ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ДНК-ЗОНДА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ И НЕТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE И КОМПЛЕМЕНТАРНОГО TOX A ГЕНУ, ОПРЕДЕЛЯЮЩЕМУ СИНТЕЗ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/21 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии.

Известно, что при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний применяется метод ДНК-ДНК-гибридизации, заключающийся в определении в исследуемом материале специфических последовательностей нуклеиновых кислот с помощью комплементарных этим последовательностям ДНК зондов [11] Метод ДНК-ДНК гибридизации со специфическими ДНК зондами сокращает время идентификации требовательных микроорганизмов, позволяет обнаруживать патогенные микроорганизмы непосредственно в клиническом материале и снижает себестоимость лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

В зарубежной литературе имеются сведения об использовании нативных и химерных молекул ДНК или их фрагментов, часть которых представляет специфическую для tox⁺ гена дифтерийного токсина последовательность оснований, в качестве ДНК зондов при научных исследованиях [9 и 10] В нашей стране при конструировании штаммов-продуцентов иммунотоксинов были созданы химерные репликоны, которые были использованы или могли быть использованы как ДНК зонды при идентификации токсигенных штаммов C. diphtheriae [4, 5 и 3] Однако редкие примеры использования химерных репликонов, несущих специфические последовательности гена дифтерийного токсина, в качестве ДНК зондов также не выходили за рамки научных исследований в основном была показана принципиальная возможность использования метода ДНК-ДНК гибридизации для выявления токсигенных штаммов C. diphtheriae [1 и 2] Во всех известных случаях применения нативных и химерных молекул как ДНК зондов не были определены специфические параметры (чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов) специализированного метода ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, что не позволяло широко использовать этот метод, а следовательно те или иные ДНК зонды, при диагностических исследованиях.

Целью изобретения является штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz 219 toxA') продуцент специфического ДНК зонда.

Штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz 219 toxA') депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов. Справка о депонировании прилагается. Регистрационный номер 228
Получение штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz 219 toxA') получен в результате Ca²⁺ зависимой трансформации бактериальных клеток штамма Escherichia coli C₆₀₀ thrI leu6 thil supE44 lacVI tonA r^-m^- λ ^-F^- изолированной ДНК плазмиды pA 219 oxA по незначительно модифицированному методу Mandel и Higa [8] Селекция трансформантов проведена по устойчивости к ампициллину на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина; очистка трансформантов - три последовательных субкультивирования на той же среде. Плазмида, выделенная из устойчивых к ампициллину трансформантов имела ту же электрофоретическую подвижность, что и исходная плазмида, тот же электрофоретический рисунок при электрофорезе в агарозном геле Hind III рестриктов и давала положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae 665.

Характеристика штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz219 toxA') имеет следующие характеристики. Штамм растет на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Штамм растет на минимальной питательной среде, содержащей 10 мкг/мл треонина, 10 мкг/мл лейцина, 1 мкг/мл тиамина и 50 мкг/мл ампициллина. Штамм не ферментирует лактозу. Штамм обеспечивает стабильность молекулы химерного репликона плазмиды pAz219 toxA', высокий выход плазмидной ДНК при выделении ее методом щелочного лизиса и возможность использования изолированной плазмидной ДНК при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического ДНК зонда и при Ca²⁺ зависимой трансформации без дополнительной очистки в градиенте хлористого цезия бромистого этидия. Плазмида pAz219 toxA' стабильна в штамме Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz219 toxA') при культивировании его на средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, и элиминируется из бактериальных клеток этого штамма при культивировании его на средах, не содержащих ампициллин. На плазмиде pAz219 toxA' локализован ген устойчивости к ампициллину. Рестриктаза Hind III расщепляет плазмиду pAz219 toxA' на два фрагмента, меньший из которых в основном представляет специфическую последовательность структурного toxA гена дифтерийного токсина. Тотальный препарат ДНК штамма Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz219 toxA) плазмидная ДНК и меньший по размерам Hind III фрагмент плазмидной ДНК дают положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae 665.

При выделении ДНК плазмиды pA 219 toxA специфического ДНК зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae штамм Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- (pAz219 toxA') выращивают в полноценной жидкой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37^oC в течение 18-20 ч. Бактериальные клетки осаждают и отмывают центрифугированием; плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой неочищенного препарата плазмидной ДНК хлористым литием (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 25 мкг/мл), протеиназой T (конечная концентрация 1 мг/мл), депротеинизацией фенолом, смесью фенол-хлороформ и хлороформом (6). Выделенную плазмидную ДНК фенол-хлороформ и хлороформом (6). Выделенную плазмидную ДНК фрагментируют рестриктазой Hind III в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя фермента и тотальный препарат плазмидной ДНК метят радиоактивной меткой методом рассеянной затравки с целью получения специфического радиоактивного ДНК зонда (7).

Параметры (чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов), позволяющие использовать при диагностических исследованиях специализированный метод ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, при котором меченные радиоактивным изотопом препараты ДНК плазмиды pAz 219 toxA'. Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- применяются как специфический радиоактивный ДНК зонд, были установлены при сравнительной оценке настоящего метода ДНК-ДНК гибридизации и традиционного метода выявления токсигенных штаммов реакции преципитации в агаре. Обоими методами были изучены 134 токсигенных и 125 нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, выделенных на территории России, преимущественно во Владимирской и Пензенской областях, за период с 1986 по 1989 гг. При проведении ДНК-ДНК гибридизации бактериальные клетки изучаемых штаммов лизировали лизоцимом (конечная концентрация 2 мг/мл) и додецилсульфатом натрия (конечная концентрация 1%). Лизаты бактериальных клеток последовательно обрабатывали протеиназой T (конечная концентрация 1 мг/мл), ацетатом натрия (конечная концентрация 0,3 M), ДНК переосаждали этиловым спиртом [6] Пробы наносили на найлоновый мембранный фильтр; обработку фильтров, ДНК-ДНК гибридизацию на мембранных фильтрах и авторадиографию проводили по модифицированному методу Бобкова с соавторами [2] Было показано, что при замене в традиционной технологии бактериологического анализа метода преципитации в агаре методом ДНК-ДНК гибридизации параметры характеризующие настоящий метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pAz219 toxA'. Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^-, а именно чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов были соответственно равны 97, 88, 82 и 98% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как положительный, и 97, 98, 98 и 97% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как отрицательный. В отличие от реакции преципитации в агаре, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pAz219 toxA'. Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- позволил выявить штаммы C. diphthnriae с дефектным геном дифтерийного токсина, то есть штаммы не продуцирующие дифтерийный токсин. Таким образом метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pAz219 toxA'. Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^- может быть использован не только при диагностических исследованиях, но и при наблюдениях за миграцией tox⁺ гена детерминирующего синтез дифтерийного токсина и/или его фрагмента toxA гена в популяциях C. diphtheriae.

Литература
1. Бобкова М. Р. Маркина С. С. Мазурова И. К. Бобков А. Ф. Гараев М. М. Тезисы докладов I-й Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза" 1-2 октября 1985 г. г. Москва, с.3-4.

2. Бобков А. Ф. Бобкова М. Р. Гараев М. М. Комбарова С. С. Мазурова И. К. Маркина С. С. Авторское свидетельство N 4406330/30-13 от 21 марта 1988 г.

3. Гараев М. М. Бобкова М. Р. Бобков А. Ф. Лукашевич Н. В. Казенкова Е. В. Генетика. 1990, N 6, с. 990-999.

4. Здановский А. Г. Здановская М. В. Зайцев Е. М. Свиридов В. В. Якубович Н. В. Ребентиш Б. А. Янковский Н. К. Молекулярная биология, 1988, т.22, N 5, с. 1293-1300.

5. Ковген А. А. Жданов В. М. ЖМЭИ, 1988, N 8, с. 23-31.

6. Плазмиды под редакцией К. Харди, М. Мир, 1990.

7. Feirberg A.P. Vogelstein B. Anal. Biochem. 1984, v. 137, p. 266-267.

8. Mandel M. Higa A. J. Mol. Biol. 1970, v.53, p.154.

9. Papenheimer A.M. Murphy J.R. The Lancet, 1983, v.2, p.923-926.

10. Rappuoli R. Perugini M. Falsen E. The New England Journal of Medicine, 1988, v.18, p. 12-14.

11. Tenover F.C. Clin. Microbiol. Rev. 1988, v.1, p.82-101.

Использование: диагностика инфекционных заболеваний методом гибридизации нуклеиновых кислот. Сущность изобретения: получение штамма Escherichia coli C₆₀₀ r^-m^-/p Az 219 toxA' - продуцента специфического ДНК-зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae. Штамм обеспечивает высокий выход плазмидной ДНК p Az 219 toxA', которая используется при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического зонда.

Штамм бактерий Escherichia coli N 228/ГИСК им.Л.А.Тарасевича продуцент специфического ДНК-зонда, используемого для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae и комплементарного tox А гену, определяющему синтез дифтерийного токсина.