СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ РНК ЭНТЕРОВИРУСОВ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/68 C12N15/41 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к методу диагностики энтеровирусных инфекций, основанному на детекции и анализе генетического материала возбудителя.

Известны следующие способы выявления и дифференциации энтеровирусов, основанные на анализе генетического материала:
1. Выявление энтеровирусов методом одноступенчатой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационной детекцией продукта реакции. Пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд принадлежат к консервативной 5'-NTR области генома и являются универсальными для всех представителей рода Enterovirus (Rotbart H.A. Enzimatic RNA Ampliphication of the Enterovirus. Clin. Microbiol. - 1990.- Mar.-P. 438-442; Chapman N.H., Tracy S., Gountt C. I. , Fortmuller U. Molecular Detection and Identification of Enteroviruses Using Enzimatic Ampliphication and Nucleic Acid Hybridazation. Clin. Microbiol. -1990.-May.-P. 843-850).

2. Выявление отдельных представителей рода и идентификация штаммов методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных для каждого серотипа или штамма (Weiss L.M., Movahed L.A., Billigham M. E., Clary M.L. Detection of Coxsacievirus B3 RNA in Myocardiol Tissues by the Polimerase Chein Reaction. Virus Res. -1991.- V.20, 2. - P. 159-179; Черкасова Е.А., Липская Г.Ю., Белова Г.И. и др. Обнаружение штаммов вируса полиомиелита в природных изолятах и их идентификация с помощью полимеразной цепной реакции. Мол. генетика, микробиология, вирусология.- 1996.- 2.-С.25-32).

3. Выявление всех энтеровирусов методом ПЦР с дифференциацией на полио- и неполиовирусы методом молекулярной гибридизации (Egger D., Pasamontes L., Ostermayer M. , Biens К. Reverse transcription multiplex PCR for differentiation between polio- and enterovirus from clinical and environmental samples. Clin. Microbiol. -1995.- V. 33, 6. -Р. 1442-1447).

4. Дифференциация энтеровирусов путем частичного секвенирования участков генома (Oberste M.S., Maher К., Kilpatrick D.L., Flemister M.R., Broun B.A., Pallansh M. A. Typing of human enteroviruses by partial seguencing of VP1. Clin. Microbiol.-1999.-V.37, 5. -P. 1288-1293).

Однако, эти методы преследуют цель или только выявления всей группы энтеровирусов (1), или приблизительной дифференциации выявленных энтеровирусов на группы полио- и неполиовирусов (3), или идентификацию отдельных представителей энтеровирусов, где для каждого серотипа или штамма используется специфичный набор праймеров. Способ (4) требует дополнительного оборудования и достаточно продолжителен.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является метод полимеразной цепной реакции - полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР - ПДРФ), используемый при дифференциации диких и вакцинных штаммов полиовирусов. В этом случае осуществляют обратную транскрипцию геномного сегмента полиовируса (480 нуклеотидов, принадлежащих району, кодирующему N-концевую половину капсидного белка VP1) и его амплификацию в ПЦР. При ПДРФ анализе образующейся двуцепочечной ДНК производится ее гидролиз специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофоретическим разделением образующихся ДНК фрагментов различной длины. Таким образом, профили ПДРФ, полученные из эквивалентных геномных сегментов разных вирусных штаммов, можно быстро сравнивать при высоком уровне специфичности. Однако, в этом случае решается узкая задача: идентификация диких и вакцинных штаммов полиовирусов, исключая остальных представителей рода Enterovirus (Новые подходы к лабораторной диагностике полиовирусных инфекций: меморандум совещания ВОЗ. Бюлл. ВОЗ. -1992.- 2,- С. 23-29).

Цель изобретения - упрощение и унификация дифференциального выявления РНК энтеровирусов, повышение точности дифференциации.

Сущность изобретения заключается в том, что при выявлении РНК энтеровирусов для проведения обратной транскрипции и амплификации методом "полугнездовой" ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры следующего состава: EVR 1: 5' - caccggatggccaatccaa; EVF: 5' - cggtacctttgtgcgcctgtttt; EVR 2: 5' - aattgtcaccataagcagcca; принадлежащие 5' - NTR области генома энтеровирусов, в результате чего получают участок длиной 546 п.н., содержащий сайты для дифференцирующих рестриктаз. Полученную кДНК гидролизуют последовательно набором рестриктаз Sty I, Bam НI, Ava I, Sma I (Cla I), Pvu II. Путем сравнения электрофоретических профилей гидролизатов определяют принадлежность выявленной РНК к тому или иному типу энтеровирусов или штамму.

Пример 1. Выбор последовательности праймеров и рестриктаз. Выбор олигонуклеотидных праймеров проводят по следующим критериям:
1. универсальность для рода Enterovirus;
2. возможность амплификации в "гнездовом" или "полугнездовом" вариантах ПЦР, имеющих более высокую чувствительность и специфичность при выявлении НК в сравнении с однораундовой ПЦР;
3. наличие в амплифицируемом фрагменте ДНК сайтов рестрикции, по которым можно проводить дифференцировку.

Основой для поиска праймеров является компьютерный анализ с помощью программы "Primer-Master l. 0" (Japan, 1989), полных нуклеотидных последовательностей геномных РHК энтеровирусов, собранных в базах данных Entrez, Gene Bank, EMBL.

С использованием программы "Microgenie" (Bekman, USA, 1987) для каждого энтеровируса составляют рестриктные карты фрагмента, ограничиваемого выбранными праймерами. Путем сравнения полученных карт выбирают дифференцирующие рестриктазы, составляют алгоритмы типирования энтеровирусов.

Пример 2. Выявление РНК энтеровирусов в ПЦР. Дифференциация на геногруппы полио- и неполиовирусов с использованием рестриктаз Sty I и Ваm HI.

Выделение РНК энтеровирусов из исследуемой пробы (культуральная жидкость, фекальный экстракт, сыворотка крови, спиномозговая жидкость, смыв носоглотки) проводят стандартно (Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. -М.: Мир.- 1984.-С. 186-192).

В качестве положительного контроля используют культуральную жидкость, содержащую полиовирусы вакцинных штаммов Sabin I, Sabin II, Sabin III.

Обратную транскрипцию проводят с ревертазой M-MulV и статистическими гексануклеотидами или праймером ERV1. Амплификацию кДНК осуществляют, используя Tag-полимеразу и праймеры VRE 1 и EVF в первом раунде ПЦР и VRE2 и EVF - во втором раунде. Положительные пробы содержат фрагменты кДНК энтеровирусов длиной 546 п. н., выявляемую методом гель-электрофореза с окраской бромидом этидия. Проводят гидролиз выявленных кДНК рестриктазой Sty I. После электрофореза в 2,5% агарозном геле сравнивают электрофоретические профили. При гидролизе кДНК полиовируса 1 образуются фрагменты длиной 222 и 324 п.н., полиовируса 2 - 198 и 348 п.н., полиовируса 3 - 133 и 413 п.н. (см. чертеж). Подобные электрофоретические профили кДПК не встречаются у других энтеровирусов за исключением энтеровируса 70, который имеет сходный профиль с кДНК полиовируса 1. В связи с этим, для исключения ошибки проводят гидролиз исходного фрагмента кДНК рестриктазой Bam HI, которая имеет сайт рестрикции только на кДНК полиовируса 1, и делают окончательное определение принадлежности выявленной РНК к тому или иному типу энтеровирусов.

Пример 3. Определение принадлежности 5'- NTR генома полиовирусов к штаммам вакцинного происхождения.

Для определения принадлежности выявленных участков 5'- NTR генома полиовирусов к штаммам вакцинного происхождения проводят гидролиз фрагментов кДНК, полученных в ПЦР, рестриктазами Ava I для полиовируса 1, Sma I или Cla I для полиовируса 2, Pvu II для полиовируса 3, которые имеют сайты рестрикции только на кДНК вакцинных штаммов (см. чертеж).

Таким образом, использование предлагаемого набора праймеров и рестриктаз позволяет унифицировать выявление энтеровирусов с одновременной их дифференциацией, основываясь на анализе одного и того же геномного фрагмента; упростить дифференциацию энтеровирусов, исключая подбор праймеров для каждого типа вируса; использовать стандартное оборудование ПЦР лаборатории.

Изобретение может быть применено для выявления энтеровирусов, для дифференциального выявления энтеровирусов, для идентификации 5'- NTR генома вакцинных штаммов полиовирусов в лабораториях ПЦР - диагностики и при научных исследованиях.

Метод разработан и апробирован в лаборатории кишечных вирусных инфекций Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано при диагностике энтеровирусных инфекций в эпидемиологических исследованиях. Способ включает проведение реакций обратной транскрипции ДНК методом "полугнездовой" ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров следующего состава: EVR 1:5' - caccggatggccaatccaa; EVF: 5' - cggtacctttgtgcgcctgtttt; EVR 2: 5' - aattgtcaccataagcagcca, в результате чего получают участок длиной 546 п.н., содержащий сайты для дифференцирующих рестриктаз. Полученную кДНК гидролизуют последовательно набором рестриктаз Sty I, Bam H I, Ava I, Sma I (Cla I), Pvu II. Путем сравнения электрофоретических профилей гидролизатов определяют принадлежность выявленной РНК к тому или иному типу энтеровирусов или штамму. Представленное изобретение позволяет более просто и точно выявить и дифференцировать РНК энтеровирусов. 1 ил.

Способ выявления и дифференциации РНК энтеровирусов, включающий проведение реакций обратной транскрипции ДНК методом "полугнездовой" ПЦР с последующим сравнением электрофоретических профилей кДНК, гидролизованной специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), отличающийся тем, что используют олигонуклеотидные праймеры следующего состава: EVR 1: 5'-caccggatggccaatccaa; EVF: 5'-cggtacctttgtgcgcctgtttt; EVR 2: 5'-aattgtcaccataagcagcca; ограничивающие участок 546 нуклеотидов 5'-NTR области генома энтеровирусов, содержащий сайты для дифференцирующих рестриктаз, и набор рестриктаз, применяемых для дифференциации: Sty I (для идентификации геногруппы полиовирусов), Bam H1 (для идентификации РНК полиовируса 1), Ava I, Sma I (Cla I), Pvu II (для идентификации РНК штаммов полиовирусов вакцинного происхождения I, II, III типов).