СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ Российский патент 2003 года по МПК A23L1/30 A23L1/305 A23L1/304 A23J3/08 A23J3/00 A23J3/34 A23J3/32 A23J1/00 

Изобретение относится к технологии получения биологически активных соединений, а именно к способу йодирования белков природного происхождения. Йодированные белки применяют в качестве концентрированного природного источника биологически доступного йода и профилактики йоддефицитных состояний человека.

Существующие способы [1-3] получения йодированных белков делятся на химические и энзиматические (ферментативные). Общим для всех способов является превращение малоактивного отрицательного иона йода (I^-) в более активные его формы типа катиона (I⁺) или свободного йода (I₂), которые замещают водород в аминокислотных остатках (тирозина, гистидина и концевых аминокислот белков). Механизм такого превращения до конца еще не ясен. Различия в основном состоят в использовании разных агентов для превращения йодида в более реакционноспособную форму.

Многочисленные химические методы [4] йодирования белков, широко используемые в экспериментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной биологии, биотехнологии, медицины, ветеринарии и т.д., нельзя использовать для производства биологических субстанций, обогащенных йодом, с целью последующего их использования для профилактики йоддефицитных состояний по следующим основным причинам:
- при химическом йодировании используются потенциально опасные химические реагенты (Хлорамин-Т, хлорид йода, хлор, гипохлорид, йодоген и т.д.);
- образование в процессе йодирования различных побочных продуктов реакции, в т.ч. свободных радикалов;
- использование в больших количествах вышеперечисленных сильных окислителей обеспечивает эффективность проведения процесса йодирования, что приводит к повреждению белков;
- "нефизиологичность" проведения процесса в целом делает практически невозможным получение конечного продукта без примесей несвязанного йода (I^-, I₂).

Способ энзиматического (ферментативного) йодирования белков [5-7] включает введение йода в белки в присутствии фермента лактоперексидазы. В данном случае йодирование белков осуществляется в присутствии следов перекиси водорода, а также без восстановителей. Преимущество этого способа йодирования заключается в том, что йодированные биополимеры не так сильно "повреждаются" по сравнению с химическим способом.

К основным недостаткам ферментативного способа относятся:
- сложные в техническом отношении методы приготовления реагентов и условия проведения реакций;
- относительная его дороговизна;
- отсутствие эффективного способа очистки белков от неорганического йода (I^-,I₂).

- невозможность масштабного получения легкорастворимых неденатурированных пищевых белков, содержащих йод в органически связанной форме.

Известен способ [8] производства пищевых добавок на основе йодированных белков, включающий обезжиривание молока, его стерилизацию, введение добавок, ферментативное или химическое йодирование белков, осаждение белков, их сушку и расфасовку. Наиболее близким к предлагаемому является способ [9] получения биологически активной добавки к пище для профилактики йоддефицита, представляющий собой йодированный белок природного происхождения с органически связанной формой йода, включающей процесс йодирования путем смешивания белкового сырья с водным раствором неорганического йода с обработкой химическими реагентами (йодистый хлор или хлорамин Т, или хлорамин Б) или ферментами, его последующее осаждение, фильтрацию, а затем сушку полученного йодированного белка.

Однако данные способы многоэтапны, требуют значительных сырьевых, трудовых и временных затрат, и в целом не могут обеспечить получение легкорастворимых неденатурированных йодированных пищевых белков в промышленных объемах. В отличие от предлагаемого известный способ [9] не позволяет получать в промышленных объемах целевой продукт с оптимальными органолептическими показателями, такими как отсутствие специфического запаха йода, физико-химическими, такими как воспроизводимое содержание органически связанного йода и отсутствие побочных продуктов реакции, технологическими, такими как хорошая растворимость, и биологическими, такими как неденатурированное состояние белка в конечном продукте.

Задачей предлагаемого способа является упрощение и удешевление промышленного процесса получения неденатурированных растворимых йодированных пищевых белков без примесей химических реагентов и несвязанного йода с одновременным увеличением их выхода, применяемых в качестве добавок, предназначенных для профилактики йоддефицитных состояний человека.

Поставленная задача решается тем, что процесс йодирования предусматривает смешивание белкового сырья (смесь обезжиренного свежего молока и белков природного происхождения в соотношении 1:(0,1-10) и водного раствора неорганического йода в соотношении (2-40):1 к общему белку, с дальнейшей обработкой полученной смеси в присутствии буферной смеси реагентов - комплекса минеральных солей NaCl и фосфатов Na и К с поддержанием рН раствора 5-8 при температуре 18-45^oС смесью ферментов, иммобилизованных на полупроницаемых мембранах или на инертных носителях. Именно данное соотношение белкового сырья и йода и использование буферной смеси реагентов обеспечивает получение по заявленному способу оптимальных результатов. Выбранный диапазон рН обусловлен природой белков и их физико-химическими свойствами. Отклонение от указанных значений не позволяет достигнуть заявленного технического результата. Процесс ферментации осуществляют при непрерывном контроле свободного и органически связанного йода. После окончания процесса йодирования водный раствор белков сливают и производят его фильтрацию, включающую макро-, микро- и последующую диафильтрацию раствора на ультрафильтрационной установке при рН 6,8-7,2, при этом процесс диафильтрации ведут при постоянном контроле остаточного количества свободного йода в растворе, затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке с получением целевого продукта.

В частном случае предлагаемый способ отличается тем, что процесс диафильтрации осуществляют при температуре 10-15^oС.

Предлагаемый способ позволяет получать легкорастворимый (в течение нескольких минут) в любом водном растворе порошок без характерного запаха йода. Высокая растворимость йодированного белка определяется тем, что йодирование ведется при температуре 18-45^oС и постоянном рН, который обеспечивается специальной буферной смесью реагентов - комплексом минеральных солей NaCl и фосфатов Na и К, при этом не используется осаждение белков, а процесс сушки целевого продукта осуществляют с помощью сублимационной сушилки. Отсутствия в конечном продукте примесей несвязанного йода и побочных продуктов реакции добиваются за счет эффективной фильтрации, включающей макро-, микро- и последующую диафильтрацию раствора на ультрафильтрационной установке, при этом процесс диафильтрации ведут при постоянном контроле остаточного количества свободного йода в реакционной смеси. В связи с этим предлагаемый способ позволяет получить целевой продукт белого цвета (йодсодержащие органические соединения не имеют цвета). Максимальную эффективность йодирования белков обеспечивают с помощью смеси специально подобранных ферментов, иммобилизованных на полупроницаемых мембранах или на инертных носителях. Использование свежего коровьего молока позволяет обеспечить реакцию дополнительным количеством фермента - лактатпероксидазы, а также оптимизировать рН реакционной смеси. В целом применение вышеуказанных приемов позволяет получать йодированный белок в промышленных масштабах с сохранением их основных физико-химических и физиологических свойств.

Основные физико-химические и санитарно-гигиенические показатели йодированных пищевых белков представлены в таблицах 1-3. Анализ массовой доли йода в белках разными методами (титрование, колориметрия, спектрофотометрия, ионометрия, ионообменная хроматография, рентгенорадиометрия, нейтронно-активационный анализ) показывает, что в зависимости от происхождения белков предлагаемый способ позволяет обеспечить постоянно воспроизводимое из цикла в цикл содержание органически связанного йода (2-4%) в конечном продукте. Результаты измерений, проведенных с помощью ядерно-магнитного резонанса, а также инфракрасной фурье-спектрометрии (фиг. 1-2), доказывают факт ковалентного связывания йода с аминокислотными остатками белков.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 25 л свежего коровьего молока обезжиривают с помощью сепарирования в течение 10-20 мин при 6-12 тыс.об/мин. Далее осуществляют процесс йодирования путем добавления в молоко соевых белков в соотношении 1:5 (к общему белку), водного раствора неорганического йода в соотношении 4:1 (к общему белку), буферной смеси реагентов - комплекса минеральных солей NaCl и фосфатов Na и К, обеспечивающих стабильность рН смеси (рН 7,0) с помощью смеси ферментов (например, смесь лактатпероксидазы, пероксидазы хрена, каталазы), иммобилизованных на инертном носителе, при температуре 37^oС. После окончания процесса водный раствор белков сливают и производят его макро- и микрофильтрацию с последующей диафильтрацией на ультрафильтрационной установке при 10-15^oС и рН 6,8-7,2. При этом ведется постоянный контроль за содержанием остаточного количества неорганического йода в белковом растворе. Затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке. В зависимости от состава исходного сырья данный способ позволяет получить за один технологический цикл до 5 кг готового продукта.

Пример 2. 25 л свежего коровьего молока обезжиривают с помощью сепарирования в течение 10-20 мин при 6-12 тыс.об/мин. Далее осуществляют процесс йодирования путем добавления в молоко гидролизатов мышечных белков в соотношении 1:10 (к общему белку), водного раствора неорганического йода в соотношении 15: 1 (к общему белку), буферной смеси реагентов - комплекса минеральных солей NaCl и фосфатов Na и К, обеспечивающих стабильность рН смеси (рН 5) с помощью смеси ферментов (например, смеси лактатпероксидазы, пероксидазы хрена, каталазы), иммобилизованных на инертном носителе, при температуре 40^oС. После окончания процесса водный раствор белков сливают и производят его макро- и микрофильтрацию с последующей диафильтрацией на ультрафильтрационной установке при 10-15^oС и рН 6,8-7,2. При этом ведется постоянный контроль за содержанием остаточного количества неорганического йода в белковом растворе. Затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке. В зависимости от состава исходного сырья данный способ позволяет получить за один технологический цикл до 10 кг готового продукта.

Пример 3. 25 л свежего коровьего молока обезжиривают с помощью сепарирования в течение 10-20 мин при 6-12 тыс.об/мин. Далее осуществляют процесс йодирования путем добавления в молоко бычьего сывороточного альбумина в соотношении 1: 7 (к общему белку), водного раствора неорганического йода в соотношении 10:1 (к общему белку), буферной смеси реагентов - комплекса минеральных солей NaCl и фосфатов Na и К, обеспечивающих стабильность рН смеси (рН 8) с помощью смеси ферментов (например, смеси лактатпероксидазы, пероксидазы хрена, каталазы), иммобилизованных на инертном носителе, при температуре 39^oС. После окончания процесса водный раствор белков сливают и производят его макро- и микрофильтрацию с последующей диафильтрацией на ультрафильтрационной установке при 10-15^oС и рН 6,8-7,2. При этом ведется постоянный контроль за содержанием остаточного количества неорганического йода в белковом растворе. Затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке. В зависимости от состава исходного сырья данный способ позволяет получить за один технологический цикл до 7 кг готового продукта.

Соответствующее масштабирование процесса за счет увеличения вместимости реактора позволяет получать сотни килограммов целевого продукта за один технологический цикл.

Таким образом, предлагаемый биотехнологический способ (ферментативный) йодирования белков обеспечивает:
- сохранение нативных свойств белков, содержащих постоянно воспроизводимое из цикла в цикл количество органически связанного йода;
- отсутствие свободного неорганического йода, а также потенциально токсичных веществ и реагентов в получаемом продукте;
- получение в промышленных масштабах биологически активной добавки к пище с содержание йодированного белка свыше 80% и с выходом конечного продукта не менее 95% к исходному белку.

Изобретение может быть использовано в области производства пищевых продуктов, в т.ч. хлебобулочных, кондитерских, макаронных, молочных продуктов, фруктовых вод, а также витаминных и минеральных комплексов.

Литература
1. Ткачева Г. А., Балаболкин М.И., Ларичева И.П. Радиоиммунохимические методы исследования. - М.: Медицина, 1983, с.39-41, 52-54.

2. Бударков В.А. и др. Радионуклидные исследования в вирусологии и микробиологии. - М.: Энергоатомиздат, 1990, с.84-89.

3. Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981, с.60-68.

4. Bolton A.E. Radioiodination techniques. - Amersham UK, 1985, p.1-88.

5. Marchalonis, J.J. An enzymic method for the trace iodination of immunoglobulins and others proteins. Biochemical Journal, 1969, v. 113, pp. 299-305.

6. Hurbard, A.L. and Cohn, Z.A. The enzymatic iodination of the red cell membrane, Journal of Cell Bilogy, 1972, v. 55, pp.390-405.

7. David.G.S. and Reisfeld, R.A. Protein iodination with solid state lactoperoxidase, Biochemistry, 1974, v.13, pp.1014-1021.

8. RU 98112204 Al. Способ производства пищевых добавок.

9. RU 2151611 С1. Средство для регулирования йодного обмена или профилактика йоддефицитных состояний.

Изобретение относится к технологии получения биологически активных соединений, а именно к способу йодирования белков природного происхождения, и может быть широко использовано для профилактики йододефицита в организме человека, в частности при производстве хлебобулочных, кондитерских, макаронных продуктов, молочных продуктов, фруктовых вод, витаминных и минеральных комплексов. Способ предусматривает смешивание белкового сырья с водным раствором неорганического йода с обработкой ферментами. В качестве белкового сырья используют смесь обезжиренного свежего молока и белков различного природного происхождения. Процесс осуществляют при 18-45^oС реакционной смесью модифицированных ферментов, иммобилизированных на полупроницаемых мембранах или на инертных носителях, и комплексом минеральных солей с поддержанием рН раствора от 5-8. Далее осуществляют макро-, микро- и диафильтрацию раствора на ультрафильтрационной установке при рН 6,8-7,2. Процесс диафильтрации ведут при постоянном контроле остаточного количества свободного йода в растворе. Затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке с получением целевого продукта; изобретение обеспечивает упрощение и удешевление промышленного процесса получения неденатурированных растворимых йодированных пищевых белков без примесей химических реагентов и несвязанного йода с одновременным увеличением их выхода. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Способ получения биологически активной добавки к пище для профилактики йододефицита, представляющей собой йодированный белок природного происхождения с органически связанной формой йода, включающий процесс йодирования путем смешивания белкового сырья с водным раствором неорганического йода с обработкой ферментами, его последующую фильтрацию, а затем сушку полученного йодированного белка, отличающийся тем, что в качестве белкового сырья используют смесь обезжиренного свежего молока и белков природного происхождения в соотношении 1: (0,1-10), а водный раствор неорганического йода берут в соотношении (2-40): 1 к общему белку, обработку полученной смеси проводят в присутствии буферной смеси реагентов - комплекса минеральных солей смеси NaCl и фосфатов Na и К с поддержанием рН раствора 5-8 и при 18-45^oС реакционной смесью ферментов, иммобилизованных на полупроницаемых мембранах или на инертных носителях, причем процесс ферментации осуществляют при непрерывном контроле свободного и органически связанного йода, после окончания процесса йодирования водный раствор белков сливают и производят его фильтрацию, которая включает макро-, микро- и последующую диафильтрацию раствора на ультрафильтрационной установке при рН 6,8-7,2, при этом процесс диафильтрации ведут при постоянном контроле остаточного количества свободного йода в растворе, затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке с получением целевого продукта. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс диафильтрации осуществляют при 10-15^oС.