СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРОВ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической вирусологии, и может найти применение для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к вирусам, а также для контроля эффективности лечения.

В настоящее время определение титров антител методом ИФА является одним из скрининговых тестов для диагностики многих вирусных инфекций.

В литературе приводятся многочисленные данные по оценке гуморального иммунитета с помощью ИФА и конкретные цифры значений титров антител: от 1: 20000 до 1:102400 ("Организацию и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России", методические рекомендации, г. Москва, 2001 г.; авт. свидетельство "Способ диагностики степени тяжести вирусного гепатита В" 4662993/14 от 16.03.89 г.). Однако исследователи, занимающиеся этим вопросом, сталкиваются с рядом трудностей: невозможностью точного установления титра, несовпадением его величины с клиническими симптомами болезни, целесообразностью назначения противовирусного лечения на основании величины показателя титров специфических антител. Значение количественного показателя титра антител играет существенную роль при клинической оценке активности вирусной инфекции, определении тактики ведения пациента, а также при назначении лечения и проведении контроля его эффективности.

Особенно наглядно эти проблемы можно показать на примере инфекций, вызванных цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом простого герпеса (ВПГ). Диагностика цитомегаловирусной и герпетической инфекций остается до настоящего момента актуальной, подтверждением чего является большое количество методов и тест-систем для их выявления.

Поскольку ЦМВ и ВПГ являются персистирующими в организме человека возбудителями, то у иммунокомпетентных лиц после первичного инфицирования вырабатываются антитела, которые сохраняются в невысоких титрах (от 1:50 до 1: 800) в течение всей жизни и не имеют диагностического значения.

При выявлении у пациента антител в титре более 1:800 необходимо установить причину повышенного значения показателя, особенно при отсутствии клинической симптоматики. Как правило, в этих случаях назначают повторный анализ через определенный срок (2-3 недели), после чего на основании полученных результатов с учетом данных анализа и клинических симптомов ставят окончательный диагноз. Совершенно очевидно, что от качественной точной оценки показателя титра антител зависит тактика назначения лечения специфическими препаратами, которые являются дорогостоящими и обладающими рядом серьезных побочных действий на организм (Руководство по лабораторной диагностике цитомегаловирусной инфекции для врачей. М., 1996).

Основным тестом определения антител является в настоящее время метод ИФА. Однако большинство выпускаемых различными предприятиями тест-систем для ИФА не позволяют дать количественную оценку содержащихся в сыворотке крови человека специфических антител, проследить динамику их роста или снижения в процессе лечения, т.к. предназначены только для определения иммунного статуса: тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу герпеса простого 1 и 2 типов "Герпес-скрин", ЗАО "Биосервис", г. Москва; тест-система иммуноферментная для выявления антител к цитомегаловирусу "ЦМВ-скрин", ЗАО "Биосервис", г. Москва и другие.

Наиболее близкими аналогами являются: "Инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения Ig класса G к цитомегаловирусу ЦМВ-IgG" (ЗАО "ИмДи", Кольцово Новосибирской области), "Инструкция к тест-системе Beктo-BПГ-IgG-стрип" (ЗАО "Вектор-Бест", Кольцово Новосибирской области), "Инструкция к тест-системе Цитомега Стрип G" (ЗАО "НИАРМЕДИК ПЛЮС", г. Москва), "Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу краснухи Краснуха-скрин" (ЗАО "Биосервис", г. Москва), которые предполагают при определении титра антител двукратное разведение сыворотки.

Известно, что титр антител - это максимальное разведение сыворотки, содержащее специфические антитела. При определении иммунного статуса делают одно разведение сыворотки, соответственно прилагаемой к тест-системе инструкции (1: 50, 1: 100) и затем при необходимости рекомендуют ее дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений. Нами установлено, что при наличии в сыворотке крови антител в титре до величины обратной 1: 600-1:800 существует прямопропорциональная зависимость между значением оптической плотности и показателем титра антител исследуемой сыворотки (фиг.1). Выше этой обратной величины титра прямопропорциональная зависимость нарушается и при дальнейшем двукратном шаге титрования (1:1600, 1:3200, 1:6400 и т. д.) получают ошибку, которая тем больше, чем больше разведение. Это показано прямым титрованием сыворотки, при котором каждое разведение сыворотки делают из цельной сыворотки, при этом установлено, что чем меньше шаг при типировании, тем меньше ошибка.

Такие данные соответствуют основному закону колориметрии Бугера-Ламберта-Бера. В реальных условиях аналитических определений окрашенные вещества при разбавлении или при действии посторонних веществ разрушаются с образованием бесцветных (или иначе окрашенных) продуктов взаимодействия. Вследствие этого наблюдается нарушение прямопропорциональной зависимости между концентрацией и оптической плотностью. Эти нарушения называют положительными или отрицательными отклонениями от закона Бугера-Ламберта-Бера.

Целью настоящего изобретения является повышение точности способа оценки результата ИФА при определении титра антител в сыворотках крови больных при диагностике вирусных инфекций.

Поставленная цель достигается тем, что сыворотку крови, взятой из локтевой вены, в количестве 3-5 мл, получают путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10-15 мин, инактивируют при 56^oС 30 мин, предварительно готовят из нее ряд последовательных двукратных разведений, добавляют иммунопероксидазные коньюгаты и учитывают результаты реакции на АКИ-Ц-01 при длине волны 492 нм, а затем для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к возбудителям вирусных инфекций соответствующие иммуноглобулины, меченные пероксидазой, добавляют только в разведения сыворотки 1:200 и 1:3200 и далее из сывороток крови больных с высокими значениями титров готовят разведения сыворотки таким образом, чтобы значения показателя ОП находились в пределах прямопропорциональной зависимости от концентрации иммуноглобулинов: если величина ОП сыворотки, полученная при обычном двукратном титровании в разведении 1:200 выше 1,6-2,0 по шкале прибора, а в разведении 1: 3200 - меньше 1,0, то сыворотку 1:200 разводят в 2,5 раза и в дальнейшем титруют с интервалом 1:500, а если величина ОП сыворотки в разведении 1:3200 больше 1,0 по шкале прибора, то сыворотку 1:200 разводят в 5 или 10 раз и готовят последующие разведения с интервалом 1:1000 или 1:2000, и за титр антител принимают наименьшее разведение сыворотки, после которого ОП остается на одном уровне (ОП пробы - ОП контроля не менее 0,21).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная П. наблюдалась в женской консультации по поводу отягощенного акушерского анамнеза.

При исследовании сыворотки больной в ИФА тест-система производства ЗАО "ИмДи", Кольцово, Новосибирской обл. с титрованием сыворотки путем последовательных двукратных разведений титр антител (IgG) к ЦМВ составил 1:25600.

При прямом разведении сыворотки 1:1000 из 1:200 и далее с шагом 1:2000 титр антител (IgG) в сыворотке составил 1:5000 (см. табл. 1).

Диагноз был подтвержден путем обнаружения антигенов ЦМВ методом флюоресцирующих антител.

Пример 2. Больной К. обратился с жалобами на высыпания в области половых органов.

При обследовании сыворотки крови больного в ИФА (тест-система производства "Биосервис", г. Москва), приготовленной путем последовательных двукратных разведений на наличие антител (IgG) к ВПГ у него были обнаружены антитела в титрах: 1:6400 к ВПГ I типа и 1:3200 к ВПГ II типа (см. табл. 2).

Методом прямого титрования сыворотки шагом 1:500 (с разведения 1:1000) титр антител составил к ВПГ I типа - 1:2000 и 1:1500 к ВПГ II типа (см. табл. 3).

Диагноз был подтвержден путем обнаружения антигенов ВПГ методом флюоресцирующих антител.

Пример 3. Женщина во второй половине беременности обратилась к врачу по поводу контакта с ребенком, которому был поставлен диагноз краснушной инфекции. Беременная не знала, болела ли она краснухой в детстве - при серологическом исследовании в ИФА у нее были обнаружены антитела (IgG) к вирусу краснухи в титре 1:1600 при двукратном разведении сыворотки.

Через две недели был проведен повторный забор крови и исследованы парные сыворотки при аналогичном способе титрования. Титр антител остался прежним (см. табл. 4).

При анализе парных сывороток с шагом разведения 1:500 (из исходных 1: 200) титр антител составил 1:1000 (см. табл. 5).

Пример 4. Больной Е. обратился в глазное отделение с жалобами со стороны органов зрения и ему был поставлен диагноз вирусное заболевание глаз.

При исследовании в ИФА (тест-система производства ЗАО "НИАРМЕДИК ПЛЮС", г. Москва) сыворотки больного, приготовленные путем последовательных двукратных разведений, были выявлены иммуноглобулины класса G к ЦМВ в титре 1:3200 (см.фиг.2), (см. табл. 6).

Исследование той же сыворотки титрованием с шагом 1:200, начиная с разведения 1:1000 показало, что в сыворотке больного Е, титр антител к ЦМВ составил 1:1200. (см. табл. 7).

Диагноз был подтвержден путем обнаружения антигенов ЦМВ методом иммунофлюоресцентного анализа.

Таким образом, предлагаемый способ определения титров антител методом ИФА позволяет более точно оценивать величины титров антител в пределах прямопропорциональной зависимости ОП от их концентрации в сыворотке крови, контролировать их изменения как в ходе заболевания, так и в процессе лечения. Данный способ может быть рекомендован для определения титров специфических антител и при других инфекциях.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической вирусологии, и может быть использовано для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к вирусам, а также для контроля эффективности лечения. Сущность способа состоит в том, что для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к возбудителям вирусных инфекций соответствующие иммуноглобулины, меченные пероксидазой, добавляют только в разведения сыворотки 1: 200 и 1:3200 и далее из сывороток крови больных с высокими значениями титров готовят разведения сыворотки таким образом, чтобы значения показателя оптической плотности (ОП) находились в пределах прямопропорциональной зависимости от концентрации иммуноглобулинов и за титр антител принимают наименьшее разведение сыворотки, после которого ОП остается на одном уровне. Техническим результатом является повышение точности способа оценки результата ИФА. 7 табл., 2 ил.

Способ определения титров антител методом иммуноферментного анализа при диагностике вирусных инфекций путем приготовления ряда последовательных двукратных разведений сыворотки, добавления иммуно-пероксидазных конъюгатов и учетом результатов реакции на АКИ-Ц-01 при длине волны 492 нм, отличающийся тем, что для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к возбудителям вирусных инфекций соответствующие иммуноглобулины, меченные пероксидазой, добавляют только в разведения сыворотки 1: 200 и 1: 3200 и далее из сывороток крови больных с высокими значениями титров готовят разведения сыворотки таким образом, чтобы значения показателя оптической плотности (ОП) находились в пределах прямопропорциональной зависимости от концентрации иммуноглобулинов: если величина ОП сыворотки в разведении 1: 200 выше 1,6-2,0 по шкале прибора, а в разведении 1: 3200 - меньше 1,0, то сыворотку 1: 200 разводят в 2,5 раза и в дальнейшем титруют с интервалом 1: 500, а если величина ОП сыворотки в разведении 1: 3200 больше 1,0 по шкале прибора, то сыворотку 1: 200 разводят в 5 или 10 раз и готовят последующие разведения с интервалом 1: 1000 или 1: 2000 и за титр антител принимают наименьшее разведение сыворотки, после которого ОП остается на одном уровне (ОП пробы - ОП контроля не менее 0,21).