КОМПЛЕКТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/46 C12N11/12 

Изобретение относится к области контроля загрязнения окружающей среды, в частности, фосфорорганическими отравляющими веществами, инсектицидами, карбаматами и токсинами сине-зеленых водорослей.

В полевых условиях целесообразно использование для определения ингибиторов холинэстеразы (далее по тексту ХЭ) наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации технических средств типа "индикаторных билетов". Предложен ряд простейших технических средств на основе холинэстеразной реакции [1, 2].

Известен комплект для индикации ингибиторов холинэстеразы [1], состоящий из двух- или трехстворчатой подложки, на которой зафиксированы ферментный и субстратный элементы, изолированные друг от друга масками из фольги, а также контейнер с дистиллированной водой (далее по тексту индикаторный билет).

Конструкция индикаторного билета предусматривает расположение вокруг обоих элементов кромки, выступающей над уровнем подложки. Причем диаметры кромок вокруг субстратного и ферментного элементов выбраны в таких размерах, чтобы достигалось совмещение этих элементов при сложении билета пополам. Контейнер с водой размещен под ферментным элементом или на соседней (третьей) створке.

В состав комплекта также входит блок для предохранения от нарушения масок из фольги, изолирующих ферментный и субстратный элементы, а также контейнера с водой в процессе хранения.

Устройство для совмещения ферментного и субстратного элементов выполнено в виде щипцов для колки орехов. Данный комплект принят в качестве аналога предлагаемого технического решения. Аналог [1] имеет ряд недостатков.

Для производства аналога [1] необходима сложная технология, что существенно его удорожает. Не представляется целесообразным размещение контейнера на подложке индикаторного билета по соседству с ферментным элементом, поскольку нарушение целостности контейнера может привести к уменьшению срока хранения фермента и субстрата.

Необходимую для проведения контрольного анализа дистиллированную воду целесообразно хранить отдельно, например в глазной капельнице с герметично завинчивающейся пробкой. Недостатком аналога является и необходимость хранения каждого индикаторного билета в устройстве для совмещения ферментного и субстратного элементов во избежание нарушения ободков вокруг этих элементов, маски из фольги на ферментном элементе, а также контейнера с водой.

Известно техническое средство, названное авторами "биосенсор" [2], состоящее из двух элементов: Ферментного и субстрат-индикаторного. Ферментный элемент, содержащий ацетилхолинэстеразу, изготовлен из хлопковой ткани, модифицированной окислением перекисью водорода в щелочной среде в присутствии хлорида магния. Второй элемент изготовлен из фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором субстрата ацетилтиохолинйодида и реактива на тиольную группу 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) (реактива Эллмана).

Ферментный элемент изготовляют путем погружения полоски из модифицированной хлопковой ткани в буферный раствор ацетилхолинэстеразы (далее по тексту АХЭ) на 30 мин с последующей сушкой его на воздухе. Аналогично, путем погружения фильтровальной бумаги в спиртовый раствор ацетилтиохолинйодида и реактива Эллмана (с последующей сушкой на воздухе при 20^oС) получают субстрат-индикаторный элемент. Анализ зараженности пробы проводят погружением ферментного элемента в анализируемую воду (водный экстракт) на 30 минут, затем вынимают, совмещают с субстрат-индикаторным элементом и визуально наблюдают изменение окраски: в случае желтого окрашивания элемента делают заключение об отсутствии в пробе ингибитора ХЭ, отсутствие желтого окрашивания является критерием наличия в пробе ингибитора ХЭ.

Представленный выше "биосенсор" для определения ингибиторов ХЭ принят нами в качестве ближайшего аналога (далее по тексту прототипа).

Данный прототип имеет ряд недостатков. Как наиболее существенный среди них, следует отметить использование в качестве индикатора на тиольную группу реактива Эллмана, который с тиохолином (продуктом ферментативного гидролиза ацилтиохолинйодида) образует окрашенный в желтый цвет анион, с полосой поглощения в коротковолновом диапазоне видимого спектра (λ_mах:410 нм). Однако анализируемые пробы воды (водных экстрактов) сами могут быть окрашены в желтые и коричневые тона, что может приводить к увеличению погрешности результатов анализа, а подчас и к невозможности его выполнения. Наблюдение желтого окрашивания также может быть затруднено в сумерках и при искусственном освещении.

Другим недостатком прототипа является использование химического способа иммобилизации, который в данном случае предусматривает необходимость использования только высокоактивных, высокой степени очистки препаратов ХЭ, на что указывают сами авторы прототипа. Необходимость использования препаратов ХЭ высокой степени очистки ведет к существенному удорожанию "биосенсора", что усугубляется большим расходом препарата из-за его нанесения методом погружения.

Следует также отметить, что способ получения ферментного элемента путем погружения полосок модифицированной ткани в буферный раствор ХЭ не обеспечивает равномерность иммобилизации ХЭ на поверхности различных полосок из модифицированной ткани, а следовательно, и необходимую воспроизводимость результатов анализа. При использовании указанного способа изготовления субстрат-индикаторного элемента также не обеспечивается равномерность нанесения субстрата и индикатора на его поверхность.

Предлагаемое решение направлено на снижение предела обнаружения анализируемого соединения, погрешности результатов анализа и стоимости анализа.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом комплекте в качестве индикатора на тиольную группу используется индикатор 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль (далее по тексту БАС), продукт взаимодействия которой с тиохолином (продуктом ферментативного гидролиза субстрата карбоксилтиохолинйодида) окрашен в сине-фиолетовый цвет, т.е. имеет полосу поглощения в более длинноволновой области спектра (λ_max:580 нм) и значение мольного коэффициента поглощения ε для λ_max составляет 42000 л•моль^-1•см^-1, что в три раза выше, чем для продукта взаимодействия реактива Эллмана с тиохолином, для которого значение ε для λ_max составляет 13600 л•моль^-1•см^-1. Использование индикатора БАС существенно облегчает визуальную регистрацию аналитического эффекта, а также снижает погрешность результата анализа и предел обнаружения анализируемого соединения.

Для изготовления ферментного элемента использовалась холинэстераза сыворотки крови лошади, как наиболее стабильная и доступная.

В качестве субстрата при изготовлении субстрат-индикаторного элемента использовался бутирилтиохолинйодид, поскольку этот субстрат характеризуется более высокой гидролитической устойчивостью, чем ацетилтиохолинйодид, использовавшийся в прототипе. Преимуществом бутирилтиохолинйодида также является более высокая специфичность к нему холинэстеразы.

Следует отметить, что предлагаемое устройство, основанное на указанных выше реагентах, способно работать как в водной, так и воздушной среде. Принцип же работы предлагаемого устройства на примере экологического контроля водной пробы изложен ниже.

Технический результат также достигается тем, что в предлагаемом комплекте равномерность иммобилизации ХЭ на поверхности элемента достигается путем нанесения буферного раствора ХЭ на ленту из хроматографической бумаги (или ленту из другого пористого материала) в специальном устройстве для пропитки лент (производства КБ Тулаавтоматика), модифицированном путем замены пропиточной ванны открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по различным каналам подаются буферный раствор препарата холинэстеразы и раствор глутарового альдегида (или другого связующего агента); иммобилизация холинэстеразы осуществляется при перемещении ленты из хроматографической бумаги с постоянной скоростью под открытым реактором. (Описание указанного открытого реактора представлено в авторском свидетельстве СССР 1384637, приоритет от 27 августа 1986 года) [3]. В данном случае для подачи в открытый реактор пропиточных растворов использовался двухканальный перистальтический насос. Предложенный способ иммобилизации обеспечивает не только равномерность нанесения ХЭ на поверхность ленты, но и ее несмываемость при погружении в анализируемую пробу воды или водного экстракта.

Изготовление субстрат-индикаторного элемента также проводилось в пропиточном устройстве с открытым реактором по той же технологии с тем лишь отличием, что в открытый реактор подавалась смесь бутирилтиохолинйодида и БАС в органическом растворителе (в частном случае в метиловом спирте).

Из изготовленных указанным выше способом лент вырезали соответствующие ферментный и субстрат-индикаторный элементы.

Для удобства проведения анализа и повышения воспроизводимости его результатов целесообразно введение в состав комплекта прижимного блока для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов. Прижимный блок выполнен из инертного прозрачного материала, например оргстекла, в виде двухстворчатой коробки, на внутренней поверхности нижней створки которой расположены два гнезда, предназначенные для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов. В одном из гнезд проводится анализ пробы, во втором - контрольный анализ с дистиллированной водой для оценки исходной активности иммобилизованной ХЭ в конкретных условиях проведения анализа пробы.

Определение содержания в анализируемой пробе воды (водного экстракта) ингибитора ХЭ проводилось следующим образом:
ферментный элемент погружали в анализируемую воду (водный экстракт) на 10 мин (или наносили 3-4 капли анализируемой пробы на элемент с ХЭ, помещенный в одно из гнезд прижимного устройства). Через 10 мин ферментный элемент вынимали из анализируемой пробы, помещали в гнездо прижимного устройства, затем на ферментный элемент помещали субстрат-индикаторный элемент и через 3 минуты после совмещения элементов наблюдали окраску со стороны ферментного элемента. В случае отсутствия ингибитора в анализируемой пробе наблюдается сине-фиолетовое окрашивание. Отсутствие сине-фиолетового окрашивания ферментного элемента позволяет судить о наличии в анализируемой пробе ингибитора холинэстеразы.

Итак, предложен комплект для определения ингибиторов холинэстеразы в воде и водных экстрактах, состоящий из ферментного элемента с иммобилизованной холинэстеразой и субстрат-индикаторного элемента, импрегнированного субстратом - карбоксилтиохолином и индикатором на тиольную группу, что совпадает с существенными признаками прототипа.

При этом в качестве фермента используется холинэстераза сыворотки крови лошади, в качестве субстрата - бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль.

Кроме того, холинэстераза сыворотки крови лошади, равномерно распределена на ферментном элементе, а бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,3-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль равномерно распределены на субстрат-индикаторном элементе.

Кроме того, иммобилизацию проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по двум каналам раздельно подаются буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и связующего реагента, а импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подаются бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль в органическом растворителе.

Кроме того, в качестве связующего реагента использован глутаровый альдегид.

Кроме того, комплект содержит прижимный блок, который выполнен в виде двухстворчатой коробки, на внутренней поверхности коробки расположены два гнезда с плоским дном, предназначенные для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов, причем, в одном из гнезд проводится анализ пробы, во втором - контрольный анализ с дистиллированной водой для оценки исходной активности иммобилизованной ХЭ.

Далее покажем, что именно совокупность заявленных признаков обеспечивает достижение заявленного технического результата: снижения предела обнаружения анализируемого соединения, погрешности результатов анализа, а также уменьшения стоимости заявленного комплекта для определения ингибиторов холинэстеразы.

То, что в качестве фермента используется холинэстераза сыворотки крови лошади, в качестве субстрата - бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль, снижает стоимость исходного сырья, повышает надежность и точность результатов анализа вследствие более высокой гидролитической устойчивости субстрата и специфичности его реакции с ферментом, а также из-за того что цвет индикаторной окраски смещен в сине-фиолетовую область спектра, поддающуюся более точному визуальному контролю. Благодаря более высокому значению мольного коэффициента поглощения индикатора 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль достигается снижение предела обнаружения анализируемого соединения.

То, что холинэстераза сыворотки крови лошади равномерно распределена на ферментном элементе, а бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,6-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль равномерно распределены на субстрат-индикаторном элементе, способствует снижению погрешности результатов анализа, поскольку при этом снижается ошибка, связанная с неоднородностью цвета визуально контролируемой окрашенной области индикаторного элемента.

То, что иммобилизацию проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по двум каналам раздельно подаются буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и связующего реагента, а импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подаются бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль в органическом растворителе, также повышает точность измерений за счет повышения качества изготовления комплекта с использованием регулярной технологии. При этом также снижается себестоимость изделия за счет увеличения производительности, при одновременном повышении точности измерений за счет повышения равномерности нанесения реагентов на несущие поверхности.

То, что в качестве связующего реагента использован глутаровый альдегид, повышает надежность комплекта, его сохранность, в процессе хранения и использования.

То, что комплект содержит прижимный блок, который выполнен в виде двухстворчатой коробки, на внутренней поверхности коробки расположены два гнезда, предназначенные для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов и их прижима друг к другу, причем, в одном из гнезд проводится анализ пробы, во втором - контрольный анализ с дистиллированной водой для оценки исходной активности иммобилизованной ХЭ в условиях проведения анализа, повышает надежность произведенного анализа, поскольку обеспечивает повторяемость и регулярность производимых манипуляций.

Таким образом, показано, что совокупность существенных признаков предлагаемого решения обеспечивает достижение заявленного технического результата.

Проведенные эксперименты подтвердили работоспособность предложенного изобретения.

Использованные источники
1. WO 85/04424, 10 Oktober 1985, C 12 Q 1/46, С 12 N 11/12, Detector kit for indication of nerve gases and other cholinesterase-ingibitors.

2. WO 94/05808, 17 March 1994, C 12 Q 1/46, C 12 N 11/12, Biosensor for and distinguishing between cholinesterases ingibitors (прототип).

3. Авторское свидетельство СССР 1384637, приоритет от 27 августа 1986 года.

Изобретение относится к области контроля загрязнения окружающей среды, в частности, фосфорорганическими отравляющими веществами, инсектицидами, карбаматами и токсинами сине-зеленых водорослей. Комплект для определения ингибиторов холинэстеразы состоит из холинэстеразы сыворотки крови лошади, субстрата - бутирилтиохолина и индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли. При этом фермент и субстрат с индикатором равномерно распределены соответственно на ферментном и субстрат-индикаторном элементах; иммобилизацию холинэстеразы проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в которой одновременно по двум каналам раздельно подаются буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и раствор глутарового альдегида. Импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подают субстрат в органическом растворителе. Анализ проводят с использованием прижимного блока, который выполнен в виде двухстворчатой коробки. Достигается снижение предела обнаружения анализируемого соединения, погрешности результатов анализа и стоимости анализа. 3 з.п. ф-лы.

1. Комплект для определения ингибиторов холинэстеразы, состоящий из ферментного элемента с иммобилизованной холинэстеразой и субстрат-индикаторного элемента, импрегнированного субстратом - карбоксилтиохолином и индикатором на тиольную группу, отличающийся тем, что а качестве фермента содержит холинэстеразу сыворотки крови лощади, в качестве субстрата - бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо-)-фенилдисульфида тетракалиевую соль. 2. Комплект по п. 1, отличающийся тем, что холинэстераза сыворотки крови лошади равномерно распределена на ферментном элементе, а бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль равномерно распределены на субстрат-индикаторном элементе. 3. Комплект по п. 1, отличающийся тем, что холинэстераза сыворотки крови лошади иммобилизована путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по двум каналам раздельно подают буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и раствор связующего реагента, а импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подают бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевую соль в органическом растворителе. 4. Комплект по п. 3, отличающийся тем, что в качестве связующего реагента используют глутаровый альдегид.