СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ БЕЛКА ИЗ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 2003 года по МПК A23J1/20 A23C9/148 

Изобретение относится к способам выделения из биологических растворов высококачественного белка и может быть использовано в молочной, пищевой промышленности, микробиологической и медицинской отраслях промышленности.

Известны способы выделения белка из биологических растворов, например молока, кислой (творожной) и сладкой (подсырной) молочной сыворотки ультрафильтрацией и диафильтрацией с последующим концентрированием и выделением сухого белкового препарата известными методами вакуумного выпаривания и сушки [1, 2].

Основным недостатком указанных способов является то, что получаемый белковый препарат содержит значительные количества молочного сахара - лактозы, что ограничивает ценность продукта и сферу его применения, в частности, для получения безлактозного и низколактозного молока.

Известен способ выделения белка из биологических растворов "Вистек", разработанный английской фирмой "Коч-Лайт" [4]. Для осуществления процесса сорбции белка используется специальная ионообменная целлюлоза, известная под названием "среда Вистек".

Основные недостатки: низкая емкость целлюлозных сорбентов, длительное время сорбции, регенерация белка осуществляется в статике, процесс не технологичен.

Наиболее близким к предложенному способу по технической сути и достигаемому результату является способ [3, 4], разработанный французской фирмой "Рон-Пуленк". По этому способу предварительно обезжиренная, освобожденная от механических примесей и охлажденная сладкая (подсырная) молочная сыворотка пропускается через слой специального адсорбента "Сферосил", где происходит селективное поглощение растворенного протеина (белка), а лактоза, минеральные соли и прочие вещества остаются в проходящем через слой фильтрате. Десорбция белка и получение его концентрированного раствора производится обработкой сорбента раствором соляной кислоты. Дальнейшее повышение концентрации белка и сушка проводятся известными промышленными методами.

Основными недостатками указанного способа являются его ограниченность по ассортименту перерабатываемых видов сыворотки, необходимость использования дорогого сорбционного материала и низкая степень концентрирования белка в получаемом концентрате, что приводит к высоким энергозатратам производства.

Задачами настоящего изобретения являются удешевление процесса за счет использования более эффективных сорбционных материалов и повышения содержания чистых протеинов в получаемом концентрате; расширение ассортимента перерабатываемых видов биологических растворов.

Поставленные задачи решаются тем, что в способе выделения белка из биологического раствора, включающем стадии обезжиривания, удаления механических примесей, охлаждения, пропускания через активный сорбционный материал и регенерации сорбционного материала, с получением концентрированного раствора протеинов, после стадии охлаждения биологический раствор, например сыворотку, предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, а в качестве активного сорбционного материала используют макропористые или макросетчатые промышленные сильнокислотные катиониты или сильноосновные аниониты пищевого класса.

При использовании макропористых или макросетчатых катионитов в качестве активного сорбционного материала сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 1:1 или больше по отношению к катиониту, а пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 3,5≤рН≤4,5, а регенерацию сорбционного материала с получением концентрированного раствора протеинов осуществляют раствором бикарбоната натрия.

При использовании макропористых или макросетчатых анионитов в качестве активного сорбционного материала сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 2:1 или больше по отношению к аниониту, а пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 7≤рН≤8,5.

На фиг. 1 представлена схема выделения белка из молочной сыворотки с использованием макропористых и макросетчатых катионитов.

На фиг. 2 представлена схема выделения белка из молочной сыворотки с использованием макропористых и макросетчатых анионитов.

При разработке настоящего способа исходили из нижеприведенной научно-технической информации, известной из литературы. Молочная сыворотка содержит следующие белковые компоненты: бета-лактоглобулин, альфа-лактальбумин, сывороточный альбумин, а также остатки казеионовых белков после переработки молока, а именно альфа-, бета-, каппа- и гамма-казеины (П.А. Ребиндер, И.Н. Влодавец. Проблемы физической химии молока - Ж. Молочная пром-сть, 1967. - 12. - C. 1). Основным белковым компонентом сыворотки является бета-лактоглобулин, имеющий молекулярную массу 35000 и диаметр макромолекулы в конформации, близкой к сферической - 50. Изоэлектрическая точка белка при рН= 5,4. Общее количество групп, содержащих протонируемый азот (имидазольных, гуанидиновых, а также альфа- и эпсилон-аминогрупп), равно 40. Число остатков лизина равно 28, аргинина - 6, гистидина - 4, тирозина - 4. Растворимость в чистой воде в изоэлектрической точке при 25^oС - 0,2 г/л по азоту (Р. Мартин. Введение в биофизическую химию, - М.: "Мир", - 196-430 с.) или 6 г/л самого белка. Растворимость резко повышается при добавлении в раствор неорганических солей, а также при подкислении или подщелачивании раствора.

Известно было, что при пропускании кислой или сладкой сыворотки через обычные гелевые ионообменные смолы белки проходят через слой ионита без взаимодействия с сорбентом, так как не могут проникать в сорбент из-за больших размеров. Например, при пропускании через последовательные слои катионита в Н⁺-форме и анионита в ОН^--форме, а также через смешанный слой указанных ионитов имеет место деминерализация раствора без изменения концентрации белков (Г.С. Родионова, Л.И. Водолазов. Современные методы переработки молочной сыворотки. - Молочная пром-сть. - 1993. - 2. - С.14). Известно было также, что нейтрализованные сывороточные белки (в области значений рН, близких к изоэлектрической точке) не сорбируются даже макропористыми анионитами (Л. С. Иванова, С. Л. Грабчак, Г.В. Кричесвская, Н.Н. Романовская. Переработка молочной сыворотки с помощью адсорбентов и ионообменников. -Молочная пром-сть. - 1993. - 2. - С.28). При этом следует иметь в виду, что макропористые иониты имеют размеры пор, многократно превышающие эффективный размер глобулы бета-лактоглобулина.

Настоящий способ отличается тем, что авторами впервые экспериментально была обнаружена эффективная сорбция сывороточного белка макропористыми и макроретикулярными ионитами в областях значений рН, на одну-три единицы удаленных от изоэлектрической точки. При этом в области пониженных значений 3,5≤рН≤4,5, когда имеет место протонирование и образование макрокатиона, сорбция наблюдается на макропористых и макросетчатых катионитах, а в области значений 7≤рН≤8,5, когда имеет место образование макроаниона, сорбция наблюдается на макропористых и макросетчатых анионитах. Авторами настоящего способа было также замечено, что предварительная деминерализация сыворотки многократно повышает сорбируемость белков.

Процесс на макропористых и макросетчатых высокоосновных катионитах осуществляется следующим образом.

Oбезжиренная и освобожденная от механической взвеси сыворотка (творожная или подсырная), охлажденная до температуры ниже 10^oС (для предотвращения быстрого микробного закисания), пропускается через последовательно расположенные слои катионита в Н-форме и анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, взятых в объемном соотношении 1:1 или больше по отношению к катиониту, что обеспечивает выход деминерализованной (освобожденной от солей кальция и натрия) сыворотки, подкисленной до 3,5≤рН≤4,5. Последняя пропускается через макропористый или макросетчатый катионит в Na⁺-форме, в результате чего положительно заряженный белок сорбируется на катионите, а содержащаяся в сыворотке лактоза свободно проходит через слой сорбента. После отработки емкости слоя по белку проводится десорбция последнего и регенерация катионита пропусканием через слой раствора бикарбоната натрия. В результате такой обработки происходит перезарядка полиэлектролита и его эффективное вымывание из сорбента с одновременной подготовкой катионита в Na⁺-форме к следующему циклу сорбции.

Целесообразно предварительную обработку и деминерализацию сыворотки вести до значений рН в пределах 3,5≤рН≤4,5. При больших значениях рН (более близких к изоэлектрической точке) плотность положительного заряда на полиэлектролите невысокая, что затрудняет сорбцию белка на катионите. При меньших значениях рН молекула белка приобретает жесткую конформацию "вытянутой палочки", что также затрудняет проникновение в фазу ионита и взаимодействие с ним.

Процесс на макропористых и макросетчатых высокоосновных анионитах осуществляется следующим образом.

Обезжиренная и освобожденная от механической взвеси сыворотка (творожная или подсырная), охлажденная до температуры ниже 10^oС, пропускается через последовательно расположенные слои катионита в Н-форме и анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, взятых в объемном соотношении 2: 1 или больше по отношению к аниониту, что обеспечивает выход деминерализованной (освобожденной от хлоридов и сульфатов) сыворотки, подщелоченной до 7≤рН≤8,5. Последняя пропускается через макропористый или макросетчатый анионит в Сl^--форме, в результате чего отрицательно заряженный белок сорбируется на анионите, а содержащаяся в сыворотке лактоза свободно проходит через слой сорбента. После отработки емкости слоя по белку проводится десорбция последнего и регенерация катионита пропусканием через слой раствора соляной кислоты. В результате такой обработки происходит перезарядка полиэлектролита и его эффективное вымывание из сорбента с одновременной подготовкой катионита в Сl^--форме к следующему циклу сорбции.

Целесообразно предварительную обработку и деминерализацию сыворотки вести до значений рН в пределах 7≤рН≤8,5. При меньших значениях рН (более близких к изоэлектрической точке) плотность отрицательного заряда на полиэлектролите невысокая, что затрудняет сорбцию белка на анионите. При больших значениях рН молекула белка приобретает жесткую конформацию, что также затрудняет проникновение в фазу анионита и взаимодействие с ним.

Во всех случаях целесообразно использование сильнокислотных катионитов и сильноосновных анионитов для стадий предподготовки сыворотки и сорбции белка, так как при использовании слабокислотных и слабоосновных ионитов ионы гидроксила и гидроксония будут более селективно сорбироваться по сравнению с низкомолекулярными электролитами на стадии предподготовки и по сравнению с полиэлектролитами на стадии сорбции белка.

В качестве гелевых сильнокислотных катионитов в H⁺-форме для предварительной обработки сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: КУ-2 (Россия); Dowex-50, УрСоге (США); Purolite (Голландия); Wofatit, Lewatit (Германия) и др.

В качестве гелевых сильноосновных анионитов в ОH^--форме для предварительной обработки сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: АВ-17, АМ-1 (Россия); Dowex-1, Dowex-2, Amberlite (США); Zerlite (Англия); Duolite (Франция) и др.

Примеры осуществления процесса.

В качестве макропористых и макросетчатых сильнокислотных катионитов для селективной сорбции протеинов из сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: КУ-23 (Россия); Marathon (США); Purolite (Голландия) и др.

В качестве макропористых и макросетчатых сильноосновных анионитов для селективной сорбции протеинов из сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: АВ-171, АМ-1П (Россия); Up Core (США); Purolite (Голландия) и др.

С точки зрения расходов реагентов (кислоты и щелочи) для регенерации сорбентов для предварительной обработки сыворотки использование слабокислой среды 3,5≤рН≤4,5 с выделением белка на макропористом или макросетчатом катионите наиболее целесообразно для переработки кислой сыворотки.

С точки зрения расходов реагентов (кислоты и щелочи) для регенерации сорбентов для предварительной обработки сыворотки использование слабоосновной среды 7≤рН≤8,5 с выделением белка на макропористом или макросетчатом анионите наиболее целесообразно для переработки сладкой сыворотки.

Примеры осуществления процесса
Пример 1. Свежевыделенную кислую (творожную) сыворотку объемом 1 л с начальным значением рН 4,8 и содержащую 6 г/л протеинов; 0,06 г-экв/л Са²⁺(1,2 г/л); 0,01 г-экв/л Mg²⁺ (0,12 г/л); 0,05 г-экв/л Na⁺ +K⁺ (~1,3 г/л), а также 48 г/л лактозы подвергают сепарации для отделения жиров до остаточной концентрации жирных веществ не более 0,5 г/л и казеиновой пыли. Обезжиренную очищенную сыворотку пропускают через картриджный фильтр с размером пор не более 20 мкм до остаточной концентрации взвешенных веществ не более 0,25 г/л. Далее очищенную и обезжиренную сыворотку охлаждают до температуры 5^oС и пропускают через две последовательно расположенные ионообменные колонки, в первой из которых находится 40 мл катионита КУ-2х8 в Н-форме (с полной обменной емкостью ПОЕ=2,1 мг-экв/мл слоя) и 40 мл анионита АВ-17х8 в ОН^- форме (ПОЕ=1,4 мг-экв/мл слоя). Высота слоя в колонках - по 30 см. Колонки снабжены рубашками для охлаждения, через которые циркулирует теплоноситель - вода, проходящая через холодильную установку. Скорость пропускания сыворотки 250 мл/ч. Полученную на выходе, частично деминерализованную сыворотку, с суммарной концентрацией солей кальция и магния не более 1х10^-3 г-экв/л и остаточной концентрацией солей натрия и калия не более 0,04 г-экв/л, имеющую показатель рН 3,75, пропускают через колонку, содержащую 40 мл макропористого катионита КУ-23 в Na⁺-форме. Высота слоя в колонке - 30 см. Колонка снабжена охлаждающей рубашкой. Скорость пропускания сыворотки - 250 мл/ч. Далее колонку промывают 100 мл дистиллированной воды и через нее пропускают 85 мл 0,33 н. раствора бикарбоната натрия (27,7 г/л МаНСО₃). При этом получают 85 мл раствора концентрата с рН 6,5 и с содержанием протеинов (определяемых селективно по поглощению фенольных групп аминокислотных остатков тирозина в сильнощелочной среде при длине волны 295 нм) более 65 г/л и практически не содержащего лактозу (определяемую по вращению плоскости поляризации в видимой области). Концентрат подвергают ультрафильтрации для получения 35% раствора протеинов и далее - распылительной сушке. Получают сухой продукт с содержанием белка более 95%.

Регенерацию отработанного катионита КУ-2х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 100 мл 2 н. раствора НСl и последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной водой.

Регенерацию отработанного анионита АВ-17х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 85 мл 2 н. раствора НаОН и последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной воды. Анионит готов к следующему циклу предподготовки сыворотки.

Все регенерационные и промывочные воды объединяют и получают 385 мл нейтрального сбросного раствора солей натрия, кальция и магния с общей минерализацией 50 г/л.

Пример 2. Проводят процесс в соответствии с примером 1, за исключением того, что вместо двух последовательных слоев катионита КУ-2х8 и анионита АВ-17х8 используют равновмерно смешанную композицию указанных ионитов в ионообменной колонке объемом 100 мл и высотой слоя 30 см. Получают на выходе частично деминерализованную сыворотку с суммарной концентрацией солей кальция и магния не более 1х10^-4 г-экв/л и остаточной концентрацией солей натрия и калия не более 0,03 г-экв/л и имеющую показатель рН 3,80. Регенерацию отработанных катионита и анионита проводят после предварительного разделения слоев в восходящем потоке дистиллированной воды.

Пример 3. Свежевыделенную сладкую (подсырную) сыворотку объемом 1 л с начальным значением рН 6,4 и содержащую 6,2 г/л протеинов, 0,11 г-экв/л Сl^-(3,9 г/л), 0,01 г-экв/л SO₄ ^2- (0,5 г/л), а также 60 г/л лактозы подвергают сепарации для отделения жиров до остаточной концентрации жирных веществ не более 0,5 г/л и казеиновой пыли. Обезжиренную сыворотку пропускают по аналогии с примером 1 через картриджный фильтр с размером пор не более 20 мкм до остаточной концентрации взвешенных веществ не более 0,25 г/л. Далее очищенную и обезжиренную сыворотку охлаждают до температуры 5^oС и пропускают через две последовательно расположенные ионообменные колонки, в первой из которых находится 30 мл катионита КУ-2х8 в Н⁺-форме (с полной обменной емкостью ПОЕ= 2,1 мг-экв/мл слоя) и 60 мл анионита АВ-17х8 в ОН^--форме (ПОЕ=1,4 мг-экв/мл слоя). Высота слоя в колонках - по 25 см и 40 см соответственно. Полученную на выходе, частично деминерализованную, сывортку, не содержащую сульфатов, с концентрацией хлоридов 0,03 г-экв/л и имеющую показатель рН 7,5, пропускают через колонку, содержащую 50 мл макропористого анионита АВ-171 в Сl^--форме. Высота слоя в колонке - 35 см. Скорость пропускания сыворотки - 250 мл/ч. Далее колонку промывают 100 мл дистиллированной воды и через нее пропускают 100 мл 0,3 н. раствора НСl. При этом получают 100 мл раствора концентрата с рН 3,5 и с содержанием протеинов более 60 г/л, практически не содержащего лактозу. Концентрат подвергают дальнейшей переработке в соответствии с примером 1.

Регенерацию отработанного катионита КУ-2х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 800 мл 2 н. раствора НСl с последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной воды.

Регенерацию отработанного анионита АВ-17х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 120 мл 2 н. раствора NaOH с последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной воды. Анионит готов к следующему циклу предподготовки сыворотки.

Все регенерационные и промывочные воды объединяют и получают 400 мл нейтрального сбросного раствора солей натрия, кальция и магния с общей минерализацией 45 г/л.

Источники информации
1. Ю.Н. Кузьмин, В.А. Лялин, Б.М. Двинский. "Применение мембранных методов в молочной промышленности". ЦНИИТЭИмясомолапром. 1980 - 37 с; с 24-32.

2. В.А. Лялин. "Ультрафильтрационные установки для продовольственных отраслей". Пищевая и перерабатывающая промышленность, 7, 1985, с.28-33.

3.Palmer D.E. "Recupero Delle proteine Dell industria alimentare tramite scambio tonico" "Inquinamento" Hali 1982, том 24, 3 (с.99, 101, 103, 105, 107, 109, 1116, 113).

4. А.Г. Храмцов "Молочная сыворотка". Москва. ВО "Агропромиздат", 1990 - 240 с; с 77-81.

Изобретение относится к способам извлечения белка из молочной сыворотки и может быть использовано в молочной, пищевой промышленности, микробиологической и медицинской отраслях промышленности. Молочную сыворотку обезжиривают, осветляют и охлаждают. После охлаждения молочную сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, а затем через активный сорбционный материал. В качестве активного сорбционного материала используют макропористые и макросетчатые промышленные сильнокислотные катиониты, через которые пропускают сыворотку при рН≤5 или макропористые или макросетчатые промышленные сильноосновные аниониты, через которые пропускают сыворотку при рН≥7. Способ позволяет удешевить процесс извлечения белка за счет использования более эффективных сорбционных материалов и повысить содержание чистых протеинов в получаемом концентрате. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ выделения белка из молочной сыворотки, включающий стадии обезжиривания, осветления, охлаждения, пропускания через активный сорбционный материал и регенерации сорбционного материала с получением концентрированного раствора протеинов, отличающийся тем, что после стадии охлаждения молочную сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, в качестве активного сорбционного материала используют макропористые или макросетчатые промышленные сильнокислотные катиониты пищевого класса, через которые пропускают сыворотку при рН≤5, или макропористые или макросетчатые промышленные сильноосновные аниониты пищевого класса, через которые пропускают сыворотку при рН≥7. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при использовании макропористых или макросетчатых катионитов в качестве активного сорбционного материала творожную (кислую) сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 1: 1 или больше по отношению к катиониту, пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 3,5≤рН≤5, а регенерацию сорбционного материала с получением концентрированного раствора протеинов осуществляют раствором бикарбоната натрия. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при использовании макропористых или макросетчатых анионитов в качестве активного сорбционного материала подсырную (сладкую) сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 2: 1 или больше по отношению к аниониту, а пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 7≤рН ≤8,5.