СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ Corynebacterium diphtheriae, СОДЕРЖАЩИХ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ГЕН ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА ОТ Corynebacterium diphiphtheriae, СОДЕРЖАЩИХ ФУНКЦИОНАЛЬНО НЕАКТИВНЫЙ ГЕН ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Основная задача лабораторной диагностики дифтерийной инфекции - определение наличия в исследуемом материале микроорганизмов, которые являются возбудителями заболевания, то есть Corynebacterium diphtheriae, вырабатывающих дифтерийный токсин. Для этой цели используется бактериологический метод, основанный на выделении, идентификации данного микроорганизма и оценке его способности к продукции дифтерийного токсина. Бактериологическое заключение об обнаружении токсинообразующих коринебактерий дифтерии может быть получено через 3-4 суток от начала исследования. Однако при дифтерийной инфекции эффективность лечения в значительной степени зависит от сроков начала противодифтерийной антитоксической терапии, поэтому проблема разработки ускоренных методов лабораторной диагностики дифтерии является актуальной (1).

В последние годы были разработаны молекулярно-биологические технологии амплификации ДНК, и было предложено использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) при лабораторной диагностике дифтерийной инфекции. Сущность ПЦР заключается в детекции микроорганизма по обнаружению в исследуемом материале специфической для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности ДНК. Большинство исследований было посвящено разработке методики ПЦР для определения гена дифтерийного токсина (tox-гена).

Известен способ определения Corynebacterium diphtheriae по tox-гену, предусматривающий выделение ДНК из штамма C.diphtheriae или из клинического материала, постановку ПЦР с праймерами Tox1 (5'-ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCA-3') и Тох2 (5'-GAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA-3') и учет результатов по выявлению, с помощью электрофореза в агарозном геле, ампликонов фрагмента гена дифтерийного токсина размером 248 пар оснований (2).

Недостатком данного способа определения возбудителя дифтерии по tox-гену является его неточность, так как положительный сигнал ПЦР может свидетельствовать об обнаружении как возбудителя заболевания, то есть C.diphtheriae, образующих токсин, так и C.diphtheriae, обладающих tox-геном, но не вырабатывающих дифтерийного токсина и, следовательно, не являющихся возбудителем дифтерийной инфекции. Штаммы C.diphtheriae, содержащие tox-ген, но не вырабатывающие дифтерийного токсина, получили широкое распространение в России в последние годы (3).

Таким образом, из уровня техники до настоящего времени не известен дифференцированный подход к определению Corynebacterium diphtheriae, содержащих активный или неактивный ген дифтерийного токсина.

Задачей настоящего изобретения является разработка точной и ускоренной лабораторной диагностики дифтерии.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ дифференциации Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально активный ген дифтерийного токсина от Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально неактивный ген дифтерийного токсина, который предусматривает выделение ДНК из штамма C.diphtheriae или из клинического материала, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров 5'-GTCAAAGTGACGTATCCAGGA-3' и 5'-CACGGGTTTCAAAATTAATCTC-3', получение ампликонов фрагмента гена дифтерийного токсина (Последовательность 1), рестрикцию данных ампликонов эндонуклеазой BsmFI, затем осуществляют электрофорез продуктов рестрикции в агарозном геле, после чего проводят дифференциацию путем сравнения размера ампликонов гена дифтерийного токсина исследуемого образца с двумя контрольными образцами, содержащими ампликоны функционально активного и неактивного гена дифтерийного токсина.

При определении нуклеотидной последовательности гена дифтерийного токсина у C.diphtheriae, обладающих функционально неактивным tox-геном, помимо мутации, приводящей к сдвигу рамки считывания и блокированию экспрессии tox-гена, в положении 432 была выявлена мутация - замена нуклеотида (аденин на гуанин), создающая сайт рестрикции для фермента-эндонуклеазы BsmFI, способного расщеплять в данном месте молекулу ДНК. У C.diphtheriae, обладающих функционально активным tox-геном, не было выявлено замены нуклеотидов, создающих сайт рестрикции для данной эндонуклеазы. Обнаружение этого факта явилось основанием для использования фермента эндонуклеазы BsmFI с целью дифференциации C. diphtheriae, вырабатывающих дифтерийный токсин, от C.diphtheriae, которые обладают tox-геном, но не способны вырабатывать токсин. Для постановки ПЦР были использованы праймеры 5'-GTCAAAGTGACGTATCCAGGA-3' и 5'-CACGGGTTTCAAAATTAATCTC-3', которые фланкируют участок tox-гена размером 270 п. о. , несущий мутацию (Последовательность 1). Данные праймеры использовались ранее для изучения строения tox-гена (4). Продукт ПЦР был подвергнут рестрикции эндонуклеазой BsmFI с последующим электрофоретическим разделением образовавшихся продуктов. При обработке эндонуклеазой ПЦР-ампликонов, полученных на матрице tox-гена токсинообразующих штаммов, молекулярный вес продуктов ПЦР не изменяется и составляет 270 п.о. Обработка эндонуклеазой ампликонов функционально неактивного tox-гена приводит к рестрикции последних с образованием фрагментов с приблизительно равным молекулярным весом - около 130 пар оснований (п.о.). Таким образом, при электрофоретическом разделении продуктов рестрикции ампликонов tox-гена токсинообразующих штаммов результат выявляется в виде полосы, расположенной в области 270 п.о. , а при использовании ампликонов функционально не активного tox-гена - в виде полосы в области, соответствующей 130 п.о. Молекулярный вес ампликонов исследуемой культуры должен соответствовать молекулярному весу ампликонов одного из двух контрольных образцов: ДНК токсинообразующих C.diphtheriae или C.diphtheriae, несущих tox-ген, но не образующих токсина.

Апробация данного способа была проведена с использованием 30 выделенных в 1996-2000 г. г. на различных территориях России штаммов C.diphtheriae, обладающих tox-геном, но не образующих дифтерийного токсина, и 45 токсинообразующих штаммов C.diphtheriae биовариантов gravis и mitis, распространенных в России и в мире в 1940-х - 1990-х г.г., 5 токсинообразующих штаммов Corynebacterium ulcerans, а также 20 образцов клинического материала, содержащего токсигенные или нетоксигеннные tox-несущие C.diphtheriae.

В результате удалось обнаружить рестрикцию ПЦР-ампликонов tox-гена у всех 30 штаммов, обладающих функционально неактивным tox-геном, и 8 образцов клинического материала, содержащего нетоксигеннные tox-несущие C.diphtheriae. Вместе с тем, не установлено рестрикции ампликонов, полученных на матрице tox-гена 50 токсинообразующих штаммов C.diphtheriae, C.ulcerans и 12 клинических образцов, содержащих токсинообразующие C.diphtheriae.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что использование способа дифференциации между токсинообразующими штаммами C.diphtheriae и штаммами, обладающими tox-геном, но не образующими дифтерийного токсина, основанного на использовании феномена эндонуклеазной рестрикции, позволяет решить проблему специфичности ПЦР, что делает возможным использование данного способа лабораторной диагностики дифтерийной инфекции в практике.

Техническим результатом заявленного изобретения является более точная и ускоренная диагностика дифтерии, которая приводит к снижению распространенности заболевания, числа осложнений и смертности от дифтерии, а также исключению случаев необоснованного лечения от дифтерии пациентов с заболеваниями недифтерийной этиологии.

У штаммов, обладающих функционально неактивным tox-геном, в положении 432 имеется замена основания а (аденин) на g (гуанин).

Пример.

С целью лабораторной диагностики дифтерии у больного тампоном собирали материал из ротоглотки и производили посев на кровяной теллуритовый агар. Через сутки, после появления роста изолированных колоний, отбирали 1 колонию, переносили в пробирку с 1 мл дистиллированной воды, выдерживали 15 мин при 95^oС, центрифугировали при 14000 оборотов 1 мин, 1 мкл супернатанта добавляли к 49 мкл реакционной смеси. ПЦР выполняли с использованием AmpliTaq полимеразы ("Perkin Elmer"), в соответствии с инструкцией производителя. Использовали по 1 мкл (100 мкмоль) каждого из праймеров 5'-GTCAAA-GTGACGTATCCAGGA-3' и 5'-CACGGGTTTCAAAATTAATCTC-3'.

Условия постановки ПЦР: 95^oС - 2 мин, 35 циклов - 95^oС - 30 с, 55^oС - 30 с, 72^oС - 1 мин, затем 72^oС - 10 мин. Полученные в ПЦР ампликоны подвергали рестрикции эндонуклеазой BsmF I в течение 0,5 часа при 65^oС, а затем - электрофорезу в 1,5% агарозном геле при 150 V в течение 1 часа. Гель окрашивали стандартным раствором этидия бромида, и результат реакции учитывали с помощью ультрафиолетового трансиллюминатора.

Молекулярный вес ампликонов после рестрикции не изменился и соответствовал таковому контрольного токсинообразующего штамма. Это свидетельствует о том, что исследуемая культура обладает функционально активным tox-геном и является возбудителем дифтерии. Результат исследования - выявлены токсинообразующие коринебактерии дифтерии.

Литература
1. Мазурова И.К. и др., Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания МЗ РФ, М., 1998 г.

2. Pallen M.J. et al., Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin. Journal of Clinical Pathology, 1994, Vol. 47, p.353-356.

3. И.К. Мазурова и др. Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, Материалы конф. "Проблемы инфекционных болезней", посв. 140-летию Г.Н. Габричевского. М., 2000, стр.52-55.

4. Nakao H. et al. Heterogeneity of diphthria toxin gene, tox, and its regulatory element, dtxR, in Corynebacterium diphtheriae strains causing epidemic diphtheria in Russia and Ukraine, Journal of Clinical Microbiology, 1996; Vol.34, p.1711-1716.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа дифференциации Corynebacteriunm diphtheriae, содержащих функционально активный ген дифтерийного токсина от Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально неактивный ген дифтерийного токсина. Указанный способ предусматривает выделение ДНК из штамма C.diphtheriae или из клинического материала, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров 5'-GTCAAAGTGACGTATCCAGGA-3' и 5'-CACGGGTTTCAAAATTAATCTC-3', получение ампликонов фрагмента гена дифтерийного токсина (Последовательность 1), рестрикцию данных ампликонов эндонуклеазой BsmFI, затем осуществляют электрофорез продуктов рестрикции в агарозном геле, после чего проводят дифференциацию путем сравнения размера ампликонов гена дифтерийного токсина исследуемого образца с двумя контрольными образцами, содержащими ампликоны функционально активного и неактивного гена дифтерийного токсина. Преимущество изобретения заключается в ускорении и повышении точности способа.

Способ дифференциации Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально активный ген дифтерийного токсина от Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально неактивный ген дифтерийного токсина, предусматривает выделение ДНК из штамма С. diphtheriae или из клинического материала, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров 5'-GTCAAAGTGACGTATCCAGGA-3' и 5'-CACGGGTTTCAAAATTAATCTC-3', получение ампликонов фрагмента гена дифтерийного токсина (Последовательность 1), рестрикцию данных ампликонов эндонуклеазой BsmFI, затем осуществляют электрофорез продуктов рестрикции в агарозном геле, после чего проводят дифференциацию путем сравнения размера ампликонов гена дифтерийного токсина исследуемого образца с двумя контрольными образцами, содержащими ампликоны функционально активного и неактивного гена дифтерийного токсина.