СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ Bordetella pertussis Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 C12P19/30 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности, к методам молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на различных территориях, с целью ускоренного выявления эпидемических штаммов с измененной генетической структурой и разработке на их основе перспективных диагностических и профилактических препаратов.

Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, которая до начала прошлого века занимала первое место по летальности среди четырех детских капельных инфекций (коклюш, корь, скарлатина, дифтерия). Введение массовой иммунизации детского населения в середине прошлого века коренным образом изменило характер течения эпидемического процесса коклюшной инфекции во всем мире и способствовало значительному уменьшению количества случаев заболеваний, тяжести течения болезни и резкому снижению летальности. В настоящее время коклюш является одной из десяти причин летальности у детей младенческого возраста, занимает 5-ое место в детской смертности, вызванной вакциноуправляемыми инфекциями, и продолжает быть проблемой здравоохранения даже в странах с высоким уровнем вакцинации. Начиная с 1990-х годов во многих странах Европы и Америки отмечается рост заболеваемости коклюшем, несмотря на высокий уровень охвата профилактическими прививками, который считается наиболее распространенным среди вакциноуправляемых инфекций (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).

В России, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения и высокий уровень охвата профилактическими прививками, до настоящего времени сохраняются подъемы и спады заболеваемости за счет как непривитых, так привитых лиц, отмечается высокая заболеваемость детей раннего возраста, регистрируются тяжелые формы болезни, летальные исходы, а также увеличилась заболеваемость детей школьного возраста, что свидетельствует о продолжающейся широкой циркуляции возбудителя коклюша (11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19). Одной из причин этого является изменение его биологических (как фенотипических, так и генотипических) свойств под влиянием длительной массовой иммунизации.

Молекулярно-генетический мониторинг штаммов В.pertussis проводится во многих странах мира и в России. Показано, что штаммы В.pertussis подвержены генетической вариабельности, затрагивающей гены, кодирующие основные факторы патогенности возбудителя, что способствует расширению их приспособительных возможностей, особенно в условиях длительной иммунизации (20, 11, 21, 22, 23, 24, 13, 25, 26, 17, 27, 28, 1, 29, 30, 2, 3, 4, 5, 6, 31, 32, 7, 8, 33, 34, 35, 9, 10, 36). Изменения в генах, ответственных за проявление патогенности возбудителя, могут привести к появлению штаммов с измененными свойствами и оказать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов коклюшной инфекции. К настоящему времени штаммовый SN-полиморфизм (SNP) В.pertussis описан в 16 генах, кодирующих поверхностные белки, из которых наиболее выраженные изменения обнаружены в гене ptxA, кодирующем S1 субъединицу коклюшного токсина, гене ptxC, кодирующем S3 субъединицу коклюшного токсина, гене prn, кодирующем пертактин, гене fim3, кодирующем фимбриальный белок, и гене tcfA, кодирующем фактор колонизации трахеи. Было установлено, что штаммы с новыми «невакцинными» аллелями этих генов постепенно вытесняют штаммы со старыми «вакцинными» аллелями генов, т.е. происходит селекция штаммов с измененной структурой антигенных детерминант основных факторов патогенности, которые отличаются по антигенной специфичности от структуры вакцинных штаммов, используемых для производства профилактических препаратов.

В настоящее время для изучения особенностей генетической структуры детерминант основных факторов патогенности используется метод прямого секвенирования, пуль-гель-электрофорез и метод выявления тандемных повторов нуклеотидных последовательностей (37, 29, 5, 31, 38, 39, 40, 41, 36), которые являются достаточно трудоемкими, длительными и дорогостоящими методами исследования, и не могут быть использованы для ускоренного мониторинга большого количества циркулирующих штаммов В.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем. Нами ранее был разработан ускоренный способ дифференцирования штаммов В. pertussis, который позволяет выявлять особенности генетической структуры гена ptxA, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина (42). Однако, недавние многочисленные исследования доказали важность изменений, происходящих в областях генома, регулирующих экспрессию генов основных факторов патогенности для адаптации возбудителя коклюша. Двухкомпонентная BvgAS система является основной системой регуляции В.pertussis. Показано, что SN-полиморфизм участков генома, детерминирующих компоненты данной регуляторной системы, может приводить к нарушению работы системы и изменению уровня экспрессии генов, кодирующих основные факторы патогенности (43, 44, 45). Основное внимание было уделено изучению уровня экспрессии оперона ptx, кодирующего коклюшный токсин. В результате проведенных исследований выявлены точечные мутации в промоторе коклюшного токсина (ptxP), который является одним из компонентов регуляторной BvgAS системы. В области промотора ptxP находятся 6 сайтов связывания с димером BvgA, точность присоединения которого на специфический сайт и прочность образуемой связи влияют на экспрессию оперона ptx и, следовательно, на уровень продукции коклюшного токсина (29, 34, 35).

В процессе изучения генетической структуры промотора коклюшного токсина (ptxP) у штаммов В.pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, методом прямого секвенирования были выявлены 3 варианта последовательности нуклеотидов, которые полностью совпадали с данными, опубликованными в международной базе генотипов EMBL/GeneBank, и соответствовали 3 аллелям промотора ptxP (7). Так, для ptxP1 и ptxP3 аллелей в положении (-167) характерным является нуклеотид C, в то время как для ptxP2 аллеля - нуклеотид T. Во втором положении - (-65) для аллелей ptxP1 и ptxP2 характерным является нуклеотид G, а для третьего варианта - нуклеотид A. Первый аллель промотора коклюшного токсина - ptxP1, согласно базе данных, является «вакцинным» аллелем, т.к. все штаммы, используемые в различных странах мира для производства цельноклеточных вакцин, несут этот аллель гена, а ptxP2 и ptxP3 аллели являются новыми «невакцинными». Показано, что новый «невакцинный» ptxP3 аллель промотора имеет значимые мутационные изменения, затрагивающие функциональную область, отвечающую за связывание с BvgA димером, что приводит к усилению прочности связи и, как следствие, увеличению продукции коклюшного токсина. При изучении штаммов В.pertussis, выделенных от больных коклюшем в современный период эпидемического процесса коклюшной инфекции, нами было установлено, что большинство штаммов имеют значимые мутационные изменения в структуре промотора коклюшного токсина (ptxP) и в опытах in vivo на мышах являются высоковирулентными (24). Поэтому в настоящее время актуальным является наблюдение не только за генетической структурой детерминант основных факторов патогенности, но и за структурой регуляторных детерминант, оказывающих влияние на уровень их продукции. Кроме того, учитывая, что микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг циркулирующих штаммов В.pertussis в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией строится на изучении особенностей структуры ptxA, ptxC, pm, fim3, tcfA и ptxP генов, в настоящее время необходимым является разработка ускоренных методов дифференцирования штаммов В.pertussis и по структуре регуляторной ptxP промоторной области коклюшного токсина.

В настоящее время единственным методом для определения генетической структуры промотора коклюшного токсина (ptxP) является прямое секвенирование с последующим анализом нуклеотидной последовательности и выявлением точечных мутаций в двух положениях. Данный метод является длительным, трудоемким, дорогостоящим и требует высокого уровня квалификации персонала лаборатории. Поэтому использование данного метода для ускоренного слежения за циркулирующими штаммами и выявления эпидемически значимых штаммов возбудителя коклюша при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией, а также для последующего быстрого создания на их основе новых вакцинных препаратов является затруднительным.

Задачей настоящего изобретения является разработка точного, ускоренного, экономически выгодного способа молекулярно-генетического типирования штаммов В.pertussis с различными аллельными вариантами промотора коклюшного токсина (ptxP) для наблюдения за циркулирующими штаммами возбудителя коклюша, выявления эпидемических штаммов при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией, а также для создания на их основе перспективных вакцинных препаратов.

В соответствии с поставленной задачей был разработан новый ускоренный способ молекулярно-генетического типирования штаммов В.pertussis по структуре промотора коклюшного токсина (ptxP), предусматривающий выделение ДНК из штаммов В.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина (ptxP), которые последовательно подвергают рестрикции эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле. Дифференциацию штаммов В.pertussis проводят путем сравнения размера ампликонов фрагментов ДНК промотора ptxP исследуемых штаммов В.pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов B.pertussis ptxP1, ptxP2 и ptxP3 аллелей промотора. Показано, что последовательность нуклеотидов в положениях 313-318 ptxP1 и ptxP2 аллелей промотора коклюшного токсина создают сайт рестрикции для эндонуклеазы KpnI (замена нуклеотида T (тимин) на G (гуанин) в положении 313). Нуклеотидная последовательность ptxP2 аллеля промотора коклюшного токсина в положениях 206-211 создает сайт рестрикции для эндонуклеазы MluI (замена нуклеотида A (аденин) на T (тимин) в положении 211). Молекулярно-генетическое типирование штаммов, несущих ptxP3 аллель промотора, от штаммов несущих ptxP2 и ptxP1 аллели основано на отсутствии сайтов рестрикции для эндонуклеаз MluI и KpnI в нуклеотидной последовательности ptxP3 аллеля. В свою очередь, отсутствие сайтов рестрикции для эндонуклеазы MluI в нуклеотидной последовательности ptxP1 аллеля создает возможность молекулярно-генетического типирования штаммов, несущих ptxP1 аллель промотора, от штаммов несущих ptxP2 аллель. Нуклеотидная последовательность ptxP2 аллеля промотора в положениях 313-318 и 206-211 создает сайты рестрикции для эндонуклеаз KpnI и MluI, соответственно.

Для проведения полимеразной цепной реакции использовались специфические праймеры PF 5′-AATCGTCCTGCTCAACCGCC-3′ и PR 5′-GGTATACGGTGGCGGGAGGA-3′, которые фланкируют участок генома ptxP промотора длиной 532 пар нуклеотидов. После проведения амплификации ампликоны, полученные на матрице ptxP промотора, последовательно подвергали рестрикции эндонуклеазами KpnI и MluI с проведением электрофореза в агарозном геле для разделения полученных фрагментов и визуализации результатов в ультрафиолетовом спектре. Молекулярно-генетическое типирование ptxP аллелей промотора проводили путем сравнения специфического рестрикционного профиля (размера полученных фрагментов) ДНК контрольных штаммов, несущих ptxP1, ptxP2 или ptxP3 аллель с полученными рестрикционными фрагментами исследуемых штаммов. После обработки ампликонов, полученных на матрице ptxP промотора, эндонуклеазой рестрикции KpnI и постановки горизонтального электрофореза в агарозном геле, в ультрафиолетовом спектре визуализировались 2 варианта рестрикционного профиля (набора фрагментов ДНК). Для одной группы штаммов характерен рестрикционный профиль с наличием двух специфических светящихся фрагментов размером 315 и 217 пар нуклеотидов (тип KpnI-1), что соответствовало размеру специфических светящихся фрагментов ДНК контрольных штаммов B.pertussis, несущих ptxP1 и ptxP2 аллели промотора коклюшного токсина. Для второй группы штаммов характерным было наличие одного специфического светящегося фрагмента размером 532 пар нуклеотидов (тип KpnI-2), что соответствовало размеру фрагмента ДНК контрольного штамма B.pertussis, несущего ptxP3 аллель. Таким образом, после рестрикции с эндонуклеазой KpnI можно дифференцировать штаммы, несущие ptxP1 и ptxP2 аллели, от штаммов, несущих ptxP3 аллель промотора коклюшного токсина. Для точной дифференциации штаммов, несущих ptxP1 и ptxP2 аллели промотора коклюшного токсина, проводили последующую обработку полученных ампликонов эндонуклеазой рестрикции MluI. После проведения электрофореза в агарозном геле и визуализации результатов рестрикции в ультрафиолетовом спектре, выявляли 2 группы штаммов, имеющих разный набор специфических светящихся фрагментов. Для первой группы характерным было наличие 2 специфических светящихся фрагментов размером 321 и 211 пар нуклеотидов (тип MluI-1), данный рестрикционный профиль совпадал с профилем контрольного образца ДНК штамма В.pertussis, несущего ptxP2 аллель промотора коклюшного токсина. Для второй группы штаммов характерным наличие одного специфического светящегося фрагмента размером 532 пар нуклеотидов (тип MluI-2), что соответствовало профилю контрольных образцов ДНК штаммов возбудителя коклюша, несущих ptxP1 и ptxP3 аллели промотора коклюшного токсина. Таким образом, было показано, что для штаммов В.pertussis, несущих ptxP1 аллель промотора коклюшного токсина, характерно наличие рестрикционных профилей типов KpnI-1 и MluI-2, для штаммов, несущих ptxP2 аллель характерно наличие рестрикционных профилей KpnI-1 и MluI-1 и для штаммов, несущих ptxP3 аллель - профилей KpnI-2 и MluI-2. Разница комбинаций рестрикционных профилей различных ptxP аллелей является способом быстрой дифференциации штаммов В.pertussis по структуре промотора коклюшного токсина.

Апробирование данного способа ускоренного молекулярно-генетического типирования штаммов B.pertussis проведено на 232 штаммах различной серотиповой принадлежности, выделенных от больных коклюшем на различных территориях России в 1948-2012 гг. Из них 71 штамм выделен от больных коклюшем в 1948-1999 гг. и 161 штамм выделен от больных коклюшем в 2000-2012 гг. В результате проведенного исследования выявлены особенности генетической структуры ptxP промотора коклюшного токсина. Показано, что для 57 (24,6%) штаммов характерным был рестрикционный профиль типов KpnI-1 и MluI-2 и соответственно данные штаммы несли ptxP1 аллель промотора; 24 (10,3%) штамма характеризовались рестрикционным профилем KpnI-1 и MluI-1 и имели ptxP2 аллель и 151 (65,1%) штамм характеризовались рестрикционным профилем KpnI-2 и MluI-2 и несли ptxP3 аллель промотора коклюшного токсина.

Проведенные исследования доказывают, что использование разработанного ускоренного способа молекулярно-генетического типирования штаммов В.pertussis по структуре ptxP промотора коклюшного токсина с использованием эндонуклеаз рестрикции KpnI и MluI позволяет выявлять штаммы с различными аллельными вариантами ptxP промотора.

Техническим результатом заявленного изобретения является точный, ускоренный, технически и экономически выгодный способ молекулярно-генетического типирования штаммов В.pertussis при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов возбудителя коклюша с целью ускоренного выявления эпидемических штаммов с измененной генетической структурой ptxP промотора коклюшного токсина и разработке на их основе перспективных, как диагностических, так и профилактических препаратов, обладающих высокой протективной активностью в отношении циркулирующих штаммов возбудителя, вызывающих заболевание коклюшем.

Пример.

Штаммы В.pertussis выращивали на казеиново-угольном агаре (КУА), с добавлением бициллина и без добавления крови крупного рогатого скота, при температуре 37°C. После 48-72 часов роста отбирали одну типичную изолированную колонию, которую с помощью петли переносили в пробирку типа эппендорф и суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК из штамма В.pertussis методом кипячения при температуре 95°C в течение 20 минут, после чего центрифугировали при 12000 оборотов/мин в течение 5 минут. Полученный супернатант охлаждали. Для постановки полимеразной цепной реакции использовали праймеры PF и PR, фланкирующие участок нуклеотидной последовательности промотора коклюшного токсина (ptxP) размером 532 пар нуклеотидов. В реакционную ПЦР смесь добавляли по 1 микролитру специфических праймеров PF и PR, 1 микролитр термостабильной ДНК-полимеразы и вносили 1 микролитр супернатанта ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 48 микролитров. Смесь перемешивали на вортексе и амплифицировали при условиях: 95°C - 15 мин (1 цикл); 95°C - 15 сек, 55°C - 30 сек, 72°C - 1 мин (30 циклов), 72°C - 10 мин. Полученные ампликоны обрабатывали эндонуклеазой рестрикции KpnI в течение 1 часа при температуре 37°C, затем проводили электрофорез в 3% агарозном геле при напряжении 150 V в течение 1,5 часов. Для окраски образцов ДНК использовали стандартный краситель SYBR GREEN. Результаты электрофореза учитывали с помощью гель-документирующей системы в ультрафиолетовом спектре. Рестрикционный профиль (размер полученных ампликонов) исследуемых штаммов В.pertussis сравнивали с контрольными профилями ДНК штаммов В.pertussis, несущих ptxP1, ptxP2 и ptxP3 аллели промотора. Если профиль имел тип KpnI-2, то делали вывод, что штамм несет ptxP3 аллель промотора коклюшного токсина. Если же полученные профили имели тип KpnI-1, то делали предположение о том, что штаммы несут либо ptxP1, либо ptxP2 аллели. Для дальнейшей точной дифференциации штаммов проводили обработку ампликонов эндонуклеазой рестрикции MluI. Исследуемые образцы выдерживали в течение 1 часа при температуре 37°C, затем проводили электрофорез в 3% агарозном геле при напряжении 150V в течение 1,5 часов. Результаты электрофореза учитывали с помощью гель-документирующей системы в ультрафиолетовом спектре. Рестрикционный профиль (размер полученных ампликонов) исследуемых штаммов В.pertussis сравнивали с контрольными профилями ДНК штаммов В.pertussis, несущих ptxP1, ptxP2 и ptxP3 аллели промотора. Если профиль имел тип MluI-2, то делали вывод, что штамм несет ptxP1 аллель промотора коклюшного токсина. Если же полученные профили имели тип MluI-1, то делали предположение о том, что штаммы несут ptxP2 аллель промотора коклюшного токсина. В результате сопоставления полученных типов рестрикционных профилей после рестрикции с эндонуклеазами KpnI и MluI проводили точную дифференциацию штаммов В. pertussis по принадлежности к ptxP1, ptxP2 или ptxP3 аллелю промотора коклюшного токсина.

Литература

1. Advani A., Donnelly D., Gurstafsson L., Hallander H.O. Changes of the Swedish Bordetella pertussis population in incidence peaks during an acellular pertussis vaccine period between 1997 and 2004 // APMIS. - 2007. - Vol.115(4). - P.299-310.

2. Cassiday P., Sanden G., Heuvelman K., Mooi F., Bisgard K.M., Popovic T. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertussis toxin virulence factors in the United States, 1935-1999 // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol.182. - P.1402-1408.

3. Elomaa A., Advani A., Donnelly D., Antila M., Mertsola J., Hallander H., He Q. Strain variation among Bordetella pertussis isolates in Finland, where the whole-cell pertussis vaccine has been used for 50 years // J. Clin. Microbiology. - 2005. - Vol.43. - P. 3681-3687.

4. Elomaa A., Advani A., Donnelly D et al. Population dynamics of Bordetella pertussis in Filand and Sweden, neighbouring countries with different vaccination histories // Vaccine. - 2007. - Vol.25(5). - P.918-926.

5. Gzyl A., Augustynowicz E., Mosiej E., Zawadka M., Gniadek G., Nowaczek A., Slusarczyk J. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) versus randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) as new tools for inter- and intra-species differentiation within Bordetella // J. Medical Microbiology. - 2005. - Vol.54. - P.333-346.

6. Hallander H., Advani A., Donnelly D., Gustafsson L., Caisson R.M. Shifts of Bordetella pertussis variants in Sweden from 1970 to 2003, during three periods marked by different vaccination programs // J. Clin. Microbiology. - 2005. - Vol.43. - P.2856-2865.

7. Lee Y.S., Yang C.Y., Lu C.H., Tseng Y.H. Molecular epidemiology of Bordetella pertussis isolated in Taiwan, 1992 - 1997 // J. Microbiology Immunology. - 2003. - Vol.47. - P.903 - 909.

8. Litt D.J., Neal S.E., and Fry N.K. Changes in Genetic Diversity of the Bordetella pertussis Population in the United Kingdom between 1920 and 2006 Reflect Vaccination Coverage and Emergence of a Single Dominant Clonal Type // J. Clin. Microbiology. - 2009. - P.680-688.

9. Preziozi M.P., Yam A., Wassilak S.G. et al. Epidemiology of pertussis in a West African community before and after introduction of a widespread vaccination program. //Am. J. Epidemiol. - 2002. - vol.155 (10). - P.891-896.

10. van Amersfoorth S.C.M., Schouls L.M., van der Heide H.G.J., Advani A., Hallander H.O., Bondeson K., von Konig C.H.W., Riffelmann M., Vahrenholz C., Guiso N., Caro V., Njamkepo E., He Q., Mertsola J., Mooi F.R. Analysis of Bordetella pertussis Populations in European Countries with Different Vaccination Policies // J. Clin. Microbiology. - 2005. - Vol.43. - P.2837-2843.

11. Борисова О.Ю., Петрова М.С., Мазурова И.К., Лыткина И.Н., Попова О.П., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Захарова Н.С., Пяева А.П., Салова Н.Я., Требунских И.П., Комбарова С.Ю, Шинкарев А.С., Скачкова В.Г., Савинкова B.C., Алешкин В.А. Особенности коклюшной инфекции в различные периоды эпидемического процесса в г.Москве. // Журнал эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2010. - №4. - С.33-39.

12. Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Н.Н.Филатов. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению. // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. - 2004. - №35. - С.8-9.

13. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г.Москве (1948 - 2005 гг.) // Журнал молекулярной медицины. - 2008. - №1. - С.40-45.

14. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Попова О.П. и др. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в период эпидемического неблагополучия. // В кн.: Проблемы инфекционных болезней: Сборник науч. трудов. Часть 1. М. - 2000. - С.80-86.

15. Попова О.П., Селезнева Т.С., Милюкова В.И. Клинико-эпидемиологические аспекты коклюшной инфекции в современных условиях // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - №3. - С.24-26.

16. Попова О.П., Петрова М.С., Чистякова Г.Г. и др. Клиника коклюша и серологические варианты коклюшного микроба в современных условиях // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - №1. - С.44-46.

17. Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н. и др. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе. // Журн. Микробиол. - 2005. - №5. - С.35-40.

18. Чупрынина Р.П. Вакцинопрофилактика коклюша в национальных программах иммунизации // Материал VI Всерос. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. - 1991. - Том 2. - С.206-207.

19. Чупрынина Р.П., Алексеева И.А., Озерецковский Н.А. Профилактика коклюша: разработка и применение бесклеточной коклюшной вакцины // Журн. Микробиол. - 2006. - №1. - С.99-105.

20. Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов Bordetella pertussis, обладающих различными ptx генами // Журн. микробиол. - 2008. - №5. - С.80-83.

21. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Алешкин В.А. Молекулярно-генетические особенности структуры гена, кодирующего фактор колонизации трахеи штаммов B.pertussis. // Журнал микробиол. - 2010. - №5. - С.11-15.

22. Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г. Панферова Р.А., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А., Мязурова И.К., Алешкин В.А. Особенности структуры генов, кодирующих A- и B-комплексы коклюшного токсина, штаммов В.pertussis // Молекулярная медицина. - 2012. - №1. - С.44-48.

23. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Салова Н.Я., Абасова Ф.М., Требунских И.П., Наретя Н.Д., Алексеева Л.А., Якунина О.Ю., Mooi F., Алешкин В.А. Генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в России. // Медицинский альманах. - 2012. - №2 (21). - С.30-34.

24. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Зайцев Е.М., Салова Н.Я., Абасова Ф.М., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова Р.А., Алексеева Л.А., Якунина О.Ю., Наретя Н.Д., van Gent M., Moot F., Алешкин В.А. Особенности распространения штаммов В.pertussis, выделенных от больных коклюшем, с различными аллельными вариантами гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина (ptxP). // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2012. - №2. - С.14-19.

25. Мерцалова Н.У., Борисова О.Ю., Шинкарев А.С., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мазурова И.К., Алешкин В.А., Гадуа Н.Т., Захарова Н.С.Динамика изменений патогенных свойств штаммов Bordetella pertussis. // Журн. Микробиол. - 2009. - №6. - стр.7-11.

26. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен. // Журн. Микробиол. - 2003. - №6. - С.70-73.

27. Ценева Г.Я., Курова Н.Н. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика коклюша // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2003. - №4 (5). - С.329-341.

28. Шинкарев А.С, Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддубиков А.В., Брицина М.В., Бажанова И.Г. Современные штаммы Bordetella pertussis:

молекулярная и иммунобиологическая характеристика // Журн. микробиол. - 2007. - №4. - С.20-25.

29. Advani A., H.G.J. Van der Heide, H.O. Hallander, F.R. Moot. Analysis of Swedish Bordetella pertussis isolates with three typing methods: characterization of an epidemic lineage // J. of Microbiological Methods. - 2009. - Vol.78. - P.297-301.

30. Borisova 0., Kombarova S.J., Zakharova N.S., Marjolein van Gent, Aleshkin V.A., Mazurova I.K., Mooi F. Antigenic divergence between Bordetella pertussis clinical isolates from Moscow, Russia and vaccine strains // J. Clinical and vaccine immunology. - 2007. -Vol.14. - №3. - P. 234-238.

31. Hallander H., Advani A., Riffelmann M., von Konig C.H.W., Саго V., Guiso N., Mooi F.R., Gzyl A., Kaltogt M.S., Fry N.K., Mertsola J., He Q. B. pertussis strains circulating in Europe in 1999 to 2004 as determined by pulsed-field gel electrophoresis // J. Clin. Microbiology. - 2007. - Vol.45. - N. 10. - P.3257-3262.

32. Kourova N., Саго V., Weber С.Comparisson of the Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis isolates circulating in Sankt-Peterburg between 1998 - 2000 with Russian vaccine strains // J. Clin. Microbiology. - 2003. - Vol.41. - №8. - Р.3709-3711.

33. Mooi F.R., van Loo I.H.M., King A. Adaptation of Bordetella pertussis to vaccination: a cause for its reemergence? // Emerging Infect. Diseases. - 2001. - Vol.7. - N.3. - P.526-528.

34. Mooi F.R., van Loo I.H.M., van Gent M.,He Q., Heuvelman C.J., Bart M.J., de Greeff S.C., Diavatopoulos D.A., Teunis P.F., Nagelkerke N.J., Mertsola J. Bordetella pertussis with increased pertussis toxin production associated with pertussis resurgence // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol.15. - P.1206-1213.

35. Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen // J. Infect Genet Evol. - 2010. - Vol.10(1). - P.36-49.

36. van Loo I.H.M., Heuvelman K.J., King A.J., Mooi F.R. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis based on surface protein genes // J. Clin. Microbiology. - 2002. - Vol.40. - P.1994-2001.

37. Advani A., Donnelly D., Hallander H.O. Reference system for characterization of Bordetella pertussis pulsed-field gel electrophoresis profiles // J. Clin. Microbiology. - 2004. - Vol.42. - P.2890-2897.

38. Kurniawan J., Maharjan R. P., Chan W. F., Reeves P.R., Sintchenko V., Gilbert G.L., Moot F.R., Lan R. B.pertussis clones identified by multilocus variable-number tandem-repeat analysis // J. Emerging Infectious Diseases. - 2010. - Vol.16. - №2. - P.297-300.

39. Mooi F.R., Hallander H., Wirsing C.H., Hoet В., Guiso N. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology // Eur. J. Clin. Microbiology Infect. Dis. - 2000. - Vol.19. - P.174-181.

40. Muyldermans G., Pierard D., Hoebrekx N., Advani R., van Amersfoorth S., de Schutter I., Soetens 0., Eeckhout L., Malfroot A., Lauwers S. Simple Algorithm for Identification of Bordetella pertussis Pertactin Gene Variants // J. Clin. Microbiology. - 2004. - Vol.42. - P.1614-1619.

41. Muyldermans G., Soetens 0., Antoine M., Bruisten S., Vincart В., Doucet-Populaire F., Fly N.K., Olcen P., Scheftel J.M., Senterre J.M., van der Zee A., Riffelmann M., Pierard D., Lauwers S. External quality assessment for molecular detection of Bordetella pertussis in European laboratories // J. Clin. Microbiology. - 2005. - Vol.43. - P.3-35.

42. Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Алешкин В.А., Мазурова И.К. Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» №2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

43. Boucher P.E., Murakami К., Ishinama A., Stibitz S. Nature of DNA binding and RNA polymerase interaction of the Bordetella pertussis BvgA transcriptional activator at the FHA promoter // J. Bacteriology. - 1997. - Vol.l79(Pt5). - P. 1755-1763.

44. Carbonetti N.H., Artamonova G.V., Van Rooijen N., Ayala V.I. Pertussis toxin target airway macrophages to promote B.pertussis infection of the respiratory tract. // Infect. Immun. - 2007. - vol. 75. - P.1713-1720.

45. Cummings C.A., Bootsma H.J., Relman D.A., Miller J.F. Species- and strain-specific control of a complex, flexibe regulin by Bordetella BvgAS. // J. Bacteriol. - 2006. - vol.188. - P.1775-1785.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле. Дифференциацию штаммов B.pertussis проводят путем сравнения размера ампликонов фрагментов ДНК промотора ptxP исследуемых штаммов B.pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов B.pertussis. Изобретение может быть использовано для ускоренного выявления эпидемических штаммов с измененной генетической структурой при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя коклюша и для дальнейшей разработки на их основе перспективных диагностических и профилактических препаратов. 1 пр.

Способ молекулярно-генетического типировапия штаммов Bordetella pertussis по структуре промотора коклюшного токсина ptxP, предусматривающий выделение ДНК из штаммов Bordetella pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, которые последовательно подвергают рестрикции эндонуклеазами Kpnl и Mlul и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле с установлением типов рестрикционных профилей по размерам полученных фрагментов ДНК в сравнении с размерами фрагментов контрольных штаммов, а именно после взаимодействия ампликонов с эндонуклеазой Kpnl наличие фрагментов размеров 315 н.п. и 217 н.п. соответствует типу рестрикционного профиля KpnI-1, размера 532 н.п. соответствует типу KpnI-2, а при взаимодействии ампликонов с эндонуклеазой MluI наличие фрагментов размеров 321 н.п. и 211 н.п. соответствует типу MluI-1 и размера 532 н.п. соответствует типу MluI-2, при этом наличие рестрикционных профилей типов KpnI-1 и MluI-2 характерно для штаммов с ptxP2 аллелью, типов KpnI-2 и MluI-1 - для штаммов с ptxPl аллелью, типов KpnI-2 и MluI-2 - для штаммов с ptxP3 аллелью.