СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицинской биохимии, методам исследования ферментативных процессов и может быть использовано в исследовательских и клинико-биохимических лабораториях для контроля и диагностики персонала, пораженного веществами антихолинэстеразного действия, например фосфорорганическими отравляющими веществами или некоторыми пестицидами, путем определения активности холинэстеразы (далее по тексту ХЭ) в крови.

При отсутствии соединений антихолинэстеразного действия предлагаемый способ определения активности холинэстеразы может быть использован в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и определения степени тяжести больного гепатитом, циррозом, а также саркомой с метастазами в печени.

Известен ряд способов определения активности холинэстеразы в крови [1-3] . Используемый в клинических условиях способ Хестрина [1] отличается трудоемкостью: это многостадийный процесс, который предусматривает определение остаточного (не подвергнувшегося ферментативному гидролизу) субстрата ацетилхолина, причем ферментативный гидролиз проводят в слабощелочной среде, затем проводят реакцию с гидроксиламином в сильнощелочной среде и регистрируют аналитический эффект фотометрически по количеству образовавшегося окрашенного комплекса с хлорным железом в кислой среде и т.д. Этот метод является аналогом предлагаемого способа.

Наиболее близким к предлагаемому является фотометрический способ определения активности холинэстеразы в сыворотке или плазме крови по методу Эллмана [3], предусматривающий использование в качестве субстрата ацетилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойную) кислоту, в качестве буфера - трис- (гидроксиметил)-аминометан, регистрацию оптической плотности реакционного раствора при длине волны 412 нм. Активность ХЭ в пробе определяют по предварительно построенному градуировочному графику, для построения которого используют глутатион или другое соединение с известным содержанием SH-групп.

Именно этот способ определения активности ХЭ крови является традиционным и широко используется в клинической практике для диагностики [4].

Данный способ имеет наибольшее число общих признаков с предлагаемым и принят в качестве прототипа.

Известный способ [3] имеет ряд недостатков: предусматривает необходимость прерывания на третьей минуте ферментативной реакции путем добавления ингибитора ХЭ сульфата хинидина или диизопропилфторфосфата, одновременное проведение контрольного опыта, необходимость разведения анализируемой пробы во многих случаях клинического анализа крови.

Особую сложность при проведении анализа по методу Эллмана в клинических условиях на коммерческих аналитических приборах создает высокая оптическая плотность реакционного раствора при анализе нормальной крови человека с высокой активностью холинэстеразы, приводящая к весьма интенсивному поглощению в интервале длин волн 405-412 нм, в которой регистрируется аналитический эффект с использованием коммерческого комплекта реагентов. Это затрудняет построение градуировочного графика в широком диапазоне значений оптической плотности, соответствующих физиологической норме активности ХЭ в крови (1900-3800 Е/л). Для достижения точности и достоверности анализа во всем интервале градуировочного графика при проведении анализа результаты измерения активности ХЭ должны вписываться в линейный интервал градуировочного графика. Однако это требование ограничивается возможностями коммерческого прибора и концентрацией субстрата в коммерческом комплекте реагентов.

Разбавление пробы крови не представляется целесообразным, поскольку может привести к изменению активности ХЭ в результате нарушения надмолекулярных комплексов этого фермента, обусловленных белок-белковыми и другими межмолекулярными взаимодействиями с компонентами крови [5].

Причина столь высоких значений оптической плотности при измерении активности ХЭ состоит в том, что анализируемая кровь интенсивно поглощает в той же области, что и продукт взаимодействия индикатора с тиольной группой в области длин волн 405-412 нм.

Известен способ, предлагающий снижение оптической плотности реакционного раствора при проведении анализа активности ХЭ крови по методу Эллмана путем дополнительного введения в ферментативную реакцию второго субстрата, а именно бутирилхолина, который не взаимодействует с реактивом на тиольную группу [6]. Такое решение ведет к снижению достоверности и точности анализа, а также к необходимости дополнительного введения стабилизирующих веществ в комплект с реагентами. При низкой активности ХЭ в пробе возникает необходимость дополнительного анализа пробы по традиционному способу Эллмана в отсутствие второго субстрата.

Указанные выше недостатки способа определения активности холинэстеразы по методу Эллмана приводят к снижению точности и увеличению трудоемкости анализа.

Техническая задача, решаемая при создании изобретения, заключается в повышении точности измерения активности ХЭ и упрощении анализа.

Задача решена путем осуществления измерения активности холинэстеразы крови с использованием:
4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли (далее БАС-сульфо) в качестве индикатора на тиольную группу,
тангенса угла наклона начального участка кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата для регистрации аналитического эффекта.

Использование в качестве индикатора на тиольную группу, вместо 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислоты, БАС-сульфо обусловлено спектральными свойствами продукта ее взаимодействия с тиохолином. Образующийся при таком взаимодействии анион синего цвета в слабощелочных и щелочных средах имеет полосу поглощения в области спектра 570-580 нм, в то время как компоненты крови в этой области спектра поглощают слабо. Это избавляет от необходимости разбавления проб нормальной крови, поскольку измеряемая характеристика - тангенс угла наклона начального участка зависимости оптической плотности от времени - обеспечивает линейную зависимость от активности ХЭ во всем интервале значений активности этого фермента в крови.

Индикатор БАС-сульфо отличается высокой стабильностью, его растворы хранятся при ±4^oC более 3 месяцев.

В качестве субстрата в данном способе могут быть использованы ацетилтиохолин и бутирилтиохолин. Предпочтительным является использование бутирилтиохолина, гидролитически более устойчивого, чем ацетилтиохолин, и более специфичного для ХЭ, что подтверждается данными о значениях константы Михаэлиса К_м и молекулярной активности данного фермента, приведенными в таблице 1 [7].

Использование гидролитически более устойчивого и специфичного к ХЭ субстрата бутирилтиохолина, вместо ацетилтиохолина, позволяет повысить точность измерения скорости ферментативного гидролиза субстрата.

Использование тангенса угла наклона начального участка кинетической прямой для регистрации аналитического эффекта при измерении скорости ферментативного гидролиза субстрата бутирилтиохолина позволяет повысить точность, воспроизводимость предлагаемого способа, снизить его трудоемкость и сократить время анализа, поскольку отпадает необходимость проведения контрольного опыта, а также повышается точность результата измерения благодаря снижению влияния на аналитический эффект оптической плотности самой анализируемой пробы крови и контрольного опыта.

Предлагаемый способ предусматривает соотнесение результатов измерения активности крови с активностью стандартного препарата холинэстеразы. Стандартный препарат позволяет построить зависимость тангенса угла наклона начального участка кинетической кривой ферментативного гидролиза бутирилтиохолина от активности ХЭ в широком диапазоне значений. Этот диапазон полностью перекрывает результаты измерений активности крови во всем интервале значений физиологической нормы [8].

Некоторые существенные признаки предлагаемого способа и способа-прототипа сопоставлены в таблице 2.

Использование заявляемого технического решения позволяет повысить точность измерения скорости ферментативного гидролиза, существенно упрощает анализ и сокращает время его проведения.

Пример
Предлагаемый способ был использован для анализа проб крови человека, поросят, лошадей и собак, в том числе и собак, пораженных соединениями антихолинэстеразного действия; в общей сложности 86 проб крови.

При выполнении измерений соблюдали следующие условия:
анализ пробы крови и построение градуировочного графика проводили при температуре (25^o±2)^oC;
время единичного анализа при трех параллельных измерениях не превышает 15 мин.

Измерение скорости ферментативного гидролиза бутирилтиохолина проводили на фотометре фотоэлектрическом КФК-3 в соответствии с инструкцией по работе (Загорск. Оптико-механический завод) при длине волны 580 нм.

Для выполнения измерений использовали растворы следующего состава:
фосфатный буфер; 50 ммоль/л, pH 7,4;
раствор 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)- фенилдисульфида тетракалиевой соли (0,2 ммоль/л) в фосфатном буфере; реактив стабилен 3 месяца при ±4^oC;
раствор бутирилтиохолина иодистого в дистиллированной воде, 120 ммоль/л, реактив стабилен 42 дня при ±4^oC.

Ход анализа: пробу крови 0,02 мл вносят в 4,0 мл раствора 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли в фосфатном буфере, перемешивают, вносят 0,1 мл раствора субстрата, включают секундомер, реакционный раствор перемешивают, переливают в кювету (L= 10 мм), кювету ставят в фотометр КФК-3, через 30 секунд после добавления раствора субстрата нажимают последовательно на кнопки "А" и "1" на табло миникомпьютера прибора КФК-3. Через минуту на табло прибора высвечивается значение тангенса угла наклона кинетической прямой ферментативного гидролиза бутирилтиохолина иодистого относительно оси абсцисс, которое и регистрируют.

Измерение скорости ферментативного гидролиза бутирилтиохолина проводят относительно дистиллированной воды.

Расчет активности холинэстеразы в пробе проводят по предварительно построенному градуировочному графику зависимости тангенса угла наклона начального участка кинетической прямой ферментативного гидролиза субстрата бутирилтиохолина от активности стандартного препарата холинэстеразы сыворотки крови лошади, установленной в соответствии с требованиями ТУ 5765/42.14-42-76. Особенностью градуировочного графика является то, что он носит линейный характер во всем интервале измеряемой активности холинэстеразы от 400 до 4000 Е/л.

На чертеже представлены результаты сравнения предлагаемого и традиционного [3, 4] способов, а также уравнение регрессии. Представленные на чертеже данные позволяют сделать заключение о совпадении результатов измерений предлагаемым способом и способом Эллмана.

Использованные источники
1. Н. И. Каракчиев. Токсикология отравляющих веществ и защита от оружия массового поражения. "Медицина", УзССР, Ташкент: 1973, с.57.

2. Elmann G.L. et all., Biochem.Pharmacol. 1961, v.7, p.88.

3. Gerry P.J., Routh J.I., Klin.Chem., 1965, v.11, p.91.

4. Annals of clinical Biochemistry, 1979, v.16, p.57 - 75.

5. П. Фридрих. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. М: "Мир", 1986, стр.107 - 121.

6. EP 0464388 A 1, Int⁵ C12Q 1/46. Date of publication of application. 08.01.92.

7. Яковлев В.А., Кинетика ферментативных реакций. "Наука", М: 1965, стр. 162.

8. Weber, H. Dtsch.med. Wschr. 1966,. v.91, p.1927п

Способ может быть использован в медицине, а именно при измерении активности холинэстеразы крови. Фотометрическим методом при длине волны 580 нм измеряют скорость ферментативного гидролиза бутирилтиохолина в буфере с использованием в качестве индикатора на тиольную группу 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли. Скорость ферментативного гидролиза субстрата оценивают по тангенсу угла наклона начального участка кинематической кривой зависимости оптической плотности от времени ферментативного гидролиза бутирилтиохолина. Способ повышает точность измерения скорости ферментативного гидролиза, упрощает анализ и сокращает время его проведения. 1 з.п.ф-лы, 2 табл., 1 ил.

1. Способ определения активности холинэстеразы крови, включающий фотометрическое измерение скорости ферментативного гидролиза субстрата ацилтиохолина холинэстеразой крови в среде буфера с использованием индикатора на тиольную группу, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу используют 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевую соль, а скорость ферментативного гидролиза бутирилтиохолина измеряют по тангенсу угла наклона начального участка кинетической кривой, при длине волны 580 нм. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что градуировочный график носит линейный характер во всем интервале измеряемой активности холинэстеразы 400 - 4000 Е/л.