к предлагаемому аналитическому устройству является оптический БС для определения ингибиторов ChE в воздухе, активный компонент которого выполнен из комплекса этого фермента с обратимым ингибитором-люмогеном If, иммобилизованного на нейтральной подложке [2]. Интенсивность флуоресценции If, например N-метилакридина, снижается при воздействии ChE, что обусловлено образованием нефлуоресцирующего фермент-ингибиторного комплекса [ChE-If]. В свою очередь, при воздействии нефлуоресцирующего необратимого ингибитора In, например O,O-диизопропилфторфосфата, наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции. Наблюдаемый эффект обусловлен фосфорилированием ChE с высокой скоростью, что ведет к смещению равновесия в сторону диссоциации комплекса [ChE-If], увеличению концентрации свободного обратимого флуорофора-ингибитора If и, как следствие, к увеличению интенсивности флуоресценции реакционного раствора. Преимуществом данного БС является несущественное влияние повышенной кислотности атмосферного воздуха благодаря использованию в активном компоненте буфера с высокой буферной емкостью.

Однако этот БС не отвечает современным требованиям по чувствительности. Данный БС принят в качестве прототипа.

Предлагаемое решение направлено на увеличение чувствительности БС к ингибиторам ChE.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом БС активный компонент представляет собой иммобилизированный на подложке интенсивно флуоресцирующий комплекс, образованный AChE и флуорогеном из группы индикаторов типа "молекулярный ротор" (MR). Известен ряд таких флуорогенов MR, например пропидиум, галламин, тиофлавин Т (ТФ) и др. [3], интенсивность флуоресценции которых, например ТФ, увеличивается в присутствии AChE на два-три порядка [3]. При воздействии ФОИ на активный компонент происходит снижение интенсивности флуоресценции комплекса [AChE-ТФ] пропорционально концентрации необратимого ингибитора. В то же время установлено увеличение скорости ингибирования AChE фосфорорганическими ингибиторами в присутствии некоторых MR, например пропидиума или ТФ. Эти свойства MR позволили предложить в качестве активного компонента БС использовать комплекс [AChE-MR], отличающийся более высокой чувствительностью и меньшим временем отклика аналитического эффекта к необратимым ингибиторам ChE по сравнению с активным компонентом БС прототипа.

Кроме того, в оптическую часть БС предлагается внести лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель, что позволит увеличить чувствительность БС в целом.

Конструкция оптической части БС представлена на чертеже в виде блок-схемы.

Пример. Изготовление активного компонента

Использовались следующие реактивы фирмы "Sigma": ацетилхолинэстераза угря, тиофлавин Т, Na2HPO4, KH2PO4, параоксон, N-изопропилакриламид, N,N'-метилен-бисакриламид.

Иммобилизацию комплекса АХЭ с тиофлавином проводили в 0.03 М трис-HCI буфере (рН 7) при 4°С.

В 1 мл 0.03 М трис-HCI буфера (рН 7), содержащего 200 мг N-изопропилакриламида, АХЭ (20 Е/мл) и 1 мМ тиофлавина, добавляли при 4°С и перемешивании 0.02 мл раствора N,N'-метилен-бисакриламида (18 мг/мл), наносили на поверхность нейтральной полимерной пленки и проводили полимеризацию в течение 20 мин при УФ-облучении.

Анализ результатов определения необратимого ингибитора параоксона биосенсором-прототипом и предлагаемым биосенсором приведен таблице 1.

Таблица 1 Результаты определения параоксона активным компонентом биосенсора-прототипа и предлагаемого биосенсора Эталонный раствор БС-прототип предлагаемый БС Количество параоксона, нМ Количество параоксона, нМ Количество параоксона, нМ 1,00 Не обнаружен 1,14±0,10 10,00 Не обнаружен 9,20±1,05 100,00 95,05±10,25 102,0±9,05

Из представленных в таблице 1 данных следует, что чувствительность к параоксону предложенного активного компонента существенно выше, чем прототипа.

Таким образом, активный компонент биосенсора на основе иммобилизированного на подложке интенсивно флуоресцирующего комплекса, образованного AChE и флуорогеном из группы индикаторов типа "молекулярный ротор" (MR), позволяет повысить интенсивность флуоресценции на два-три порядка и обладает способностью ускорять необратимое ингибирование AChE, что позволило сконструировать БС, более чувствительный к необратимым ингибиторам, в том числе и фосфорорганическим ингибиторам, по сравнению с БС прототипом.

В таблице 2 сопоставлены существенные признаки БС прототипа и предлагаемого БС.

Таблица 2. Существенные признаки биосенсора прототипа и предлагаемого биосенсора № п/п Существенные признаки Биосенсор-прототип Предлагаемый биосенсор 1 Активный компонент Комплекс холинэстеразы с люмогеном-ингибитором, иммобилизованный на нейтральной подложке Комплекс холинэстеразы с индикатором типа "молекулярный ротор", иммобилизованный на нейтральной подложке, вызывает увеличение интенсивности флуоресценции на два-три порядка 2 Время отклика Состав активного компонента не позволяет дополнительно сократить время отклика биосенсора Состав активного компонента позволяет сократить время отклика биосенсора за счет увеличения скорости необратимого ингибирования 3 Оптический датчик Классическая оптическая схема определения флуоресценции Предлагается использовать лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель для повышения стабильности и чувствительности детектирования флуоресценции

Использованные литературные источники

1. Rogers K.R, Сао С.J, Valdes J.J, Eldefrawi A.T, Eldefrawi M. E. Fundam Appl Toxicol 1991. v.16, p.810-20.

2. Патент РФ №2198394, 18.12.2003. МПК7 C12Q 1/46, G01N 21/76.

3. De Ferrari G.V., Mallender W.D., Inestrosa N.C., Rosenberry T.L. J.Biol. Chem. 2001. v.276, p.23282-23287.

Похожие патенты RU2386120C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОДЕ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТАХ 1999
  • Гайнуллина Э.Т.
  • Еремин С.А.
  • Рыбальченко И.В.
  • Рыжиков С.Б.
  • Таранченко В.Ф.
RU2165458C1
КОМПЛЕКТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ТОКСИНОВ ГРИБА БЛЕДНОЙ ПОГАНКИ Amanita phalloides 2000
  • Гайнуллина Э.Т.
  • Еремин С.А.
  • Рыбальченко И.В.
  • Рыжиков С.Б.
  • Таранченко В.Ф.
  • Цехмистер В.И.
RU2208784C2
Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе 2016
RU2654294C2
ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ 2000
  • Гайнуллина Э.Т.
  • Рыбальченко И.В.
  • Рыжиков С.Б.
  • Таранченко В.Ф.
  • Цехмистер В.И.
RU2198394C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КРОВИ 1998
  • Гайнуллина Э.Т.
  • Искалин В.И.
  • Пашинин В.А.
  • Рыбальченко И.В.
  • Таранченко В.Ф.
RU2153675C2
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, СВЯЗАННЫЕ СО СЛИЯНИЕМ АЛК, ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА 2010
  • Николз Джош
  • Дальхаузер Эрик
  • Хаут Дэвид
  • Норман Ким
RU2562144C2
РЕПРЕЗЕНТАТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА 2016
  • Александер, Нельсон
  • Бархоуми, Аоун
  • Дэй, Мелинда
  • Галлегос, Лиза
  • Лит, Кэтрин
  • Ражкович, Саманта
  • Робертс, Эстебан
  • Станислав, Стейси
  • Уолк, Эрик
RU2743169C2
IL-1 АЛЬФА И БЕТА БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ДОМЕНАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2011
  • Ву Ченбин
RU2627171C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ СВЯЗЫВАНИЯ СФИНГОЗИН-1-ФОСФАТА 2007
  • Саббадини Роджер А.
  • Гарланд Уильям А.
  • Хансен Женевьев
  • Джоунс Стивен Тарран
  • Уилльямс Дэвид Гарет
RU2460541C2
СВЯЗЫВАЮЩИЕ IL-1 БЕЛКИ 2011
  • Ву Ченбин
  • Амбрози Доминик Дж.
  • Сиех Чун-Мин
  • Гхаюр Тарик
RU2615173C2

Реферат патента 2010 года ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, в частности, фосфорорганическими инсектицидами и карбаматами. Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе включает оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного на нейтральной подложке комплекса, включающего холинэстеразу и флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор» (MR), который интенсивно флуоресцирует с этим ферментом в составе комплекса ацетилхолинэстераза-молекулярный ротор. В качестве флуорогенного индикатора используют тиофлавин Т, интенсивность флуоресценции которого в присутствии ацетилхолинэстеразы увеличивается более чем в 1000 раз. Кроме того, ускоряется необратимое ингибирование ацетилхолинэстеразы, вследствие чего биосенсор по изобретению является более чувствительным к необратимым ингибиторам, в том числе и к ингибиторам холинэстеразы. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 386 120 C2

1. Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе, включающий оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного на нейтральной подложке комплекса, отличающийся тем, что указанный комплекс представляет собой интенсивно флуоресцирующий комплекс, включающий холинэстеразу и флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор».

2. Оптический биосенсор по п.1, отличающийся тем, что флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор» представляет собой тиофлавин Т.

3. Оптический биосенсор по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что он включает лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2386120C2

ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ 2000
  • Гайнуллина Э.Т.
  • Рыбальченко И.В.
  • Рыжиков С.Б.
  • Таранченко В.Ф.
  • Цехмистер В.И.
RU2198394C2
De Ferrari G.V., Mallender W.D., Inestrosa N.C., Rosenberry T.L., J.Biol
Chem., 2001, June, 29, v.276, p.23282-23287
Зарубежная наука и техника, вып
Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб 1921
  • Игнатенко Ф.Я.
  • Смирнов Е.П.
SU23A1
Новости науки и техники
Rogers K.R., Cao C.J., Valdes J.J., Eldefrawi А.Т., Eldefrawi М.Е., Fundam Appl Toxicol, 1991, v.16, p.810-820.

RU 2 386 120 C2

Авторы

Антохин Андрей Михайлович

Андреев Олег Иванович

Гайнуллина Эра Тазетдиновна

Рыжиков Сергей Борисович

Таранченко Виктор Федорович

Кауров Николай Евгеньевич

Даты

2010-04-10Публикация

2007-07-31Подача