СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИКОМПОНЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/116 A61K39/02 A61K39/85 A61K39/108 

Изобретение относится к области медицины, а именно к вакцинным препаратам.

Цель изобретения создание поликомпонентной вакцины для разных методов введения, в единой форме для повышения эффективности лечения и профилактики обострений хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами.

Проблема хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, является чрезвычайно актуальной для здравоохранения всего мира. Противовоспалительная, антибактериальная и симптоматическая терапия не обеспечивает положительный эффект, что ведет к хронизации процесса. Возникает необходимость в использовании препаратов, воздействующих на иммунологический статус организма.

Для ускорения лечения больных абсцессом легкого известен препарат, состоящий из смеси антигенных компонентов клебсиеллы пневмонии, протея, стафилококка, кишечной палочки К-100, взятых в равных соотношениях.

Недостатком этого способа является слабая эффективность в составе комплекса стафилококкового компонента, введение препарата только подкожным методом, что ограничивает возможность использования его при других широко распространенных воспалительных заболеваниях легких, часто сопровождающихся аллергическим компонентом (хронический обструктивный бронхит, инфекционно-зависимая бронхиальная астма и др.).

Цель изобретения достигается получением поликомпонентной вакцины, состоящей из антигенов стафилококка, протея, кишечной палочки и клебсиеллы пневмонии, обладающей высокой протективной активностью всех входящих в ее состав антигенных комплексов, выпускаемой в единой форме для разных методов введения (подкожный, оральный, комбинированный). Цель достигнута путем прибавления 3 высокоиммуногенных штаммов S. aureus, проведения водной экстракции из смеси микробной массы всех штаммов стафилококка, соединения экстракта с другими антигенами сразу после экстракции, увеличения количества стафилококковых антигенов в вакцине, повышения иммуногенности клебсиеллезного компонента за счет использования среды Ворфель-Фернюссона, экстракции антигенов кишечной палочки воздействием гидроксиламина.

Пример осуществления способа.

Для приготовления поликомпонентной вакцины обобраны следующие штаммы:
1. K. pneumoniae N 204, депонирован в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича.

2. P. vulgaris N 177, депонирован в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича.

3. E. coli К-100 N 147 (датская коллекция, Копенгаген).

4. S. aureus N 1991, 1986, депонированы в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича и N 5 и N 9 (производственные штаммы).

Предварительно получают белково-липополисахаридные комплексы из 3 первых видов микроорганизмов. Для этого производят посев клебсиеллы на 25 матрацев со средой Ворфель-Фергюссона следующего состава:
Натрий хлористый 2±0,1 г
Калий сернокислый 1±0,01 г
Магний сернокислый 0,25±0,01 г
Сахароза 20±0,01 г
Экстракт дрожжей 60±1,0 мл
Агар 30±0,01 г
Вода дистиллированная 940±1 мл
Через 18-24 ч выросшую культуру смывают, стандартизуют до 20 млрд./мл и прибавляют солянокислый гидроксиламин из расчета 0,05 мг на 1 млрд. микробных клеток. Инкубируют 48 ч при 37^oC. Центрифугируют при 6-10 тыс. об/мин, диализуют в течение 2 суток против водопроводной воды и затем высушивают во флаконах. Аналогично поступают со штаммами протея и кишечной палочки, но их выращивают в матрацах на среде из кислотного гидролизата казеина. Лиофильно высушенные антигенные препараты хранят до 2 лет, и они могут быть использованы для нескольких серий поликомпонентной вакцины.

Стафилококковый компонент вакцины готовят непосредственно перед ее компоновкой и высушиванием. Штаммы S. aureus растят в матрацах на среде из гидролизата казеина. Сеют по 7-8 матрацев каждого штамма, инкубируют 16-24 ч при 37^oC. Культуру смывают дистиллированной водой. Густую микробную взвесь стандартизуют до 100-200 млрд./мл и смешивают в равных количествах от всех 4 штаммов стафилококка.

Полученную микробную массу обрабатывают трижды ацетоном. Сухую инактивированную ацетоном микробную массу подвергают трехкратной водной экстракции при соотношении 100 мл воды на 1 г сухих клеток. Центрифугируют, центрифугат используют как водный экстракт, содержащий водорастворимые антигены клеточной стенки стафилококка. Определяют сухой остаток в 1 мл экстракта.

Сухие антигенные комплексы клебсиеллы пневмонии, протея, кишечной палочки смешивают с водным экстрактом стафилококка с таким расчетом, чтобы приготовить смесь, содержащую по 0,6 мг антигенов протея, кишечной палочки, клебсиеллы и 0,8 мг антигенов стафилококка в 1 мл вакцины. Чтобы приготовить 100,0 мл вакцины, следует взять навески сухих антигенов по 60,0 мг. Количество водного экстракта стафилококка определяют по его сухому остатку. Если сухой остаток 2 мг/мл, то следует взять 40,0 мл водного экстракта. Объем смеси доводят до 100,0 мл дистиллированной водой. После этого проводят стерилизующую фильтрацию, разлив по 4 мл в ампулы, лиофильно высушивают и запаивают ампулы под вакуумом. В каждой ампуле содержится (4,5±0,3) мг смеси антигенов. В 1 ампуле содержится 0,9±0,3 мг белка и 0,8±0,3 мг углеводов. Действующими антигенами комплекса являются белково-липополисахаридные комплексы протея, клебсиеллы и кишечной палочки, а также белок, тейхоевая кислота, полисахарид, гликопептид стафилококка.

Полученный указанным способом препарат был подвергнут доклиническому и клиническому изучению. Из представленных в таблицах данных видно, что прибавление штаммов стафилококка и увеличение количества стафилококковых антигенов позволило усилить протективную активность этого компонента вакцины (табл. 1, 2, 3).

Использование среды Ворфель-Фергюссона для культивирования клебсиеллы пневмонии значительно усилило иммуногенность клебсиеллезного компонента (табл. 4). Повышение иммуногенности компонентов вакцины позволило использовать ее для непарентеральных методов введения в сравнительно небольших дозах (табл. 5).

После доклинического изучения переносимость и клиническая эффективность поликомпонентной вакцины были изучены на 26 больных бронхиальной астмой. Полученные результаты свидетельствовали, что вакцина при комбинированной интраназально-подкожной схеме введения хорошо переносится этой категорией больных и обеспечивает значительную эффективность. Эти данные послужили основанием для государственных испытаний препарата, которые проводились в Москве на базе аллергологического центра под руководством академика А.Г. Чучалина и в Санкт-Петербурге во ВНИИ пульмонологии. Суммарные результаты представлены в табл. 6, 7, 8.

Как видно из таблиц, поликомпонентная вакцина, разработанная в единой форме, оказалась эффективной при лечении воспалительных обструктивных заболеваний органов дыхания как при подкожном, так и при комбинированных интраназально-подкожном и интраназально-оральном методах введения. Комитет по медицинским иммунобиологическим препаратам рассмотрел результаты и рекомендовал вакцину для внедрения в практику. Министерство здравоохранения РФ приказом N 270 от 17.11.93 г. разрешило применение поликомпонентной вакцины в практике здравоохранения.

Использование: медицина, поликомпонентная вакцина, заболевания, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами. Сущность изобретения: поликомпонентная вакцина состоит из антигенов клебсиеллы пневмонии, протея, стафилококка и кишечной палочки. Вакцину можно применять подкожным методом, а также комбинированными интраназально-подкожным и интраназельно-оральным методами. Проведение вакцинотерапии с помощью поликомпонентной вакцины обеспечивает снижение частоты и тяжести течения рецидивов, уменьшение объема применяемых лекарственных препаратов (антибиотиков, симпатомиметиков, гормонов), снижает число дней нетрудоспособности, поликомпонентная вакцина обеспечивает хороший эффект у 70-80% больных хроническим бронхитом, инфекционно-зависимой формой бронхиальной астмы. 8 табл.

Способ получения поликомпонентной вакцины для иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, включающий раздельное культивирование штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris ГИСК N 177, Escherichia coli K-100 N 147 и Staphylococcus aureus ГИСК N 1991 с последующим экстрагированием протективных антигенов и их смешиванием, отличающийся тем, что из клебсиелл используют штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК N 204 и культивируют его на среде Ворфель-Фергюссона, из стафилококков дополнительно используют штамм Staphylococcus aureus ГИСК N 1981 и производственные штаммы Staphylococcus aureus N 5, Staphylococcus aureus N 9, при этом экстракцию антигенов из клеток клебсиелл протел и кишечной палочки проводят гидроксиламином, а из клеток стафилококка водной экстракцией и полученные антигены смешивают в соотношении 0,6, 0,6, 0,6 и 0,8 мг соответственно на 1 мл дистиллированной воды.