Способ получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/00 A61K39/116 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно получению препарата на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов.

Уровень техники

Известна ассоциированная вакцина для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащая стафилококковый анатоксин, цитоплазматический антиген стафилококка, выделенный из штамма Staphylococcus aureus Б-243, очищенный концентрированный анатоксин синегнойной палочки, продуцируемый штаммом Pseudomonas aeruginosa РА-7, очищенные антигены из клинических штаммов Proteus mirabilis, полученные методом контролируемого протеолиза, и адъювант - гидроокись алюминия (RU 2035189, А61К 39/116, опубл.20.05.95). Однако известная вакцина предназначена только для профилактики и, кроме того, имеет ограниченную сферу применения, так как не содержит полного спектра антигенов возбудителей, имеющих в настоящее время наибольшее значение в этиологии хронических воспалительных заболеваний.

Также из уровня техники известна поликомпонентная вакцина для иммунотерапии и иммунопрофилактики заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащая белково-липополисахаридные антигенные комплексы, выделенные из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и антигены клеточной стенки из штаммов Staphylococcus aureus (RU 2083223, А 61 К 39/116,1997).

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ получения поликомпонентной вакцины для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, описанный в патенте RU 2209081. Способ заключается в том, что проводят культивирование штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus на среде на основе гидролизата казеина, культивирование штамма Klebsiella pneumoniae предпочтительно на среде Ворфеля-Фергюссона, состоящей из экстракта дрожжей (60±5), сахарозы (20±3) г и солей: натрий хлористый (2±0,5) г, калия сернокислого (1±0,2) г, магния сернокислого (0,25±0,1) г на 1 литр среды. Все штаммы можно выращивать на агаровых средах в матрацах или на жидких в реакторах. Выращивание в реакторах возможно путем глубинного культивирования в течение 14-20 часов при температуре 37°С, или путем управляемых процессов культивирования. Выросшие культуры дезинтегрируют добавлением солянокислого гидроксиламина (из расчета 0,05 мг на 1 миллиард микробных клеток) и инкубированием в течение 48±2 ч при температуре 37°С. После завершения процесса дезинтеграции проводят отделение микробных клеток и их обломков путем проведения процесса микрофильтрации. Дальнейшую очистку лизатов проводят диализом и/или ультрафильтрацией в режиме диафильтрации. Антигены указанных штаммов лиофильно высушивают и берут в соотношении 1: 1: 1: 1,2 г по сухому весу на 1 л вакцины.

Недостатки указанного способа состоят в том, что способ предусматривает использование для культивирования жидких и твердых питательных сред различного состава, детоксикацию всех культур добавлением солянокислого гидроксиламина при температуре 37°С в течение 48±2 часов, лиофильное высушивание смешанных антигенов без добавления стабилизатора.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных эффективному освобождению антигенсодержащей жидкости от микроорганизмов, позволяющего получить поликомпонентную вакцину из антигенов с более высокой специфической активностью.

Для решения этой задачи мы предлагаем способ получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов, включающий культивирование штаммов P. vulgaris, Е. coli и S. aureus и К. pneumoniae, причем для выращивания штаммов P. vulgaris, Е. coli и S. aureus используют универсальную жидкую питательную среду следующего состава:

Панкреатический гидролизат казеина 40 г/л Дрожжевой экстракт 3 г/л, Глюкоза 3 г/л NaH₂PO₄ 0,068 г/л Na₂HPO₄ 0,1 г/л (NH₄)₂SO₄ 1 г/л MgSO₄ 0,18 г/л CH₃C00Na 6,6 г/л;

для культивирования К. pneumoniae используют полусинтетическую среду, включающую

Дрожжевой экстракт 3 г/л Глюкоза 5 г/л

и соли:

КН₂РO₄ 3 г/л К₂НРO₄ г/л MgSO₄ 0,1 г/л CH₃C00Na 1 г/л;

при этом на стадии лиофильного высушивания препарата в качестве стабилизатора используют лактозу.

Технический результат заявленного способа заключается в снижении длительности реакторного культивирования за счет использования для микроорганизмов модифицированных питательных сред, в совершенствовании метода очистки антигенов, входящих в состав препарата за счет уменьшения примесей питательной среды в процессе отмывки культур перед проведением процесса инактивации и дезинтеграции, что позволяет увеличить активность антигенов и вакцины.

Проведение микрофильтрации в процессе очистки способствует быстрому и эффективному освобождению антигенсодержащей жидкости от убитых и неразрушенных микробных клеток.

Осуществление отмывки культур перед проведением процесса обезвреживания и дезинтеграции солянокислым гидроксиламином позволяет избежать образования комплексных соединений гидроксиламина с компонентами питательной среды.

В качестве стабилизатора выбрана лактоза, которую следует добавлять после сведения антигенов из расчета 50 г/л вакцины. Добавление стабилизатора улучшает потребительские свойства препарата, не изменяя специфическую активность

Краткое описание поясняющих материалов

Табл. 1 - Антигенная активность компонентов вакцины.

Осуществление способа.

Культивирование P. vulgaris, Е. coli, или К. pneumoniae проводят методом глубинного выращивания в реакторе в течение 9±2 ч, по завершении процесса культивирования клеточные элементы отмывают от остатков питательной среды микрофильтрацией в тангенциальном потоке дистиллированной воды или центрифугированием с ускорением 5000g в течение 20 мин при температуре 4°С, после чего доводят концентрацию Р. vulgaris, Е. coli, или К. pneumoniae до 20×10⁹ микробных клеток в мл стерильной дистилированной водой и разрушают путем добавления солянокислого гидроксиламина и инкубирования в течение 48±2 ч при температуре 48±1С для P. vulgaris и К. pneumoniae или 57±1С для Е. coli.

Отделение микробных клеток P. vulgaris, Е. coli, К. pneumoniae и их обломков после дезинтеграции осуществляют микрофильтрацией в тангенциальном потоке, или центрифугирования с теми же параметрами.

Очистку лизатов от гидроксиламина проводят ультрафильтрацией в режиме диафильтрации дистиллированной водой с использованием мембраны с диаметром пор 10 кДа. Очищенные антигены лиофильно высушивают и хранят до использования.

Культивирование S. aureus проводят методом глубинного выращивания в реакторе в течение 9±2 ч, по завершении процесса культивирования клеточные элементы отмывают от остатков питательной среды микрофильтрацией в тангенциальном потоке дистиллированной воды или центрифугированием с ускорением 5000g в течение 20 мин при температуре 4°С. Концентрацию микробных клеток после центрифугирования S. aureus доводят до не менее 150×10⁹ в мл в дистилированной воде и разрушают трехкратной обработкой тремя объемами ацетона, после чего сливают надосадочную жидкость, а микробный осадок высушивают на воздухе. Сухую микробную массу подвергают трехкратной водной экстракции при соотношении 100 мл воды на 1 г сухих клеток, после чего отделяют микробные клетки и их обломки путем проведения процесса микрофильтрации в тангенциальном потоке. Определяют объем и сухой остаток водного экстракта.

Сведение антигенов осуществляют в соотношении антиген P. vulgaris: антиген Е. coli: антиген S. aureus: антиген К. pneumonia - 1:1:1:1,2 по массе и добавляют стабилизатор - лактозу, затем проводят лиофильное высушивание препарата во флаконах.

Пример 1. Получение поликомпонентной вакцины

Для приготовления поликомпонентной вакцины используют следующие штаммы:

1. Klebsiella pneumoniae 204, депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

2. Proteus vulgaris 177, депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

3. Escherichia coli 147 (датская коллекция, Копенгаген).

4. Staphylococcus aureus 1991, 1986, 5, 9 депонированы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Для штаммов P. vulgaris, Е. coli и S. aureus используют универсальную жидкую питательную среду следующего состава: панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкоза и соли: NaH₂PO₄ - 40 г/л, Na₂HPO₄ - 0,1 г/л (NH₄)₂SO₄ - 1 г/л MgSO₄ - 0,18 г/л CH₃COONa - 6,6 г/л; для К pneumoniae - полусинтетическую среду, включающую дрожжевой экстракт, глюкозу и соли (КН₂РO₄ - 3 г/л, К₂НРO₄ - 7 г/л, MgSO₄ - 0,1 г/л, CH₃C00Na - 1 г/л). Культивирование проводят методом глубинного выращивания в реакторе в течение 9±2 ч при температуре 37°С. Культивирование указанных штаммов останавливают по достижению стационарной фазы роста, полученную биомассу сливают и отмывают от остатков питательной среды микрофильтрацией в тангенциальном потоке при рабочем давлении не более 2 Ваr, добавляя до 10 объемов дистиллированной воды или центрифугированием 5000 g в течение 20 мин при температуре 4°С.

Для получения антигенов Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и Proteus vulgaris отмытые микробные клетки соответствующего штамма разводят дистиллированной водой до концентрации 20×10⁹ клеток в 1 мл. Полученную суспензию микробных клеток инактивируют и дезинтегрируют добавлением солянокислого гидроксиламина (из расчета 0,05 мг на 1 миллиард микробных клеток) и инкубированием в течение 48±2 ч при температуре 48±1С для К. pneumoniae и P. vulgaris, и 57±1С для Е. coli. После завершения процесса дезинтеграции проводят отделение микробных клеток и их обломков путем проведения процесса микрофильтрации в тангенциальном потоке, или центрифугирования с теми же параметрами. Очистку лизатов от гидроксиламина проводят ультрафильтрацией в режиме диафильтрации дистиллированной водой с диаметром пор 10 кДа. Очищенные антигены лиофильно высушивают и хранят до использования.

Для получения антигенов из используемых штаммов Staphylococcus aureus отмытые микробные клетки доводят в дистиллированной воде до концентрации 150×10⁹ в 1 мл. Полученную суспензию обрабатывают тремя объемами ацетона и инкубируют по 12-18 ч. Затем ацетон декантируют и заливают свежую порцию ацетона. Смену ацетона проводят 3 раза. Последнюю порцию ацетона декантируют, бактериальные клетки осаждают центрифугированием с ускорением 5000 g в течение 20 мин, при температуре 4±2°С, полученный осадок переносят в эмалированный лоток и высушивают под тягой, периодически перемешивая и разминая шпателем до полного высыхания.

Стафилококковый компонент вакцины получают путем смешивания в равном весовом соотношении сухих антигенов из штаммов S. aureus 1991, 1986, 5, 9. Сухую микробную массу S.aureus подвергают трехкратной водной экстракции при соотношении 100 мл воды на 1 г сухих клеток, после чего отделяют микробные клетки и их обломки путем проведения процесса микрофильтрации в тангенциальном потоке. Определяют объем и сухой остаток водного экстракта.

Компоненты вакцины - антигены используемых штаммов (P. vulgaris, Е. coli, К. pneumoniae, S. aureus) берут соответственно в следующем соотношении 1:1:1:1,2 г на 1 л вакцины, растворяют в стерильной дистиллированной воде, добавляют стабилизатор - лактозу, проводят префильтрацию и стерилизующую фильтрацию на мембранах с размером пор 0,8 и 0,22 мкм.

Полученный стерильный препарат разливают в асептических условиях в ампулы (флаконы) по 2 мл.

Пример 2. Антигенная активность компонентов вакцины в сравнении с прототипом

Антигенную активность определяют в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) по минимальной тормозящей дозе (МТД) препарата, которая должна составлять не более 1,25 мкг для клебсиеллезного и протейного компонентов, не более 5,0 мкг для эшерихиозного компонента и не более 12,5 мкг для стафилококкового компонента, в отношении 2 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) гипериммунной сыворотки. Для каждого компонента препарата предварительно определяют 2 ГАЕ, соответствующие предпоследнему разведению специфической сыворотки, дающей агглютинацию с монодиагностикумами в реакции пассивной гемагглютинации не менее чем на три креста (+++).

Во флакон с исследуемой серией препарата или препарата прототипа прибавляют 1 мл раствора NaCl 0,9%. При этом в 1 мл получают концентрацию препарата 4 мг - по 1 мг/мл каждого компонента (клебсиеллезного, протейного, эшерихиозного, стафилококкового). Разводят полученный раствор в 10 раз (0,2 мл препарата добавляют к 1,8 мл раствора натрия хлорида), что будет соответствовать 0,4 мг/мл, (по 0,1 мг/мл каждого компонента). Раствор, содержащий 0,4 мг препарата в 1 мл, используют для определения активности клебсиеллезного, протейного и эшерихиозного компонентов, а раствор, содержащий 4 мг в 1 мл - для определения активности стафилококкового компонента.

В планшет вносят по 50 мкл раствора NaCl 0,9% со 2 по 12 лунки.

- Исследуемую серию препарата в концентрации 0,4 мг/мл прибавляют по 50 мкл в 1 и 2 лунки 1, 2 и 3 рядов планшета.

- Исследуемую серию в концентрации 4 мг/мл прибавляют в 1 и 2 лунки 4 ряда планшета.

- Начиная со 2 лунки каждого ряда раститровывают до 12 лунки. Из 12 лунки, после перемешивания содержимого, 50 мкл удаляют.

- В 1-3 ряды лунок прибавляют по 50 мкл 2 ГАЕ СОП-1, в 4 ряд лунок - 2 ГАЕ СОП-2. Перемешивают содержимое лунок путем встряхивания и помещают в термостат с температурой (37±1)°С на (35±5) мин.

- Во все лунки 1-4 рядов прибавляют по 25 мкл, соответственно, клебсиеллезного, протейного, эшерихиозного и стафилококкового диагностикумов. Перемешивают содержимое лунок путем встряхивания и оставляют при комнатной температуре до утра следующего дня. Определение МТД проводится с 1 лунки 1-4 рядов.

Для клебсиеллезного, протейного и эшерихиозного компонентов препаратов прототипа и заявленного абсолютное количество каждого из указанных компонентов в 1 лунке составляет 5 мкг, для стафилококкового - 50 мкг. В каждой последующей лунке количество соответствующего антигена уменьшается вдвое по сравнению с предыдущей. Полученные по указанному способу серии поликомпонентной вакцины тестированы по антигенной активности, которую определяли в реакции торможения гемагглютинации по минимальной тормозящей дозе (МТД) антигенных компонентов вакцины, (таблица 1).

За 1 минимальную тормозящую дозу (МТД) принимается наименьшее количество антигена в мкг, при котором отмечается торможение РПГА не более чем на один крест «+». Контроль антигенных монодиагностикумов с 0,9% раствором натрия хлорида должен быть отрицательным «-».

К заявке «Способ получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов»

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно получению препарата на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов. Описан способ получения поликомпонентной вакцины для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, содержащей смесь антигенов, выделенных из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, отличающийся использованием для культивирования всех микроорганизмов модифицированных питательных сред, осуществлением отмывки культур перед проведением процесса обезвреживания и дезинтеграции солянокислым гидроксиламином, использованием лактозы при лиофильном высушивании комплексного препарата. При этом для выращивания штаммов P. vulgaris, Е. coli и S. aureus используют универсальную жидкую питательную среду следующего состава: панкреатический гидролизат казеина - 40 г/л; дрожжевой экстракт - 3 г/л; глюкоза - 3 г/л; NaH₂PO₄ - 0,068 г/л; Na₂HPO₄ - 0,1 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 1 г/л; MgSO₄ - 0,18 г/л; CH₃COONa - 6,6 г/л, для культивирования К. pneumoniae используют полусинтетическую среду, включающую: дрожжевой экстракт - 3 г/л; глюкозу - 5 г/л и соли: KH₂PO₄ - 3 г/л; K₂HPO₄ - 7 г/л; MgSO₄ - 0,1 г/л; CH₃COONa - 1 г/л. Способ позволяет получить поликомпонентную вакцину из антигенов с высокой специфической активностью. 1 табл., 2 пр.

Способ получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов, включающий культивирование штаммов P. vulgaris, Е. coli и S. aureus и К. pneumoniae, причем для выращивания штаммов P. vulgaris, Е. coli и S. aureus используют универсальную жидкую питательную среду следующего состава:

Панкреатический гидролизат казеина 40 г/л Дрожжевой экстракт 3 г/л Глюкоза 3 г/л NaH₂PO₄ 0,068 г/л Na₂HPO₄ 0,1 г/л (NH₄)₂SO₄ 1 г/л MgSO₄ 0,18 г/л CH₃COONa 6,6 г/л,

для культивирования К. pneumoniae используют полусинтетическую среду, включающую

Дрожжевой экстракт 3 г/л Глюкозу 5 г/л

и соли:

KH₂PO₄ 3 г/л K₂HPO₄ 7 г/л MgSO₄ 0,1 г/л CH₃COONa 1 г/л,

при этом на стадии лиофильного высушивания препарата в качестве стабилизатора используют лактозу.