СПОСОБ ОТБОРА ШТАММОВ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ БАКТЕРИЙ СО СТАБИЛЬНЫМИ ПРОИЗВОДСТВЕННО-ЦЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности молочной, пищевой и медицинской промышленности, а также к другим отраслям, и может быть использовано при отборе штаммов со стабильными свойствами, которые применяются в биотехнологических процессах кисло-молочных продуктов, препаратов и др.

Преимущества использования в биотехнологических процессах штаммов со стабильными производственно-ценными свойствами по сравнению со штаммами, не отобранными по данному признаку, заключаются в том, что они устойчиво сохраняют исходный комплекс свойств. Это способствует целенаправленному протеканию биотехнологических процессов и позволяет получать конечный продукт с заданными свойствами.

Известны способы получения закваски или консорциума микроорганизмов из конкретных штаммов бактерий, подобранных по комплексу характеристик традиционными методами и не предусматривающих прогнозирование устойчивости свойств исходных культур. Для получения этих заквасок затрачен длительный период, в течение которого исследовали их свойства. [Патент RU 93038983, А 23 С 9/12. Способ получения закваски "Истринская" /Андросова Г.И., Шаманова Г.П. - 1997.01.10; Патент RU 96110987, С 12 N 1/20, А 23 С 9/12. Консорциум микроорганизмов Propionibacterium Shermanii, Streptococcus thermophilus, Acetobacter aceti, используемый для приготовления кисло-молочных продуктов, и способ производства кисло-молочного продукта /Семенихина В.Ф. и др. - 1999.09.27.]
Известно также использование для приготовления лечебно-диетического продукта или получения лечебно-профилактических препаратов штаммов, отбираемых по определенным свойствам классическими методами, которые не предусматривают прогнозирование сохранения свойств исходных культур [Патент RU 2078815, C 12 N 1/20. Штамм бактерий Bifidobacterium breve, используемый для получения бактерийных лечебно-профилактических бифидосодержащих препаратов /Лянная А. М. и др. - 1997.05.10, бюл. 13; Патент RU 94017944, С 12 N 1/20. Штамм Lactobacillus acidophilus 13 (Арагац), используемый для приготовлеия лечебно-диетического кисло-молочного продукта /Институт микробиологии НАН Армении. - 1996.03.27].

Известен штамм - термостабильный мутант, продуцирующий D-N-α-carbamoylase, a также средства и методы получения штамма с заданным комплексом свойств (т.е. штамм стабильно синтезирующий D-N-α-carbamoylase). D-α-аминокислоты являются важнейшим ингредиетном при получении фармакологически активных веществ, пестицидов и др. Для получения термостабильного мутанта со стабильным свойствами применяли методы генной инженерии и воздействие физических факторов (высокой температуры). Показано, что свойство у мутанта стабильно сохраняется, поскольку оно детерминировано на определенных сайтах ДНК. Недостатком данного способа является то, что он предусматривает получение термостабильного мутанта продуцента только одного конкретного вещества - D-N-α-carbamoylase. [United States Patent 5877003, C 12 N 1/21. Термостабильный мутант, продуцирующий D-N-α-carbamoylase /Renata Grifantini and ectr. - 1999.03.02.]
Известен способ получения бактериальной закваски для кисло-молочных продуктов, предусматривающий получение закваски с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды, применение которой позволяет получать кисло-молочный продукт с улучшенными показателями биологической ценности.

Штаммы специально отбирают по следующим показателям: энергия кислотообразования, органолептические свойства, микропрепарат, сочетаемость культур при совместном развитии, антагонистическая активность к возбудителям желудочно-кишечных заболеваний, высокие биохимические свойства, устойчивость к высушиванию, устойчивость к ядохимикатам, способность к заселению слизистой пищеварительного тракта и толстой кишки, устойчивость к радиационному воздействию. Предлагаемый способ позволяет получать закваску, обладающую лучшим комплексом свойств, чем исходные отдельно взятые штаммы. К недостаткам данного способа получения закваски относится то, что описан способ получения одной конкретной закваски из определенных штаммов, подобранных традиционными методами и обуславливающих положительный эффект. Кроме того, ничего не говорится о стабильности сохранения свойств у применяемых штаммов молочно-кислых бактерий, а от этого зависит не только качество закваски, но и показатели получаемых кисло-молочных продуктов [Патент RU 2035872, А 23 С 9/12, С 12 N 1/20. Способ получения бактериальной закваски для кисло-молочных продуктов /Ерзинкян Л.А. и др. - 1995.05.27, бюл. 15].

Наиболее близким к предложенному по достигаемому техническому результату является способ отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильными производственно-ценными свойствами, предусматривающий изучение у исследуемых штаммов индекса фагоустойчивости, способности к ароматообразованию, синерезиса, активности сквашивания молока, энергии и предела кислотообразования, изучение плазмидных профилей исходных культур в процессе культивирования на питательной среде с последующим отбором штаммов, сохраняющих свой плазмидный профиль и производственно-ценные свойства. [Ганина В.И. Стабильные закваски - качественные и безопасные молочные продукты. Молочная промышленность. 1999, 8, с. 25-26.] Недостатком способа может быть то, что не выявлены факторы воздействия на штаммы, позволяющие выявить нестабильные штаммы и исключить их применение в производстве молочных продуктов.

Задача изобретения направлена на разработку экспресс-метода отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильными свойствами, применение которых будет способствовать целенаправленному протеканию биотехнологических процессов при переработке животного сырья.

Поставленная задача решается предлагаемым экспресс-методом, направленным на изучение индекса фагоустойчивости, способности к ароматообразованию, синерезиса, активности сквашивания молока, энергии и предела кислотообразования у штаммов до и после воздействия неблагоприятных факторов и отбор штаммов, у которых не изменились исходные свойства.

Целесообразно также в качестве неблагоприятных факторов использовать:
- культивирование штаммов в питательной среде при температуре на (10-15)^oС выше оптимальной;
- культивирование штаммов в питательной среде с бромистым этидием в концентрации (1•10^-6-5•10^-6) М при оптимальной температуре развития тестируемых микроорганизмов;
- культивирование штаммов в питательной среде с бромистым этидием в концентрации (1•10^-6-5•10^-6) М при температуре на (10-15)^oС выше оптимальной.

Определив требуемые свойства до и после воздействия неблагоприятных факторов, можно сделать заключение о стабильности сохранения изученных свойств у штаммов микроорганизмов. Время, затрачиваемое на такие исследования, в предлагаемом методе определяется периодом времени, необходимом для изучения требуемого комплекса свойств у тестируемых микроорганизмов.

Применительно к штаммам молочно-кислых бактерий использование предлагаемого метода будет способствовать отбору штаммов со стабильным комплексом свойств, уменьшению сроков отбора штаммов и заквасок, снижению трудозатрат и материальных средств для проведения такого рода работ. Поскольку до настоящего времени существующие методы позволяют отбирать штаммы с требуемым комплексом свойств только через год работы, а предлагаемый метод позволит получить результаты в течение недели, то его можно назвать экспресс-методом.

Сущность предлагаемого технического решения заключается в том, что в экспресс-методе отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильными свойствами предусматривается изучение исходных производственно-ценных свойств микроорганизмов и после воздействия на штаммы физических и химических факторов. При этом используют специальные факторы, способствующие дестабилизации генов, ответственных за проявление свойств, что позволяет сделать заключение о стабильности свойств у исследуемых штаммов бактерий микроорганизмов.

В данном методе с целью отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильными производственно-ценными свойствами используются следующие положения:
- гены, ответственные за проявление свойств бактерий, расположены (наследственно закреплены) на плазмидах (внехромосомных ДНК) и бактериальной хромосоме;
- существует взаимосвязь между изменением или утратой свойств у бактерий и изменением у них состава плазмид, о чем свидетельствуют высокие коэффициенты корреляции для штаммов молочно-кислых бактерий;
- воздействие неблагоприятных факторов (химических веществ и/или повышение температуры развития) может приводить к изменениям внутри клетки у генетически нестабильных штаммов микроорганизмов;
- изучая интересуемые свойства у исходных штаммов бактерий и после воздействия неблагоприятных факторов, можно сделать заключение о генетической стабильности штаммов, а значит и прогнозировать сохранение ими свойств в биотехнологических процессах при получении продукции (заквасок, консорциумов, кисло-молочных продуктов, биопрепаратов, БАД).

В предлагаемом методе в качестве неблагоприятных факторов используют воздействие на исследуемый штамм повышенных температур (увеличение оптимальной температуры развития изучаемого микроорганизма на (10-15)^oС); введение в питательную среду развития данного микроорганизма бромистого этидия и культивирование при повышенной температуре (выше оптимальной на 10-15^oС).

Изучение генетических характеристик у штаммов лактококков и термофильных стрептококков показало, что первые содержат бактериальную хромосому и плазмиды (внехромосомные участки ДНК), а вторые в основном содержат только бактериальную хромосому. Изучение технологических свойств у исследуемых культур, применяемых для биотехнологических процессов, показало, что штаммы термофильного молочно-кислого стрептококка более стабильно проявляют свои свойства на производстве.

Результаты воздействия неблагоприятных факторов на штаммы рода Lactococcus показаны на фиг. 1. Анализ состава плазмид, осуществляемый методом электрофореза ДНК штаммов в агарозном геле, у исходных штаммов и после действия неблагоприятных факторов показал, что одни штаммы утратили ряд плазмид (от одной до трех), а другие сохранили состав плазмид. Результаты сравнительного изучения индекса фагоустойчивости; способности к ароматообразованию; активности сквашивания молока; синерезиса сгустка, образуемого на молоке с применением изучаемых культур; энергии и предела кислотообразования у исходных штаммов молочно-кислых бактерий и после действия неблагоприятных факторов свидетельствовали о том, что свойства изменились у тех же штаммов, у которых изменился состав плазмид. Результаты исследования взаимосвязи между изменением изученных свойств и составом плазмид у штаммов молочно-кислых бактерий свидетельствовали о тесной связи между этими характеристиками. Это подтверждается полученными коэффициентами корреляции, которые составили соответственно для штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis - 0,9987; Lactococcus lactis subsp. cremoris - 0,9955; Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis - 0,9997, и линейной зависимостью (фиг. 2-4).

Пример 1. Штамм молочно-кислых бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis внести в количестве 3% в 100 см³ среды М21, тщательно перемешать и поместить в термостат на 28^oС на 16 ч, после чего изучить индекс фагоустойчивости, активность сквашивания молока, энергию и предел кислотообразования, синерезис (первый образец). Второй образец, полученный таким же образом, поместить в термостат при температуре 43^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить те же свойства. Для приготовления третьего образца внести 3% штамма в 100 см³ среды М21 с бромистым этидием (концентрация 3•10^-6 М), перемешать и поместить в термостат на 28^oС на 16 ч, после чего изучить перечисленные выше свойства. Четвертый образец подготовить так же, как и третий, перемешать и поместить в термостат при температуре 43^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Если штамм после культивирования (образцы 2-4) не изменил исходных свойств (образец 1), то его следует отобрать и использовать в биотехнологии как штамм со стабильными свойствами.

Пример 2. Штамм молочно-кислых бактерий Lactococcus lactis subsp. cremoris внести в количестве 3% в 100 см³ среды М21, тщательно перемешать и поместить в термостат на 26^oС на 16 ч, после чего изучить индекс фагоустойчивости, активность сквашивания молока, энергию и предел кислотообразования, синерезис (первый образец). Второй образец, полученный таким же образом, поместить в термостат при температуре 41^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Для приготовления третьего образца внести 3% штамма в 100 см³ среды М21 с бромистым этидием (концентрация 5•10^-6 М), перемешать и поместить в термостат на 26^oС на 16 ч, после чего изучить комплекс требуемых свойств. Четвертый образец подготовить так же, как и третий, перемешать и поместить в термостат при температуре 41^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Если штамм после культивирования (образцы 2-4) не изменил исходных свойств (образец 1), то его следует отобрать и использовать в биотехнологии как штамм со стабильными свойствами.

Пример 3. Штамм молочно-кислых бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetilactis внести в количестве 3% в 100 см³ среды М21, тщательно перемешать и поместить в термостат на 28^oС на 16 ч, после чего изучить индекс фагоустойчивости, способность к ароматообразованию, активность сквашивания молока, энергию и предел кислотообразования, синерезис (первый образец). Второй образец, полученный таким же образом, поместить в термостат при температуре 40^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Для приготовления третьего образца внести 3% штамма в 100 см³ среды М21 с бромистым этидием (концентрация 1•10^-6 М), перемешать и поместить в термостат на 28^oС на 16 ч, после чего изучить комплекс требуемых свойств. Четвертый образец подготовить так же, как и третий, перемешать и поместить в термостат при температуре 40^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Если штамм после культивирования (образцы 2-4) не изменил исходных свойств (образец 1), то его следует отобрать и использовать в биотехнологии как штамм со стабильными свойствами.

Пример 4. Штамм молочно-кислых бактерий Streptococcus thermophilus внести в количестве 3% в 100 см³ среды М21, тщательно перемешать и поместить в термостат на 42^oС на 16 ч, после чего изучить индекс фагоустойчивости, активность сквашивания молока, энергию и предел кислотообразования, синерезис (первый образец). Второй образец, полученный таким же образом, поместить в термостат при температуре 57^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Для приготовления третьего образца внести 3% штамма в 100 см³ среды М21 с бромистым этидием (концентрация 3•10^-6 М), перемешать и поместить в термостат на 42^oС на 16 ч, после чего изучить перечисленные выше свойства. Четвертый образец подготовить так же, как и третий, перемешать и поместить в термостат при температуре 57^oС, вынуть через такое же время, как и первый образец, после чего изучить тот же комплекс свойств. Если штамм после культивирования (образцы 2-4) не изменил исходных свойств (образец 1), то его следует отобрать и использовать в биотехнологии как штамм со стабильными свойствами.

Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемый экспресс-метод отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильным комплексом свойств позволяет в короткий период отбирать штаммы и закваски с требуемым стабильным комплексом свойств, значительно расширить сферу действия методов отбора штаммов, применяемых в биотехнологии.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности молочной промышленности, пищевой и медицинской промышленности, а также к другим отраслям, и может быть использовано при отборе штаммов со стабильными свойствами, которые применяются в биотехнологических процессах кисло-молочных продуктов, препаратов и др. Экспресс-метод отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильными свойствами предусматривает изучение исходных производственно-ценных свойств микроорганизмов до и после воздействия на штаммы физических и химических факторов. При этом используют специальные факторы, способствующие дестабилизации генов, ответственных за проявление свойств, что позволяет сделать заключение о стабильности свойств у исследуемых штаммов бактерий микроорганизмов. 4 ил.

Способ отбора штаммов молочно-кислых бактерий со стабильными производственно-ценными свойствами, предусматривающий изучение у тестируемых штаммов молочно-кислых бактерий индекса фагоустойчивости, способности к ароматообразованию, синерезиса, активности сквашивания молока, энергии и предела кислотообразования и плазмидных профилей культур в процессе воздействия неблагоприятных факторов с последующим отбором штаммов, у которых не изменились исходные производственно-ценные свойства и плазмидный профиль, отличающийся тем, что в качестве неблагоприятных факторов используют культивирование штаммов в питательной среде при температуре на 10-15^oС выше оптимальной или культивирование штаммов в питательной среде с бромистым этидием в концентрации 1•10^-6 М при оптимальной температуре развития тестируемых микроорганизмов или культивирование штаммов в питательной среде с бромистым этидием в концентрации (1•10^-6-5•10^-6) М при температуре на 10-15^oС выше оптимальной.