ШТАММ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА ASPERGILLUS FUMIGATUS FREZENIUS 157/32-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МИКОГЕННОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ И АЛЛЕРГИИ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/14 A61K39/35 C12N1/14 C12R1/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к биотехнологии, и представляет собой селекционированный штамм микроскопического гриба, который используется в процессе получения белковых антигенов - аллергенов для иммунодиагностики микогенной сенсибилизации и аллергии.

Микромицет Aspergillus fumigatus может быть этиологически значимым фактором таких тяжелых бронхолегочных заболеваний, как бронхиальная астма, экзогенный аллергический альвеолит и аллергический бронхолегочный аспергиллез. Поэтому разработка средств ранней иммунодиагностики этих заболеваний является актуальной проблемой. Специфическая сенсибилизация организма, вызванная антигенами грибов, может быть выявлена лишь с помощью стандартных высокоактивных аллергенов, получение которых из грибов сопряжено с трудностью накопления значительных количеств мицелия и фильтратов культуральных жидкостей.

Исходный штамм Aspergillus fumigatus 157-ВКПГF, выделенный от больного, имеет низкую степень прорастания конидий в жидкой питательной среде, низкую продуктивность антигеноактивных веществ.

Цель изобретения - выделение штамма микроскопического гриба с выраженной репродукцией конидий, их интенсивным прорастанием в питательной среде с последующим максимальным накоплением биомассы и белковых антигеноактивных веществ при глубинном культивировании.

В связи с необходимостью повышения выхода антигеноактивных веществ применен метод двухэтапной естественной селекции исходного штамма гриба. I этап - селекция по свойству морфологии колоний, с отбором типичных для популяции исходного штамма, на агаризованной среде Чапека-Докса; II этап - селекция отобранных клонов из популяции штамма на первом этапе по признаку интенсивного прорастания конидий в жидкой среде Сабуро. В результате получен штамм Aspergillus fumigatus 157/32, обладающий стабильным свойством интенсивного прорастания конидий в жидкой питательной среде и высокой продуктивностью антигеноактивных веществ. В жидкой среде Сабуро с 4% глюкозы интенсивность прорастания конидий селекционированного штамма 157/32 на 46% выше исходного штамма 157. Это позволило при глубинном культивировании селекционированного штамма в колбах увеличить выход биомассы гриба и антигеннную активность нативного раствора в 1,5 раза, что определяет его прогнозируемую рентабильность.

Штамм Aspergillus fumigatus 157/32 депонирован в музее грибных культур НИИ Медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Санкт-Петербургской Медицинской академии последипломного образования и характеризуется следующими особенностями.

Культурально-морфологические свойства
Агаризованная среда Чапека-Докса с 2% глюкозы.

Колонии через 30 сут выращивания при 28^oC крупные 7-8 см в диаметре с четко- или слабовыраженными радиальными складками, поверхность войлочно-бархатистая, темно-оливково-серого цвета, "подошвенная" сторона (реверзум) желтого цвета.

Конидиальные головки типичные колонковидные, компактные. Конидиеносцы скученные, короткие, 300-400 мкм дл., 5-8 мкм шир., с гладкой клеточной стенкой зеленого оттенка, постепенно расширяющиеся к верхушке. Апикальная часть конидиеносца фляжковидная, 20-30 мкм в диаметре, одинаковая по цвету с конидиеносцем. Стеригмы одноярусные, формируются только в центре апикальной части, занимая не более 2/3 ее изогнутой поверхности, плотно прижаты друг к другу, располагаются по оси, параллельной оси конидиеносца размером 5,7 х 2,5 мкм. Конидии шаровидные 2,5 х 3,0 мкм, в массе темно-зеленые, шероховатые.

Жидкая среда Сабуро с 4% глюкозы
Рост гриба при 27^oC, при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате, в виде мелких, гладких, шарообразных колоний, состоящих из переплетенных нитей мицелия светло-желтого цвета. Конидии прорастают на 13 часов выращивания микромицета.

Физиологические свойства
Отношение к углеводам. На среде Придхэма-Готтлиба гриб хорошо развивается в присутствии глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннита, рамнозы, инозита, галактозы, сорбита, сахарозы.

Биохимические свойства
Фильтрат культуральной жидкости гриба на 41 сут глубинного выращивания имеет следующие характеристики: максимальное накопление белков - 540 мкг/мг, углеводов - 136 мкг/мг, соотношение углеводов и белков 1/4. Относительное содержание белков с различными изоэлектрическими точками (pI) составляет: 0,4 усл.ед. для белков с pI = 3,5-4,5; 0,1 усл.ед. для белков с pI = 5,0-5,5 и 0,1 усл.ед. для белков с pI = 7,5 - 8,5.

В процессе культивирования штамма происходило закисление культуральной жидкости до pH 4,5 (при исходном pH среды 6,4) за счет накопления кислых белков, что предотвращало возможную бактериальную контаминацию выращиваемого объекта.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

Пример. Aspergillus fumigatus штамм 157/32 предварительно выращивали на агаризованной среде Чапека-Докса с 2% глюкозы в течение 7 сут при температуре 28^oC. Полученный споровый материал засевали в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 150 мл посевной среды Сабуро с 4% глюкозы следующего состава на 1 л воды, г: пептон - 10,0, глюкоза - 40,0, pH - 6,4.

Посевной материал штамма гриба выращивали на этой среде при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате при 27^oC в течение 48 сут.

В целях накопления белковых антигенов ферментацию проводили на среде того же состава, как и для получения посевного материала, но в меньшем объеме среды - 100 мл. Для глубинного выращивания штамма гриба в ферментационную среду вносили 5 мл культуральной жидкости из посевных колб. Культуры при этом выращивали также при постоянном встряхивании при 27^oC в течение 41 сут. Как в посевную, так и в ферментационную среду перед посевом грибной культуры добавляли 1 мл дрожжевого экстракта в концентрации 0,5%. К концу ферментации биомассу отделяли от нативного раствора фильтрованием через бумажный фильтр (Whatman N 1). В нативном растворе определяли накопление белка по белковому азоту с реактивом Несслера.

Критерием аллергенной активности нативного раствора гриба послужило количество белкового азота, так как стандартизация аллергенов проводится в единицах белкового азота (PNU). Накопление белкового азота у селекционированного штамма было выше на 51% по сравнению с исходным. В начале процесса биосинтеза антигенов количество белкового азота составляло 3,5 • 10^-2 мг/мл, а к концу ферментации увеличивалось до 7,3 • 10^-2 мг/мл.

Нативный раствор через 41 сут глубинного культивирования гриба обладает аллергенной активностью и преинкубация его с пулом сывороток крови больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом тормозит реакцию PACT (аллерго-сорбентный тест) на 55%.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой штамм микроскопческого гриба Aspergillus fumigatus Frezenius 157/32. Штамм получен методом двухэтапной естественной селекции по признаку интенсивного прорастания конидий. Новый штамм может быть использован в биотехнологическом процессе получения белковых антигенов-аллергенов для изготовления аллергенных препаратов для иммунодиагностики микогенной сенсибилизации и аллергии.

Селекционированный штамм микроскопического гриба Aspergillus fumigatus Frezenius 157/32, используемый в биотехнологическом процессе получения белковых антигенов-аллергенов, и изготовление из него аллергенного препарата, применяемого в иммунодиагностике микогенной сенсибилизации и аллегрии.