СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СЫРОВ Российский патент 2000 года по МПК A23C19/32 C12N1/20 

Изобретение относится к молочной промышленности и предназначено для использования при производстве лиофилизированных концентратов молочнокислых бактерий для выработки сыров.

При производстве сыров в качестве источника молочнокислой микрофлоры используют сухие и жидкие бактериальные закваски и концентраты, которые различаются как по общему количеству жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий (в заквасках - до 10 млрд. колоний образующих единиц в 1 г, в концентратах - сотни млрд КОЕ в 1 г.), так и по составу и соотношению отдельных компонентов микрофлоры. Это оказывает существенное влияние на интенсивность и направленность физико-химических, биохимических и микробиологических процессов, протекающих при изготовлении и созревании сырной массы, и вследствие этого на качество сыров.

Различные варианты бактериальных заквасок и концентратов, используемых в практике сыроделия включают - лактококки разновидностей Lactococcus (Lc) lactis subsp. lactis и Lc. lactis subsp. cremoris, составляющие кислотообразующую группу заквасочной микрофлоры;
- лактококки разновидности Lc. lactis subsp. diacetilactis со слабой и сильной кислотообразующей активностью и лейконостоки видов Leuc. lactis и/или Leuc. mesenteroides subsp. cremoris, составляющие "газоароматообразующую группу" заквасочной микрофлоры;
- мезофильные гомоферментативные молочнокислые палочки рода Lactobacillus (Lbc), разновидностей Lbc. plantarum и Lbc. casei;
- термофильные молочнокислые палочки видов Lbc. helveticus и Lbc. lactis;
- термофильный молочнокислый стрептококк.

Исследованиями ВНИИМС (Перфильев Г.Д., Гудков А.В., Шергин Н.А., Сорокина Н.П. Производство и применение бактериальных заквасок и препаратов в сыроделии, М. , "ЦНИИТЭИ мясомолпром СССР", 1985 г., 36 с.) установлено, что свойства произведенных заквасок и качество сыров в значительной степени определяются количественным содержанием и соотношением между кислото - и газоароматообразующими компонентами заквасочной микрофлоры, а также между Lc. lactis subsp. lactis и Lc. lactis subsp. cremoris в группе кислотообразующих молочнокислых бактерий. Соотношение между указанными разновидностями лактококков влияют на интенсивность и направленность таких важных для выработки и созревания сырной массы процессов как
- сбраживание лактозы и кислотообразование во время выработки и созревания сырной массы;
- характер образующегося сгустка, синерезис во время обработки сгустка и зерна, формирование консистенции сыра;
- протеолиз, формирование вкуса и аромата сыра.

Известен способ получения закваски "Таллинской", в микрофлоре которой доминирующее положение занимает lc. lactis subsp. cremoris (Технология сыра, справочник под ред. Г.Г.Шилера, М., "Легкая и пищевая промышленность", 1984 г. , 312 с. ). При этом рекомендуется трех пересадочный способ, включающий приготовление первичной (материнской) закваски, затем - вторичной и производственной.

В связи с низким уровнем жизнеспособных клеток в исходной (материнской) закваске, который составляет (1-3)•10⁹ КОЕ/см³, при производстве сыра требуется предварительное размножение материнской заквасочной микрофлоры путем пересадок в увеличивающихся объемах молока. Такой способ подготовки производственной закваски трудоемок, длителен (в течение 72 ч), материалоемок. При пересадочном способе приготовления существует опасность загрязнения заквасок посторонней (незаквасочной) микрофлорой и бактериофагом, изменения соотношения между составными компонентами заквасочной микрофлоры, снижения активности и неконтролируемого изменения свойство заквасок. Это отрицательно сказывается на технологическом процессе производства сыра, приводит к ухудшению качества готовой продукции.

Известен способ производства сухих бактериальных заквасок и концентратов, выпускаемых зарубежными фирмами К.Хансен (Дания) и Висби (Германия), в составе микрофлоры которых доминирующее положение занимают лактококки разновидности lc. lactis subsp. cremoris (от 55 до 100%).

Однако доля газоароматообразующих молочнокислых бактерий в составе микрофлоры указанных заквасок невелика (от 0 до 25%), а общее количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий колеблется от 5•10⁹ до 1•10¹¹ КОЕ/г. В связи с этим при беспересадочном способе приготовления производственных заквасок из сухих (например, заквасок фирмы Висби) расход сухой закваски составляет 6 г/100 л молока, а при выработке сыров в условиях отечественного производства (особенностью которого является использование низких температур созревания сырной массы) приводит к нарушению формирования рисунка (слабо развитый, мелкий, неравномерный) и аромата в сыре.

Известен также способ производства концентрата сухого мезофильных молочнокислых стрептококков БК-Углич-С (ТУ 10.02.870-90, Технологическая инструкция по производству концентрата сухого мезофильных молочнокислых стрептококков БК-Углич-С, утв. 26.09.90 г.), предназначенного для использования при производстве сыров с низкой температурой второго нагревания и др.

Способ включает селекцию микроорганизмов, приготовление питательной среды для накопления бакмассы, приготовление инокулята, накопление бактериальной массы, охлаждение, отделение от культуральной среды и смешивание ее с защитной средой, замораживание, сушку суспензии, измельчение концентрата, нормализацию, фасование, упаковывание, маркирование концентрата. Содержание молочнокислых бактерий в концентрате составляет (2-3)•(10¹¹КОЕ/г). Применение его в сыроделии возможно для приготовления производственной закваски беспересадочным способом или после кратковременной (в течение 2-4 ч) активизации в молоке, или путем непосредственного внесения в смесь для выработки сыра.

Однако указанным способом получают концентрат мезофильных молочнокислых стрептококков с преимущественным содержанием лактококков разновидности Lactococcus lactis subsp. lactis, причем в состав микрофлоры не входят лейконостоки.

Наиболее близким техническим решением (выбранным в качестве прототипа) по совокупности существенных признаков является способ получения бактериального препарата для сквашивания молока при производстве сыра (авторское свидетельство СССР N 1409195). Способ предусматривает внесение в среду инокулята культур лактококков разновидностей Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования, Lactobacillus plantarum и лейконостоков, культивирование с накоплением микрофлоры, отделением микробных клеток от культуральной среды центрифугированием. Отделенную биомассу смешивают с защитной средой, замораживают и высушивают сублимацией.

Известный способ обеспечивает повышение качества целевого продукта и санитарно-гигиенических показателей сыров.

Однако в составе его микрофлоры из кислотообразующих микроорганизмов преобладает Lactococcus lactis subsp, lactis.

Следует отметить, что сыры, выработанные с закваской, в микрофлоре которой доминирующее положение занимает Lc. lactis subsp. cremoris, обычно отличаются нежной консистенцией, хорошо выраженным сырным вкусом и ароматом, в них реже наблюдаются такие дефекты, как кислый вкус, жесткая, резинистая консистенция, самокол, горечь. Этот вид молочнокислых стрептококков обладает рядом преимуществ по сравнению с Lc. lactis subsp. lactis: способствует образованию сметанообразного сгустка, более прочному удерживанию влаги, что уменьшает опасность получения слишком сухого зерна и грубой консистенции. Массовый автолиз клеток Lc. lactis subsp. cremoris в сыре начинается намного раньше, чем у Lc. lactis subsp. lactis, что способствует более быстрому высвобождению внутриклеточных ферментов, принимающих участие в созревании продукта. Культуры Lc. lactis subsp. cremoris более резистентны к бактериофагу из-за высокой штаммовой специфичности атакующих их фагов (Г.Д. Перфильев, А.В. Гудков, Н.А. Шергин и др. Производство и применение бактериальных заквасок и препаратов в сыроделии. М., ЦНИИТЭИмясомолпром, 1985 г., 36 с.).

Задача состоит в улучшении технологических свойств бактериальных препаратов, повышении их активности и качества вырабатываемых сыров.

Целью изобретения является разработка способа получения лиофилизированного концентрата молочнокислых бактерий для производства сыров, представляющего собой консорциум лактоккоков и лейконостоков, в котором донирующее положение занимают культуру лактококков, разновидности Lc. lactis subsp. cremoris при общем содержании жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в 1 г не менее 1,1•10¹¹ КОЕ.

Сущность изобретения заключается в том, что питательную среду инокулируют культурами лактококков и лейконостоков Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris Lc. lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования, Leuc. mesenteroides subsp. cremoris и/или Leuc. lactis в соотношении 0,8:5,4:0,08:0,25:0,20. При одновременном внесении лейконостоков видов Leuc. lactis и Leuc. mesenteroides subsp. cremoris их используют в соотношении 1:1. Накопление бактериальных клеток ведут при температуре 24-26^oC в две стадии: на первой стадии продолжительность процесса составляет 4-6 ч, а на второй - 8-10 ч, причем полученную на первой стадии биомассу помещают в питательную среду, объем которой превышает в 6-10 раз таковой, используемый на первой стадии.

Выбор параметров процесса накопления бактериальных клеток обусловлен физиолого-биохимическими и ростовыми особенностями микроорганизмов формируемого консорциума.

В частности, известно, что лактококки разновидности Lc. lactis subsp. cremoris имеют по сравнению с Lc. lactis subsp. lactis более сложные питательные потребности и отрицательно реагируют на отсутствие или недостаток различных факторов роста, изменение температуры культивирования.

Сравнительные испытания эффективности роста ряда культур Lc. lactis subcp. cremoris в различных питательных средах показали, что наиболее активно культуры Lc. lactis subsp. cremoris размножались и развивались в питательной среде следующего состава (%):
лактоза - 1,20 ± 0,25
цитрат натрия - 1,20 ± 0,25
марганец сернокислый - 0,02 ± 0,05
кукурузный экстракт (разбавленный водой 1:1) - 1,1 ± 0,2
молоко, гидролизованное протосубтилином с массовой долей сухих веществ (4,5±1,55)% - 96,48 ± 0,2
pH среды - 7,0 ± 0,2 ед. рH
Результаты сравнительных исследований по изучению ростовых характеристик лактококков при культивировании их в описанной выше среде, приведенные в табл. 1, показывают, что при одинаковой дозе инокулята, равном (1,0±0,1)%, особенностями развития культур Lc. lactis subsp. cremoris по сравнению с Lc. lactis subsp. lactis и Lc. lactis subsp. diacetilactis (сильными кислотообразователями) является более длительная лагфаза, короткий репродуктивный этап развития (фаза ускоренного роста + лог-фаза + фаза замедленного роста), составляющий у lc. lactis subsp. cremoris (9±2) ч, Lc. lactis subsp. lactis - (13±2) ч, у Lc. lactis subsp. diacetilactis (15±2) ч.

Исходя из приведенных данных и анализа особенностей развития различных разновидностей лактококков, учитывая разную эффективность процесса их культивирования (по максимальной плотности популяций монокультур) и различия в оптимальной температуре для роста и размножения были проведены исследования по совместному выращиванию лактококков при разных температурных режимах. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что наиболее высокая скорость накопления биомассы молочнокислой микрофлоры наблюдается при температуре (30±1)^oC. Однако для Lc. lactis subsp, cremoris в процессе культивирования постоянно уменьшается до 5 - 8% от общего количества КОЕ, что характерно для таких бакконцентратов как БК-Углич-N4 и БК-Углич-С. В наибольшей степени Lc. lactis subsp. cremoris сохранился при выращивании комбинаций молочнокислых бактерий при температуре в интервале 34 - 26^oC.

Учитывая изложенное, определены режимы накопления биомассы микробного консорциума, включающего лактококки и лейконостоки с доминирующим положением Lc. lаctis subsp. cremoris, предусматривающие выращивание комбинаций при 24 - 26^oC в течение 8 - 10 ч после расширения объема культивирования при исходном внесении инокулята, состоящего из Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. diacetilactis (с высокой кислотообразующей активностью), Lc. lactis subsp. diacetilactis (с низкой активностью кислотообразования), Leue. lactis (и/или Leuc mesentericus subsp. cremoris) в соотношении 5,4:0,8:0,08:0,25:0,20 соответственно.

Изучение микробиологических характеристик полученных концентратов показало, что общее количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в 1 г бактериальной концентратов составило (1,3±0,2)•10¹¹ КОЕ, в том числе доля лактококков разновидности lc. lactis subsp. cremoris составляет 30-50% от общего количества единиц образующих колоний.

Предлагаемый способ получения концентрата молочнокислых бактерий для производства сыров включает отбор культур локтококков разновидностей Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования по следующим показателям: кислого-, газо- и ароматообразующая активность, отношение к сычужному ферменту, способность не образовывать горькие пептиды, отсутствие взаимного антагонизма между подбираемыми культурами, фагоустойчивость, отношение к комбинированному температурному режиму, липолитическая активность, органолептические характеристики. Из отобранных культур готовят исходный инокулят, представляющий собой молочные монокультуры, вносят его в малый ферментер со стерильной питательной средой, причем соотношение культур Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования, Leuс. mesenteroides subsp. cremoris и/или Leuc. lactis устанавливают равным 0,8:5,4: 0,08:0,25:0,20 соответственно, накопление бактериальных клеток ведут при температуре 24 - 26^oC в течение 4 - 6 ч на первой стадии (в малом ферменте) и 8-10 ч на второй с увеличением объема питательной среды в 6-10 раз и автоматическим поддержанием активной кислотности культуральной среды на уровне (6,5±0,2) ед. pH путем нейтрализации образующейся кислоты раствором гидроокиси натрия с массовой долей NaOH (28±2)%. По окончании культивирования среду охлаждают и центрифугируют, полученную биомассу суспендируют в соотношении 2:1 с защитной средой, замораживают и сушат под вакуумом до массовой доли сухих веществ 95 - 96%, после чего препарат измельчают, фасуют и упаковывают.

Примеры осуществления способа.

Пример 1.

Отбор культур Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. diacetilactis и Leuc. mesenteroides sibsp. cremoris производят согласно Инструкции по подбору микрофлоры бактериальных заквасок и концентратов в производстве сыров, утвержденной Первым заместителем директора Департамента пищевой и перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода России 16.08.1994 г.

В составе микрофлоры бактериального концентрата используют штаммы:
Lc. lactis subsp. lactis 916_8-5-5;
Lc. lactis subsp. cremoris T_3-9;
Lc. lactis subsp. diacetilactis с высокой скоростью кислотообразования 531₈ и низкой скоростью кислотообразования 205₃;
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 199₁₂.

Для приготовления исходного инокулята в емкости со стерильным молоком по отдельности вносят по 1% исходных культур и выдерживают при 30^oC
- культуры Lc. lactis subsp. cremoris T_3-9, Lc. lactis subsp. lactis 916_8-5-5 и Lc. lactis subsp. diacetilactis 531₈ в течение 18 ч;
- культуру Lc. lactis subsp. diacetilactis 205₃ - в течение 26 ч;
- культуру Leuc. mesenteroides subsp. cremoris 199₁₂ в течение 48 ч.

Контроль исходного инокулята ведут по времени образования сгустка и его структуре.

Для приготовления питательной среды в 750 л водопроводной воды растворяют 34 кг сухого обезжиренного молока, устанавливают pH 6,8, подогревают до 55^oC, вносят 175 г фермента протосубтилина ГЗХ с протеолитической активностью 70 ед/г, предварительно активизированного в 1 л воды при 30^oC в течение 10 минут. Гидролиз белков молока проводят при 55^oC в течение 2 ч, после чего вносят 7,5 кг лимоннокислого натрия, 7,5 кг лактозы, 120 г сернокислого марганца, 7,5 л кукурузного экстракта, предварительно разбавленного водой 1:1 и простерилизованного при 121^oC в течение 20 минут. В среде устанавливают pH 7,4 и стерилизуют при 121^oC в течение 30 минут. Подготовление монокультуры Lc. lactis subsp. cremoris T_3-9, Lc. lactis subsp. lactis 916_8-5-5, Lc. lactis subsp. diacetilactic 531₈, Lc. lactis subsp. diacetilactis 205₃, Leuc. mesenteroides subsp. cremoris 199₁₂ вносят в малый ферментер со стерильной питательной средой в соотношении 5,4:0,8:0,08:0,28:0,20 и проводят первую стадию культивирования при температуре 25^oC в течение 5 ч. На второй стадии объем культуры увеличивают путем смешивания с питательной средой в соотношении 1:10 в большом ферментере и выдерживают при температуре 25^oC в течение 9 ч с автоматическим поддержанием активной кислотности культуральной среды на уровне 6,5 единиц pH посредством нейтрализации образующейся кислоты раствором гидроокиси натрия с массовой долей NaOH 28%.

По окончании культивирования среду охлаждают до температуры 12^oC и центрифугируют на суперцентрифуге ОТР при 15000 об/мин. Полученную биомассу суспендируют в соотношении 2:1 с защитной средой на основе гидролизованного молока при следующем содержании компонентов, г/л:
сахар-песок - 100
аммоний лимоннокислый трехзамещенный - 20
кислота аскорбиновая - 5
магний сернокислый - 0,5
апилак - 0,7
Суспензию бактерий разливают в кюветы, замораживают при температуре минус 38^oC в течение 3 ч и сушат под вакуумом на сублимационной установке КС-30. Сухой препарат измельчают, фасуют и упаковывают.

Показатели полученного сухого препарата приведены в таблице 3.

Пример 2.

В результате отбора культур по вышеперечисленным показателям в состав концентрата включают следующие штаммы:
Lc. lactis subsp. lactis 265₇, Lc. lactis subsp. cremoris 591₄, Lc. lactis subsp. diacetilactis с высокой скоростью кислотообразования 607₂ и с низкой скоростью кислотообразования 202₄, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 316₂, Leuc. lactis 154₈.

С использованием отобранных штаммов готовят исходный инокулят согласно примеру 1, полученные монокультуры вносят и ферментер со стерильной питательной средой в количестве:
Lc. lactis subsp. cremoris 591₄ - 5,4%
Lc. lactis subsp. lactis 265₇ - 0,8%
Lc. lactis subsp. diacetilactis 607₂ - 0,08%
Lc. lactis subsp. diacetilactis 202₄ - 0,25%
Leuc. mesenteroides subsp. cremoris 316₂ - 0,1%
Leuc. lactis 154₈ - 0,1%
Первую стадию культивирования проводят в малом ферментере при температуре 24^oC в течение 6 ч, вторую - в течение 8 ч при увеличении объема питательной среды в 6 раз (в большом ферментере). Приготовление питательной и защитной сред, а также процессы центрифугирования и сублимационной сушки суспензии бактерий выполняют в соответствии с описанными в примере 1, после чего препарат измельчают, фасуют и упаковывают.

Показатели лиофилизованного концентрата молочнокислых бактерий для производства сыров приведены в таблице 4.

Пример 3.

В составе микрофлоры бактериального концентрата используют штаммы:
Lc. lactis subsp. cremoris 283₄;
Lc. lactis subsp. lactis 945₅;
Lc. lactis subsp. diacetilactis с высокой скоростью кислотообразования 446₇ и низкой скоростью кислотообразования 913₁₅;
Leuc. lactis 240₄
Отбор культур, подготовку питательной среды и исходного инокулята проводят аналогично примеру 1.

Полученные монокультуры вносят в ферментер со специальной питательной средой в количестве:
Lc. lactis subsp. cremoris 283₄ - 5,40%
Lc. lactis subsp. lactis 945₅ - 0,80%
Lc. lactis subsp. diacetilactis 446₇ - 0,08%
Lc. lactis subsp. diacetilactis 913₁₅ - 0,25%
Leuc. lactis 240₄ - 0,20%
Первую стадию культивирования проводят при температуре 26^oC в течение 6 ч, после чего объем культуры увеличивают, перекачивая ее в ферментер с большим объемом свежей питательной среды в соотношении 1:8 и выдерживают при той же температуре (26^oC) в течение 10 ч автоматическим поддерживанием активной кислотности культуральной среды на уровне 6,5 единиц pH. По окончании культивирования проводят охлаждение, центрифугирование, смешивание с защитной средой, сублимационную сушку по режимам, описанным в примере 1. Сухой препарат измельчают, фасуют и упаковывают.

Показатели полученного концентрата молочнокислых бактерий приведены в таблице 5.

Приведенные данные свидетельствуют о высокой активности препарата, его преимуществах по сравнению с прототипом в отношении содержания жизнеспособных клеток и соотношения культур микроорганизмов.

Предлагаемый способ получения лиофилизированного концентрата молочнокислых бактерий для производства сыров позволяет интенсифицировать процесс сквашивания молока при производстве сыра, повысить качество получаемого сгустка за счет оптимизации состава микрофлоры и вследствие этого качества сыров.

Изобретение относится к молочной промышленности и предназначено для использования при производстве лиофилизированных концентратов молочнокислых бактерий для выработки сыров. Питательную среду инокулируют культурами лактококков и лейконостоков Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования, Leuconostos mesenteroides subsp. cremoris и/или Leuconostos lactis в соотношении 0,8:5,4:0,08:0,25:0,20. При одновременном внесении лейконостоков видов Leuc. lactis и Leuc. mesenteroides subsp. cremoris их используют в соотношении 1:1. Накопление бактериальных клеток ведут при 24-26^oС в две стадии: в течение 4-6 ч на первой стадии и 8-10 - на второй, причем объем питательной среды на второй стадии увеличивают в 6-10 раз. Способ обеспечивает получение лиофилизированного концентрата молочнокислых бактерий с повышенным содержанием Lc. lactis subsp. cremoris, улучшение его технологических свойств, повышение активности и повышение качества сыра. 1 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения концентрата молочнокислых бактерий для производства сыров, предусматривающий отбор культур лактококков разновидностей Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования и лейконостоков, подготовку инокулята и питательной среды, внесение инокулята в питательную среду, культивирование, отделение микробных клеток от культуральной среды центрифугированием, смешивание с защитной средой, лиофилизацию, отличающийся тем, что из лейконостоков используют Leuconococcus lactis и/или Leuconococcus mesenteroides subsp. cremoris, соотношение культур Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. diacetilactis с высокой и низкой скоростями кислотообразования, Leuc. lactis и/или Leuc. mesenteroides subsp. cremoris в инокуляте устанавливают равным 0,8 : 5,4 : 0,08 : 0,25 : 0,2 соответственно, а культивирование бактериальных клеток ведут при 24 - 26^oC в течение 4 - 6 ч на первой стадии и 8 - 10 ч на второй, причем объем питательной среды на второй стадии увеличивают в 6 - 10 раз. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что одновременно Leuc. mesenteroides subsp. cremoris и Leuc. lactis вносят в соотношении 1 : 1.