СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ СЕЛЕКЦИОНИРОВАННОГО ШТАММА PENICILLIUM NOTATUM № 1043/2 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/14 A61K35/70 C12N1/14 C12R1/825 

Изобретение относится к области медицины, в частности к биотехнологии получения аллергенов из мицелиальных микромицетов, используемых для иммунодиагностики микогенной сенсибилизации и аллергии.

Mикромицеты широко распространены в природе. Они входят в состав ценозов окружающей среды и нормальной микробиоты человека, in vivo могут вызывать сенсибилизацию макроорганизма. Часто в роли этиологически значимых агентов респираторных аллергических заболевают выступают грибы из родов Aspergillus, Penicillium Alternaria, Cladosporium [1, 2, 3]. Перед врачом стоит задача дифференциальной диагностики этиологии микосенсибилизации, проводящейся с помощью специфических и стандартных аллергенов.

Ранее проведенные работы по получению аллергенов из мицелиальных грибов акцентированы на способах выделения аллергенов из различных субстратов, а не на способах выращивания грибов для получения аллергенов. Так, аллергены выделяли из спор и мицелия нитчатых грибов [4, 5, 6, 7, 8]; использовали для выделения фильтраты культур [9, 10], рибосомальные фракции [11], клеточные стенки грибов [12, 13, 14].

В настоящее время в клинической практике для целей аллергодиагностики используют неочищенные экстракты из мицелия и спор грибов [15]. Это снижает специфичность, и стандартность данных, полученных известными методами диагностики, и затрудняет интерпретацию результатов. Креме того, сегодня в России для микодиагностики используют коммерческие иностранные аллергенные препараты.

Цель изобретения - повышение активности белковых аллергенных компонентов, контроль и стандартизация процесса выращивания грибов.

Поставленную цель достигают рядом разработок:
1. Мицелиальные грибы выращивают в колбах при периодическом глубинном способе путем встряхивания на шуттель-аппарате 100 об/мин при 27^oС.

2. Для выращивания используют селекционированные штаммы грибов, стабильные по свойству интенсивного прорастания спор и конидий.

3. При выращивании грибов в основную питательную среду добавляют дрожжевой экстракт в концентрации 0,5% в количестве 1 мл.

4. В динамике выращивания грибов контролируют цитоморфологические изменения мицелия, накопление биомассы и белкового азота.

Отличие предлагаемого способа выращивания мицелиальных грибов от известных ранее состоит в ряде преимуществ: стандартизации и интенсификации процесса биосинтеза аллергенов, соответственно способствующих рентабельному выходу аллергеноактивных комплексов:
1. Периодическое выращивание мицелиальных грибов в глубинных условиях на колбах при перемешивании среды и мицелия путем встряхивания на шуттель-аппарате 100 об/мин при 27^oС, что способствует увеличению аэрации и интенсивному росту мицелия.

2. Применение селекционированных штаммов, стабильных по свойству интенсивного прорастания конидий и спор, что интенсифицирует накопление биомассы мицелия и образование глубинных спор в процессе выращивания грибов, увеличение белкового азота при биосинтезе аллергенов и, кроме того, создание возможности регуляции стабильных условий выращивания микромицетов для дальнейшего получения диагностических препаратов, пригодных для стандартизации и длительного хранения.

3. Направленный биосинтез - использование добавок органического азота в виде дрожжевого экстракта в концентрации 0,5% в количестве 1 мл в основную питательную среду при выращивании штаммов грибов, что интенсифицирует накопление аллергеноактивных веществ в культуральной жидкости, контролируемых по белковому азоту.

4. Разработка контроля биотехнологического процесса в динамике глубинного периодического выращивания штаммов грибов по ряду критериев: биомассе мицелия, белковому азоту, цитоморфологическим изменениям мицелия - полулизированный мицелий, гифы - тени, образование большого количества глубинных спор для фиксации максимального выхода аллергенов.

Способ осуществляется следующим образом.

Культуру мицелиального гриба селекционированного штамма предварительно выращивают на агаризованной среде Чапека Докса с 2% глюкозы в течение 7 сут при температуре 28^oС. Хорошо спорулирующую культуру используют для приготовления споровой суспензии. Споры смывают дистиллированной водой путем встряхивания на шуттель-аппарате при 100 об/мин в течение 30 мин. Споровую суспензию фильтруют через стерильный двойной бумажный фильтр. (Whatman 1). Используют взвесь, содержащую не меньше 5 млн клеток в 1 мл (подсчет в камере Горяева).

Полученный споровый материал засевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 150 мл посевной среды Сабуро с 4% глюкозы следующего состава на 1 л воды, г:
Пептон - 10,0
Глюкоза - 40,0
рН - 6,4
Посевной материал штамма гриба выращивают глубинным способом на этой среде с добавлением дрожжевого экстракта (д.э.) в концентрации 0,5% в количестве 1 мл при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате при 100 об/мин в течение 48 сут, 27^oС.

В целях накопления белковых аллергенных комплексов ферментацию проводят на среде того же состава, как и для получения посевного материала, но в меньшем объеме среды - 100 мл (для увеличения аэрации). Для глубинного периодического выращивания штамма гриба вносят 5 мл культуральной жидкости из посевных колб в ферментационную среду. Культуру при этом выращивают также при постоянном встряхивании при 27^oС в течение 22 сут. В ферментационную среду, так же как и в посевную, перед посевом грибной культуры добавляют 1 мл д.э. в той же концентрации 0,5%.

В течение культивирования гриба ведут контроль за динамикой изменения следующих параметров: биомассы мицелия, белкового азота и цитоморфологических характеристик мицелия, что определяет оптимальный сроки выращивания микромицета и оптимальное накопление аллергеноактивных веществ. Накопление биомассы определяют по сухому весу мицелия после отделения ее фильтрованием от нативного раствора и высушивания до постоянного веса. Цитоморфологию грибов изучают в препаратах культуральной жидкости с окраской метиленовым синим и НС1 - Гимза [16]. Накопление белка определяют по уровню белкового азота с реактивом Несслера [17]. Накопление аллергеноактивных веществ контролируют по количеству белкового азота, так как стандартизацию аллергенов проводят в единицах белкового азота (PNU).

Использование способа выращивания мицелиальных грибов-аллергенов иллюстрируется следующим примером на селекционированном штамме гриба Penicillium notatum Weste (1) 1043/2.

Пример. Взвесь спор гриба, численно не менее 5 млн клеток в 1 мл, засевают в колбу с посевной средой Сабуро с 4% глюкозы в объеме 150 мл. Посевной материал штамма гриба выращивают глубинным способом на этой среде с добавлением в нее перед посевом дрожжевого экстракта (д.э.) в концентрации 0,5% в количестве 1 мл при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате при 27^oС в течение 48 ч.

В качестве ферментационной среды используют среду такого же состава, как и посевная, но с меньшим объемом - 100 мл. В ферментационную среду вносят 5 мл культуральной жидкости (к.ж.) из посевной колбы. Перед засевом ферментационной среды в нее так же добавляют 1 мл д.э. в той же концентрации 0,5%. В ферментационной среде культуру выращивают глубинным способом при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате при 27^oС в течение 22-26 сут.

В период глубинного выращивания штамма гриба проводят контроль за динамикой изменения биомассы, белкового азота, цитоморфологии мицелия для определения максимальных сроков выращивания грибов и максимального накопления аллергеноактивных веществ.

Мониторингом исследуемых препаратов показано, что добавка д.э. интенсифицировала накопление биомассы мицелия, количество белкового азота и размножение штамма гриба с образованием большого количества глубинных конидий с оптимум к 22 сут выращивания гриба, когда количество биомассы увеличивалось в опыте с добавкой д.э. в 1,6 раза, белкового азота в 1,5 раза (таблица).

К концу ферментации на 22 сут добавка д.э. увеличивает количество глубинных конидий в сравнении с опытом без добавок д.э. (чертеж, а, б).

К концу ферментации биомассу отделяли от нативного раствора фильтрованием в колбе через бумажный фильтр (Whatman 1) в вытяжном шкафу. В нативном растворе определяли накопление белка (по белковому азоту с реактивом Несслера).

За критерий аллергенной активности нативного раствора гриба принято количество белкового азота, т.к. стандартизации аллергенов проводят в единицах бeлкового азота (PNU). Максимальное накопление белкового азота отмечено на 22 сут культивирования гриба в среде с добавками д.э. и составляет 4400 PNU/мл, что на 45,2% превышает количество белкового азота в сравнении с опытом без добавок д.э.

В опытах с добавками д.э. в питательную среду и без них использован селекционированный штамм Penicillium notatum 1043/2, у которого интенсивность прорастания конидий на 80% превышает данный показатель у музейного штамма 1043. Штамм 1043/2 стабилен по свойству интенсивного прорастания спор в ряде генераций [18].

Нативный раствор, отфильтрованный от мицелия на 22 сут глубинного выращивания гриба Penicillium notatum, обладал значительной аллергенной активностью. Фильтрат культуральной жидкости (к.ж.), полученный в результате разработанного способа выращивания гриба продуцента аллергена, обладает специфической активностью и стандартностью в повторных испытаниях. Преинкубация пула сывороток крови больных атонической инфекционно-зависимой бронхиальной астмой с фильтратом культуральной жидкости тормозит аллергосорбентный тест к аллергену Penicillium на 55%.

Аллергенные препараты, полученные из фильтратов к.ж. штаммов мицелиальных грибов, апробированы при обследовании больных утопической формой бронхиальной астмы, у которых наблюдалась гиперчувствительность к домашней пыли. При определении в сыворотке крови IgE- и IgG₄-антител к аллергенам грибов из родов Aspergillus, Penicilliumm Alternaria, Cladosporium, выявлено, что аллергия к домашней пыли сопровождается сенсибилизацией к исследуемым нитчатым грибам, т.е. показано, что полученные аллергены из мицелиальных грибов специфичны и достаточно активны, давая четкие результаты при обследовании больных [19, 20].

Источники информации
1. Burge H.A. Fungus allergens. Glin. Rev. Allerg, 1985, 3, р. 319-329.

2. Licorish К., Novey H.S., Kozak P., Fairshter R.D., Wilson A.F. Role of Altemaria and Peniciilium spores in the pathogenesis of asthma. J. Allergy Clin. Immunol., 1985. - vol. 76, p. 819-825.

3. Park H.S., Iung K.S., Kim S.O. Kim S.I. Hypersensitivity pneumonitis induced by Peniciilium expansum in home enviroment. Clinical and Experimental Allergy, 1994 - vol. 24 4, p.383-385.

4. Вершинин А.А., Лукашков В.М. Сравнительная характеристика аллергенов, полученных из мицелия и фильтрата культур некоторых видов Аспергиллов. Казань, 1987, с. 10.

5. Пастернак И.И., Брейсан В.Т. Аллергенность плесневых грибов. Ташкент: Медицина, 1975, с. 64.

6. Чайка Н. А. Сравнительная характеристика антигенных препаратов из плесневых грибов для выявления микотической сенсибилизации. Автореф. дис. канд. мед. наук. Л., 1969, с. 23.

7. Ojanen Т.Н., Tehro N.O., Katho M.L., Mantyjarvi R A. Allergy, 1980, vol. 35, p. 537-542.

8. Ojanen Т.Н., Tehro N.O., Mantyjarvi R.A. Allergy, 1982, vol. 37, p. 297-301.

9. Bergman I. , Bergman K., Gemeinhardt H. Erch Atmung-surgane, 1979, vol. 152, p. 146-152.

10. Hearn V.M., Wilson E.V,, Proctor A.G., Mackenzie D.W.R. J. Med. Microbiol., 1980, vol. 13. P. 451-458.

11. Philips M. E., Thurston I.K., Brogden K.A, Richard I.L. Micopathologia, 1982, vol. 77, p. 165-171.

12. Hearn V.M., Proctor A.G., Mackenzie D.W.R J. Med. Jen. Microbiol., 1980, vol. 119, p. 41-49.

13 Hearn V. M., Mackenzie D.W.R. J. Med. Microbiol., 1981, vol. 14, p. 119-129.

14. Takaza Schuzo C.О., LID-, Takesako, Kazutoh, Mizutuni, Shigetoschi, Endo, Masahiro, Kato, Jkunoshin, Takesako, Kazutoh, Mizutani, Shigetoshi, Endo, Masahiro, Kato, Jkunoshin, "Грибковые антигены" патента WО 09809990 A1, 12.03.98.

15. O Neil C.E., Horner W.E., Reed M.A., Lopez M., Evalution of Basidiomycete and Deuteromycete (Fungi Imperfekti) extracts for spared allergenic determinants. Clinical and Experimental Allergy, 1990, Vol. 20, p. 533-538.

16. Журавлева Н.П., Танкевич M.E., Жукова Р.А., Большакова Е.Н. Цикл развития и цитоморфологические особенности продуцента олеандомицина Streptomyces antibioticus. Ж. Антибиотики, 1982, 9, с. 3-5.

17. Фрадкин В, А. Диагностические и лечебные аллергены. M.: Медицина, 1990, с. 255.

18. Журавлева Н.П., Бабенко Г.А., Бегаева Н.Н. Спонтанная изменчивость популяции штаммов грибов рода Penicillium - продуцентов антигенных веществ. Ж. Микробиология, эпидемиология и иммунология, 1996, 6, с. 57-58.

19. Соболев А.В., Зуева Е.В., Бегаева Н.Н. Особенности диагностики микогенной аллергии. International Jumal on Immunorehabilitation, 14, 1999, с. 14.

20. Соболев А.В., Зуева Е.В., Васильева Н.В. Аллергия к плесневым грибам при бронхиальной астме. Там же, 14, 1999, с. 30.7

Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии получения аллергенов из мицелиальных грибов, которые используют для иммунодиагностики микогенной сенсибилизации и аллергии. Способ включает глубинное периодическое выращивание селекционированного штамма мицелиальных грибов со стабильным свойством интенсивного прорастания конидий или спор в колбах при встряхивании на шуттель-аппарате 100 об/мин при 27^oС с применением направленного биосинтеза при использовании добавок дрожжевого экстракта в концентрации 0,5% в количестве 1 мл в основную среду Сабуро, осуществляя контроль максимального выхода аллергеноактивных компонентов по накоплению биомассы, белкового азота и по цитоморфологическим изменениям мицелия в динамике выращивания грибов. Фильтрат культуральной жидкости, полученный в результате разработанного способа выращивания грибов-аллергенов, обладает высокой специфичностью и стандартностью в повторных исследованиях, что доказано при апробации на больных атопическими заболеваниями в микологической клинике МАПО и медицинских учреждениях Санкт-Петербурга и России. 1 ил., 1 табл.

Способ выращивания селекционированного штамма Penicillium notatum 1043/2 для получения аллергена, включающий глубинное периодическое культивирование штамма гриба в жидкой питательной среде в колбах, отличающийся тем, что мицелиальный селекционированный штамм Penicillium notatum 1043/2 выращивают в колбах емкостью 750 мл со 100 мл основной питательной среды Сабуро с 4% глюкозы, дополненной 1 мл 0,5% дрожжевого экстракта на шуттель-аппарате при 100 об/мин при 27^oС, и в условиях использования гриба со стабильным признаком интенсивного прорастания конидий, с параллельным контролированием динамики роста гриба по накоплению биомассы гриба, белкового азота и по цитоморфологическим изменениям мицелия - показателям максимального выхода аллергена.