ПОЛИКОМПОНЕНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ И ИММУНОТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/116 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно получению препарата для профилактики и лечения хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами.

Известна ассоциированная вакцина для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащая стафилококковый анатоксин, цитоплазматический антиген стафилококка, выделенный из штамма Staphylococcus aureus Б-243, очищенный концентрированный анатоксин синегнойной палочки, продуцируемый штаммом Pseudomonas aeruginosa PA-7, очищенные антигены из клинических штаммов Proteus mirabilis, полученные методом контролируемого протеолиза, и адъювант - гидроокись алюминия (RU 2035189, А 61 К 39/116, опубл.20.05.95).

Однако известная вакцина предназначена только для профилактики и, кроме того, имеет ограниченную сферу применения, так как не содержит полного спектра антигенов возбудителей, имеющих в настоящее время наибольшее значение в этиологии хронических воспалительных заболеваний.

Наиболее близким аналогом является поликомпонентная вакцина для иммунотерапии и иммунопрофилактики заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащая белково-липополисахаридные антигенные комплексы, выделенные из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и антигены клеточной стенки из штаммов Staphylococcus aureus.

(RU 2083223, А 61 К 39/116,1997)
Технический результат заявленного способа заключается в повышении иммуногенности, протективной активности, стабилизации свойств вакцины, за счет оптимизации способа культивирования и дополнительной очистки.

Для достижения указанного технического результата поликомпонентная вакцина для иммунотерапии и иммунопрофилактики заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащая смесь антигенов, выделенных из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, согласно настоящему изобретению в качестве антигена из Klebsiella pneumoniae содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, и протеогликан с химическим составом: 10,0-20,0% белка, 30,0-40,0% углеводов, с молекулярной массой более 20000 Да, в качестве антигена из Proteus vulgaris - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 40,0-60,0% белка, 25,0-35,0% углеводов, с молекулярной массой более 20000 Да; в качестве антигена из Escherichia coli - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 10,0-20,0% белка, 15,0-30,0% углеводов, с молекулярной массой более 20000 Да, в качестве антигена из Staphylococcus aureus - комплекс антигенов клеточной стенки, содержащий тейхоевую кислоту, пептидогликан и лабильные белки, с химическим составом: 13,0-21,0% белка, 8,0-16,0% углеводов, с молекулярной массой более 20000 Да, при следующем соотношении сконцентрированных и очищенных ультрафильтрацией и диафильтрацией антигенов указанных штаммов соответственно 1:1:1:1,2 г по сухому весу на 1 л вакцины.

Пример осуществления способа.

Для приготовления поликомпонентной вакцины используют следующие штаммы:
1. Klebsiella pneumoniae 204, депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

2. Proteus vulgaris 177, депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

3. Escherichia coli К-100 147 (датская коллекция, Копенгаген).

4. Staphylococcus aureus 1991, 1986, 5, 9 депонированы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Культивирование всех штаммов производят на среде на основе гидролизата казеина. Культивирование штамма Klebsiella pneumoniae предпочтительно на среде Ворфеля-Фергюссона, состоящей из экстракта дрожжей (60±5), сахарозы (20±3) г и солей: натрий хлористый (2±0,5) г, калия сернокислого (1±0,2) г, магния сернокислого (0,25±0,1) г на 1 литр среды. Все штаммы можно выращивать на агаровых средах в матрацах или на жидких в реакторах. Выращивание в реакторах возможно путем глубинного культивирования в течение 14-20 часов при температуре 37^oС, или путем управляемых процессов культивирования (сливно-доливной, непрерывный) на синтетических и полусинтетических средах. Такой средой, например, является среда из солей: КН₂РO₄, K₂HPO₄,(NH₄)₂SO₄, MgSO₄, цитрата натрия и глюкозы.

Выросшие культуры дезинтегрируют добавлением солянокислого гидроксиламина (из расчета 0,05 мг на 1 миллиард микробных клеток) и инкубированием в течение 48±2 ч при температуре 37^oС. После завершения процесса дезинтеграции проводят отделение микробных клеток и их обломков путем проведения процесса микрофильтрации в тангенциальном потоке, или центрифугирования, или сепарирования. Дальнейшую очистку лизатов проводят диализом и/или ультрафильтрацией в режиме диафильтрации. Введение в технологическую цепь приготовления препарата ультрафильтрации обеспечивает большую очистку препаратов от примесей питательной среды и от низкомолекулярных компонентов лизированной микробной клетки. Для компановки вакцины полученные антигены используют сразу после приготовления, или хранят в сухом виде (лиофильно высушенные), или в замороженном состоянии при минус 22-45^oС.

В качестве антигена из Klebsiella pneumoniae вакцина содержит протеогликан с химическим составом: 10,4-12,6% белка, 36,2-40,4% углеводов, 0,36-0,44% кетодезоксиоктоновой кислоты. В качестве антигена из Proteus vulgaris - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 40,0-60,0% белка, 25,0-35,0% углеводов. В качестве антигена из Escherichia coli - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 16,0-20,0% белка, 15,0-30,0% углеводов, в качестве антигена из Staphylococcus aureus - антиген клеточной стенки, содержащий тейхоевую кислоту, пептидогликан и лабильные белки, с химическим составом: 13,0-21,0% белка, 8,0-16,0% углеводов. Антигены указанных штаммов берут соответственно в следующем соотношении 1:1:1:1,2 г на 1 л вакцины. Очистку смеси антигенов осуществляют ультрафильтрацией смеси антигенов. Каждый из антигенов в отдельности и в вакцине характеризуется тем, что при гельфильтрации через сафадекс 200 дает 2 пика, первый пик - высокомолекулярный более 200000 Да, в котором сосредоточена серологическая и иммуногенная активность вакцины, второй пик - низкомолекулярный менее 20000 Да содержит следы серологической активности и неиммуногенен.

После смешивания всех компонентов проводят стерилизующую фильтрацию. Полученный стерильный препарат разливают в асептических условиях в ампулы (флаконы) по 2 мл.

Полученные по указанному способу серии поликомпонентной вакцины тестированы по серологической и антигенной активности. Серологическую активность определяли в реакции торможения гемагглютинации по минимальной тормозящей дозе (МТД) антигенных компонентов вакцины (табл.1).

Антигенную активность определяли по титрам антител у кроликов, вакцинированных сравниваемыми препаратами (табл.2).

Как видно из представленных таблиц, серологическая активность более стандартна в препаратах, приготовленных по предлагаемой технологии. Минимальные тормозящие дозы соответственно в них несколько меньше. Это же относится к антигенной активности. Двукратная иммунизация кроликов обеспечивает значимое нарастание титра антител. У кроликов, вакцинированных вакциной, приготовленной по предлагаемой технологии, титры не дают такого сильного разброса и более высокие.

Указанный способ отличается от заявленного в патенте 2083223 тем, что препараты готовят при выращивании микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах; все антигены, в том числе стафилококковый, готовят единым методом дезинтеграции микробной массы гидроксиламином; для очистки применяют микрофильтрацию, ультрафильтрацию и диафильтрацию.

Введение в процесс получения антигенов мембранных методов разделения упрощает технологию производства препарата, снижает энерго- и трудозатраты, а, самое главное, обеспечивает высокое качество (высокую степень частоты) целевых продуктов за счет эффективного освобождения от балластных примесей питательной среды и низкомолекулярных бактериальных компонентов, не обладающих иммуногенной активностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержит смесь антигенов, выделенных из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus. В качестве антигена из Klebsiella pneumoniae она содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, протеогликан с химическим составом: 10,0-20,0% белка, 30,0-40,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да. В качестве антигена из Proteus vulgaris - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 40,0-60,0% белка, 25,0-35,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да. В качестве антигена из Escherichia coli - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 16,0-20,0% белка, 15,0-30,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да. В качестве антигена из Staphylococcus aureus - антиген клеточной стенки, содержащий тейхоевую кислоту, пептидогликан и лабильные белки с химическим составом: 13,0-21,0% белка, 8,0-16,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да. Антигены указанных штаммов берут соответственно в следующем соотношении 1: 1: 1: 1,2 г по сухому весу на 1 л вакцины. Концентрирование и очистку антигенов проводят ультрафильтрацией и диафильтрацией. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, стабильна. 2 табл.

Поликомпонентная вакцина для иммунотерапии и иммунопрофилактики заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащая смесь антигенов, выделенных из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, отличающаяся тем, что в качестве антигена из Klebsiella pneumoniae она содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, и протеогликан с химическим составом: 10,0-20,0% белка, 30,0-40,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да, в качестве антигена из Proteus vulgaris - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом:40,0-60,0% белка, 25,0-35,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да, в качестве антигена из Escherichia coli - липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 10,0-20,0% белка, 15,0-30,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да, в качестве антигена из Staphylococcus aureus - антигены клеточной стенки, содержащие тейхоевую кислоту, пептидогликан и лабильные белки с химическим составом: 13,0-21,0% белка, 8,0-16,0% углеводов, с мол.м. более 20000 Да, при следующем соотношении сконцентрированных и очищенных ультрафильтрацией и диафильтрацией антигенов указанных штаммов соответственно 1:1:1:1,2 г по сухому весу на 1 л вакцины.