ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI-ПРОДУЦЕНТ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ДНК-ЗОНДА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ И НЕТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIDE И КОМПЛЕМЕНТАРНОГО TOX B ГЕНУ, ОПРЕДЕЛЯЮЩЕМУ СИНТЕЗ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА Российский патент 1996 года по МПК C12N1/21 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии.

Известно, что при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний применяется метод ДНК-ДНК гибридизации, заключающийся в определении в исследуемом материале специфических последовательностей нуклеиновых кислот с помощью комплементарных этим последовательностям ДНК зондов (11). Метод ДНК-ДНК гибридизации со специфическими ДНК зондами сокращает время идентификации требовательных микроорганизмов, позволяет обнаруживать патогенные микроорганизмы непосредственно в клиническом материале и снижает себестоимость лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. В зарубежной литературе имеются сведения об использовании нативных и химерных молекул ДНК или их Фрагментов, часть которого представляет специфическую для tох⁺ гена дифтерийного токсина последовательность оснований, в качестве ДНК зондов при научных исследованиях (9, 10). В нашей стране при конструировании штаммов продуцентов иммунотоксинов были созданы химерные репликоны, которые были использованы или могли быть использованы как ДНК зонды при идентификации токсигенных штаммов С.diphtheriae (4, 5, 3). Однако, редкие примеры использования химерных репликонов, несущих специфические последовательности гена дифтерийного токсина, в качестве ДНК зондов также не выходили за рамки научных исследований в основном была показа принципиальная возможность использования метода ДНК-ДНК гибридизации для выявления токсигенных штаммов C.diphtheriae (1, 2). Во всех известных случаях применения нативных и химерных молекул как ДНК зондов не были определены специфические параметры (чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов) специализированного метода ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов С.diphtheriae, что не позволяло широко использовать этот метод, а следовательно, не или иные ДНК зонды, при диагностических исследованиях.

Цель изобретения штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pSS6 toxB')-продуцент специфического ДНК зонда.

Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pSS6 toxB') депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов. Регистрационный номер 229.

Получение штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pSS6 toxB') получен в результате Ca²⁺-зависимой трансформации бактериальных клеток штамма Escherichia coli C₆₀₀ thr1 leu6 thi1 supE44 LacY1 tonA r^-m^- λ^- F^- изолированной ДНК плазмиды pSS6 toxB' по незначительно модифицированному методу Mandel и Higa (8). Селекция трансформантов проведена по устойчивости к ампициллину на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг-мл ампициллина; очистка трансфоpмантов - три последовательных субкультивирования на той же среде. Плазмида, выделенная из устойчивых к ампициллину трансформантов, имела ту же электрофоретическую подвижность, что и исходная плазмида, тот же электрофоретический рисунок при электрофорезе в агарозном геле Hind/Kpn1 рестриктов и давала положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма С.diphtheriae 665.

Характеристика штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pSS6 toxB') имеет следующие характеристики. Штамм растет на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Штамм растет на минимальной питательной среде, содержащей 10 мкг/мл треонина, 10 мкг/мл лейцина, 1 мкг/мл тиамина и 50 мкг/мл ампициллина. Штамм не ферментирует лактозу. Штамм обеспечивает стабильность молекулы химерного репликона плазмиды pSS6 toxB', высокий выход плазмидной ДНК при выделении ее методом щелочного лизиса и возможность использования изолированной плазмидной ДНК при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического ДНК зонда и при Ca²⁺ зависимой трансформации без дополнительной очистки в градиенте хлористого цезия бромистого этидия. Плазмида pSS6 toxB' стабильна в штамме Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pSS6 toxB') при культивировании его на средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, и элиминируется из бактериальных клеток этого штамма при культивировании его на средах, не содержащих ампициллин. На плазмиде pSS6 toxB' локализован ген устойчивости к ампициллину. Рестриктазы Hind III и KrnI расщепляют плазмиду pSS6 toxB' на два фрагмента, меньший из которых в основном представляет специфическую последовательность структурного toxB' гена дифтерийного токсина. Тотальный препарат ДНК штамма Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pSS6 toxB'), плазмидная ДНК и меньший по размеpам Hind III/KpnI фрагмент плазмидной ДНК дают положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C.diphtheriae 665.

При выделении ДНК плазмиды pSS6 toxB'-специфического ДНК зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pSS6 toxB') выращивают в полноценной жидкой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37^oС в течение 18 20 ч. Бактериальные клетки осаждают и отмывают центрифугированием; плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой неочищенного препарата плазмидной ДНК хлористым литием (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 25 мкг/мл), протеиназой Т (конечная концентрация 1 мг/мл), депротеинизацией фенолом, смесью фенол-хлороформ и хлороформ [6] Выделенную плазмидную ДНК фрагментируют рестриктазами Hind III и KpnI в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя фермента и тотальный препарат презмидной ДНК метят радиоактивной меткой методом рассеянной затравки с целью получения специфического радиоактивного ДНК зонда [7]
Параметры (чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов), позволяющие использовать при диагностических исследованиях специализированный метод ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов С.diptheriae, при которых меченные радиоактивным изотопом препараты ДНК плазмиды pSS6 toxB', Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- применяются как специфический радиоактивный ДНК зонд, были установлены при сравнительной оценке настоящего метода ДНК-ДНК гибридизации и традиционного метода выявления токсигенных штаммов реакции преципитации в агаре. Обоими методами были изучены 134 токсигенных и 125 нетоксигенных штаммов С.diphtheriae выделенных на территории России, преимущественно во Владимирской и Пензенской областях, за период с 1986 по 1989 г. При проведении ДНК-ДНК гибридизации бактериальные клетки изучаемых штаммов лизировали лизоцимом (конечная концентрация 2 мг/мл) и додецилсульфатом натрия (конечная концентрация 1). Лизаты бактериальных клеток последовательно обрабатывали протеиназой Т (конечная концентрация 0,3 М), ДНК переосаждали этиловым спиртом [6] Пробы наносили на нейлоновый мембранный фильтр и авторадиографию проводили по модифицированному методу Бобкова с соавторами [2] Было показано, что при замене в традиционной технологии бактериологического анализа метода преципитации в агаре методом ДНК-ДНК гибридизации параметры, характеризующие настоящий метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pSS6 toxB'.E.coli C₆₀₀r^-m^-, а именно чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов были соответственно равны 97 94 95 и 98 в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как положительный, и 99 94 95 и 99 в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как отрицательный. В отличие от реакции преципитации в агаре, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pSS6 toxB'. Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- позволил выявить штаммы С.diphtheriae с дефектным геном дифтерийного токсина, то есть штаммы не продуцирующие дифтерийный токсин. Таким образом, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pSS6 toxB' Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- может быть использован не только при диагностических исследованиях, но и при наблюдениях за миграцией tox⁺ гена детерминирующего синтез дифтерийного токсина и/или его фрагмента 4 toxB гена в популяциях С. diphtheriae.

Литература:
1. Бобкова М.Р. Маркина С.С. Мазурова И.К. Бобков А.Ф. Гараев М.М. Тезисы докладов 1-й Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза" 1-2 октября, 1985 г. г. Москва. стр.3-4.

2. Бобков А.Ф. Бобкова М.Р. Гараев М.М. Комбарова С.Ю. Мазурова И.К. Маркина С.С. Авт. свидетельство N 4406330/30-13 от 21 марта 1988 г.

3. Гараев М. М. Бобкова М.Р. Бобков А.Ф. Лукашевич Н.В. Казенкова Е.В. "Генетика", 1990, N 6, стр. 990-999.

4. Здановский А.Г. Здановская М.В. Зайцев Е.М. Свиридов В.В. Якубович Н. В. Ребентиш Б.А. Янковский Н.К. Молек.биол. 1988, т.22, N 5, стр. 1293-1300.

5. Ковган А.А. Жданов В.М. МЭИ, 1988, N 8, стр. 23-31.

6. "Плазмиды", под редакцией Харди К. Москва, "Мир", 1990.

7. Feinberg A.P. Vogelstein B. Anal. Biochem. 1984, v. 137, p. 266-267.

8. Mandel M. Higa A. J. Mol. Biol. 1970, v.53, p. 154.

9. Papenheimer A.M. Murphy J.R. The Lancet, 1983, v.2, p. 923-926.

10. Rappuoli R. Perugini M. Falsen E. The New England Journal of Medicine, 1988, v. 318, p. 12-14.

11. Tenover F.C. Clinical Microbiology Reviews, 1988, v. 1, p. 82-101.

Использование: диагностика инфекционных заболеваний методом гибридизации нуклеиновых кислот. Сущность изобретения: получение штамма Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pSS6 toxB') - продуцента специфического ДНК-зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Сorynebacterium diphtheriae. Штамм обеспечивает высокий выход плазмидной ДНК pSS6 toxB', которая используется при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического зонда.

Штамм бактерий Escherichia coli N 229 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) - продуцент специфического ДНК-зонда, используемого для дифференцирования токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium cliphtherial и комплементарного tox B гену, определяющему синтез дифтерийного токсина.