СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТОКСОПЛАЗМОЗА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/533 G01N33/569 A61K39/395 

Описание патента на изобретение RU2174233C1

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для прямого обнаружения токсоплазм в патологическом материале.

В связи с разнообразием характера течения болезни при токсоплазмозе практически исключается возможность постановки диагноза только на основании клинической картины. В большинстве случаев при диагностике токсоплазмоза ориентируются на выявление в сыворотках крови токсоплазменных антител. В то же время способность токсоплазм поражать клетки всех типов тканей, определяющая многообразие клинических проявлений заболевания, не всегда сопровождается выработкой специфических антител. Поэтому вопрос о выделении токсоплазм и обнаружение их в клиническом материале у больных с подозрением на токсоплазмоз, а также в патологоанатомических образцах остается актуальным.

Существующие методы исследования возбудителя токсоплазмоза включают поиск его путем непосредственной микроскопии материала в гистологических срезах внутренних органов либо с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также выделение микроорганизма на восприимчивых лабораторных животных.

Перечисленные методы диагностики токсоплазмоза не пользуются широкой популярностью в практической медицине. Несмотря на то, что метод прямой микроскопии несложен и доступен, он не всегда информативен и его отрицательный результат не исключает наличия токсоплазменной инфекции. Выделение токсоплазм методом биопробы предполагает работу с живым возбудителем и восприимчивыми лабораторными животными (белые мыши, морские свинки, кролики или хомяки), трудоемок, дорогостоящ и продолжителен по времени получения результата. (Эпидемиология, клиника, диагностика и лечение токсоплазмоза. Методические рекомендации. Авторы: Л.И.Грачева, Д.Б.Гончаров -М., 1998, с. 24). ПЦР - дорогостоящий диагностический тест и доступен не всем лабораториям.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является сэндвичная иммунологическая проба. При выполнении данного теста для обнаружения в образце биологической жидкости животных антигена Toxsoplasma gondii, который вызывает острую форму токсоплазмоза, на поверхности твердого субстрата сорбируют F (ав1)2 - фрагмент Ig-антител к упомянутому антигену либо моноклональные антитела к нему, добавляют к сорбируемому материалу исследуемый образец и инкубируют полученную смесь. Разделяют адсорбируемые и неадсорбируемые фракции инкубируемой смеси и к первой из них добавляют меченые антитела к Т. gondii. Вторую смесь также инкубируют и затем разделяют адсорбированную и неадсорбированную ее фракции. В первой определяют присутствие меченого антитела (США, патент N 4361647).

Недостатками выполнения данного иммунологического теста является его многоэтапность, дороговизна, необходимость иммунизации животных для получения иммунных специфических к T.gondii сывороток и F (ав1)2 фрагмента либо моноклональных антител, которые используются в качестве "подложки".

Целью настоящего изобретения является упрощение способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов Т. gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА.

Поставленная цель достигается тем, что иммунную сыворотку к токсоплазмам получают от больных людей хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения (повышение температуры, увеличение периферических лимфатических узлов, головная боль, сильная слабость) отбирают сыворотку в количестве 5-10 мл от одного больного и определяют титры специфических антител НМФА и в ИФА. Сыворотку с высоким титром специфических токсоплазменных антител (≥ 1:640 в НМФА или ≥ 1:3200 в ИФА) инактивируют при 56oC в течение 30 мин и центрифугируют при 13000 об/мин для удаления аггрегированных белков в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и помещают на мешалку. Добавляют равный объем 20% раствора полиэтиленгликоля, тип 6000. После экспозиции 20 мин при комнатной температуре осадок отделяют центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема. Снова добавляют равный объем раствора ПЭГ и после экспозиции центрифугируют повторно. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема (5 мл). Добавляют 1% хлороформа, перемешивают, помещают в холодильник и через 2 часа центрифугируют при 13000 об/мин - 30 мин. Надосадочная жидкость представляет собой раствор иммуноглобулина (Ig). Осуществляют метку флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в соотношении Ig:ФИТЦ 20:1.

Полученные таким образом иммуноглобулины в разведении 1:256 - 1:2000 способны обнаруживать антигены токсоплазм как в клиническом материале от больных, так и в патологоанатомических образцах от плода при поздних выкидышах и от мертворожденных детей.

Примеры конкретного выполнения.

I. Отбор сывороток
1. У больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения проводят забор крови в количестве 5-10 мл.

2. Определяют титры антител к токсоплазмам в сыворотке крови в НМФЛ или ИФА.

3. При наличии специфических антител в титре ≥ 1:640 в НМФА или ≥ 1: 3200 в ИФА выделяют иммуноглобулин двухкратным осаждением 20% раствором ПЭГ.

4. Метят в соотношении Ig: ФИТЦ - 20:1.

5. Определяют рабочее разведение полученного конъюгата Igтокс -ФИТЦ.

II. Обнаружение T.gondii в образце мочи новорожденного с подозрением на токсоплазмоз.

1. Пробу мочи от новорожденного центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин и осадок (10 мкл) наносят на предметное стекло.

2. Фиксируют спиртом или ацетоном 15 мин.

3. Наносят Igтокс - ФИТЦ, в рабочем разведении 1:256 в количестве 10 мкл.

4. Экспозиция 30 мин при 37oC во влажной камере.

5. Отмывают физиологическим раствором 3 раза по 5 мин.

6. Промывают дистиллированной водой.

7. Высушивают.

8. Просматривают в ЛЮМ микроскопе после нанесения на препарат монтирующей жидкости.

III. Проверка специфичности - см. таблицу.

Результаты проверки специфичности флуоресцирующих токсоплазменных иммуноглобулинов даны в табллице.

В результате предлагаемого способа были получены иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам (Igтокс-ФИТЦ) с высокой активностью (1:256 - 1:2000) и специфичностью, позволяющие экспрессно обнаружить в прямом варианте МФА токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 5 мл специфической токсоплазменной сыворотки достаточно на 1000 исследуемых образцов. Полученный препарат сохраняет свои свойства на протяжении 12 месяцев.

Похожие патенты RU2174233C1

название год авторы номер документа
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS. MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ТЕРМОСТАБИЛЬНОМУ ПОВЕРХНОСТНОМУ АНТИГЕНУ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА 1997
  • Прохватилова Е.В.
  • Храпова Н.П.
  • Тихонов Н.Г.
RU2116344C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРОВ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ 2002
  • Пашанина Т.П.
  • Напалкова Г.М.
  • Корсакова И.И.
RU2212038C1
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПРЕСС-ТЕСТА НА ТОКСОПЛАЗМОЗ ЖИВОТНЫХ И ЭКСПРЕСС-ТЕСТ НА ТОКСОПЛАЗМОЗ 2018
  • Новак Михаил Дмитриевич
  • Енгашев Сергей Владимирович
  • Гончаров Дмитрий Борисович
  • Козыренко Ольга Вячеславовна
  • Куликова Ольга Леонидовна
  • Енгашева Екатерина Сергеевна
RU2704973C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОСТНАТАЛЬНОЙ ЦИТОМЕТАЛОВИРУСНОЙ И ТОКСОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ 1993
  • Вольф В.Е.
  • Левкович М.А.
RU2077056C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТОКСОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ 2006
  • Аксенов Олег Алексеевич
  • Ушакова Галина Михайловна
RU2319152C2
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ Burkholderia cepacia И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ ДРУГИХ ВИДОВ БУРКХОЛЬДЕРИЙ И ПСЕВДОМОНАД 2004
  • Будченко Анатолий Александрович
  • Илюхин Владимир Иванович
  • Храпова Наталья Петровна
  • Сенина Татьяна Васильевна
RU2281501C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТОКСОПЛАЗМОЗА У СОБАК И КОШЕК 2004
  • Новикова Татьяна Валентиновна
RU2287154C2
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ТЕРМОСТАБИЛЬНОМУ АНТИГЕНУ, ОБЩЕМУ ДЛЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА 1997
  • Прохватилова Е.В.
  • Храпова Н.П.
  • Тихонов Н.Г.
  • Кулаков М.Я.
RU2117043C1
СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ФАЗ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ 1996
  • Осипова З.А.
  • Аксенов О.А.
RU2134422C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ К ТОКСОПЛАЗМАМ 2022
  • Пацула Юрий Иванович
  • Старостина Ольга Юрьевна
  • Нурпейсова Алия Хаиргельдыновна
RU2797361C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 174 233 C1

Реферат патента 2001 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТОКСОПЛАЗМОЗА

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для обнаружения токсоплазм в патологическом материале прямым методом флуоресцирующих антител (МФА). Задача настоящего изобретения заключается в упрощении способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов T: gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА. Сущность изобретения состоит в том, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет, в количестве 5-10 мл, с титрами антител НМФА ≥ 1: 640 или в ИФА ≥ 1: 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Ig : ФИТЦ 20:1. Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ позволяет получить иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам с высокой активностью (1: 256 - 1:2000), специфичностью и способностью экспрессно обнаружить токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, в прямом варианте МФА, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 174 233 C1

Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза, включающий выделение из сыворотки иммуноглобулинов, отличающийся тем, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет в количестве 5-10 мл, с титрами антитела в НМФА > 1 : 640 или в ИФА > 1 : 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, и метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Igтокс-ФИТЦ-20 : l.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2001 года RU2174233C1

US № 4361647 A1, 13.11.1982
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ВРОЖДЕННЫХ ИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ 1995
  • Аксенов О.А.
  • Осипова З.А.
  • Иванова В.В.
  • Камальдинова Э.Г.
RU2089910C1
EP 0431541 A2, 06.12.1991
Способ размножения копий рисунков, текста и т.п. 1921
  • Левенц М.А.
SU89A1
АУТЕНШЛЮС А.И., СТОЛЯРОВА В.М., ГАВРИЛОВА Л.А
Критерии лабораторной диагностики бактериальных инфекций и токсоплазмоза у новорожденных и детей раннего возраста
- Новосибирск, 1994, с.39-49
БОЙД У
Основы иммунологии, Из-во Мир
- М., 1960, с.562-568.

RU 2 174 233 C1

Авторы

Пашанина Т.П.

Напалкова Г.М.

Мананков В.В.

Даты

2001-09-27Публикация

1999-12-30Подача