ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER-ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штамма гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты. Селекционированный штамм Asp. nider ВКМП F-713 является активным кислотообразователем в условиях глубинной ферментации сахарсодержащих субстратов. Удельная продуктивность по лимонной кислоте и выход от сахара увеличены за счет существенного изменения морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств нового штамма.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм гриба Asp. nider ВКМП F-326 продуцент лимонной кислоты, обладающий высокой биосинтетической активностью по лимонной кислоте при глубинной ферментации мелассных сред, продуцируя до 9,9 кг с 1 м³ в сут лимонной кислоты. При этом конверсия сахаров в лимонную кислоту достигает 88,2% Однако этот наиболее продуктивный по лимонной кислоте штамм F-326 по своим технико-экономическим показателям уступает предлагаемому штамму [1]
Высокая биосинтетическая активность селекционированного штамма связана с вновь приобретенными морфолого-биохимическими свойствами. Селекционированный штамм F-713 отличается от всех известных промышленных штаммов способностью при глубинном культивировании формировать очень мелкие гранулы. Так, на 1 см³ культуральной среды у штамма F-713 их формируется в два раза больше, чем у штамма F-326. Такая структура мицелия за счет увеличения поверхности контакта с питательной средой и улучшения условий аэрации позволяет повысить конверсию сахаров в лимонную кислоту и усилить биосинтетическую деятельность гриба.

Цель изобретения получение суперштамма Aspergillus niger с высоким уровнем кислотообразования и способного формировать гранулированный мицелий при глубинном культивировании.

Новый штамм Aspergillus niger F-713 селекционирован с помощью УФ-лучей из промышленного штамма Aspergillus niger F-326 с последующим закреплением вновь приобретенных свойств искусственным отбором спонтанно возникающих вариантов.

Штамм F-713 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ВНИИГенетика.

Штамм F-713 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм F-713 по своим морфологическим признакам существенно отличается от всех ранее известных промышленных штаммов. На сусло-агаре штамм F-713 через 5 сут выращивания при 32^oC образует колонии диаметром в среднем 4,3-0,2 см. Воздушный мицелий развит слабо, поэтому опушенность колонии низкая. Окраска колонии желто-бежевая, в центре диаметром 2,8-0,1 см более темная зона, окаймленная полосой лимонного цвета шириной 2 3 мм. В центре диаметром 3 мм складчатый участок колонии, возвышающийся над остальными. Конидиеношение обильное. Обратная сторона колонии гладкая. Конидиальные головки круглые, диаметром 92-8 мкм. Вздутия конидиеносцев эллипсоидно вытянутые размером (22-4) x (15-3) мкм. Стеригмы двуслойные. Размер стеригм первого порядка - (15-3) x (6,6-0,3) мкм, второго (11,3-0,9) x (2,6-0,4) мкм. Диаметр конидий 3,66-0,04 мкм. Оболочка конидий желто-бежевой окраски. Конидиеносцы прямые, бесцветные длиной от 20 до 500 мкм, шириной 11,2-0,1 мкм.

Физиолого-биохимические свойства.

Физиологические особенности штамма F-713:
Аэроб.

Температурный диапазон роста 18-40^oC. Оптимальная температура роста 32-2^oC.

Развивается при pH 2,5-7,2.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например, пептон, белок, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину, а также ассимилирует азот минеральных солей, предпочтительнее соли аммония, нитраты.

Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает и растет на мальтозе, глюкозе, сахарозе, фруктозе, D-ксилозе, D-маннозе, в меньшей степени усваивает декстрин, сорбит, крахмал, D-раффинозу и плохо растет в лактозе.

Хорошо хранится в виде высушенных колоний (до 5-10% остаточной влажности) или в виде культуры, выращенной на сусло-агаре.

Генетические особенности (ауксотрофность) прототроф.

Штамм F-713 идентифицирован по Определителю грибов рода Aspergillus [2]
Штамм F-713 фенотипически отличается от штамма прототипа Aspergillus niger ВКПМ F-326, а именно, предлагаемый штамм на сусло-агаре образует компактные колонии диаметром в 2 раза меньше, чем у прототипа и других штаммов, селекционированных на более ранних ступенях селекции. Морфологические отличия нового штамма следующие: вздутия конидиеносцев в отличие от шаровидных в прототипе эллипсоидно вытянутые и в два раза меньше по размеру, в два раза длиннее стеригмы второго порядка и в четыре раза короче конидиеносцы. Эти отличительные особенности нового штамма, в частности, образование более компактных колоний на сусло-агаре и более мелких мицелиальных гранул в ферментационной среде при культивировании на качалке сохраняются и в условиях производства, в которых предлагаемый штамм также формирует мелкие гранулы, что способствует увеличению поверхности активного кислотообразования на единицу объема среды и удельной его продуктивности.

Сущность изобретения поясняется следующим конкретными примерами использования штамма F-713.

Пример 1. Ферментацию мелассных сред с помощью нового штамма осуществляли в лабораторных условиях на качалке с числом качаний 165-5 мин^-1 в колбах Эрленмейера емкостью 700 см³ при 32-1^oC. Инокулюм выращивали на мелассной среде следующего состава, г/дм³:
Свекловичная меласса 60,0
Оксалат аммония, дигидрат 2,14
Сульфат аммония, 7-водный 0,25
Дигидроортофосфат калия 0,16
Вода водопроводная до 1 дм³
pH 6,2
Используемая меласса содержала 50 г ферментируемых сахаров и 1,41 кальция (в пересчете на CaO) на 100 г.

Ферментационная среда приготавливалась по выше приведенной прописи и дополнительно содержала гексацианоферроат калия 0,2 г/дм³ и сульфат цинка, 7-водный 0,005 г/дм³. Сульфат магния исключен.

Состав среды для подпитки г/дм³:
Свекловичная меласса 500
Гексацианоферроат калия 1,67
Подращивание инокулюма осуществляли путем засева 50 см³ питательной среды гомогенной суспензией конидий штамма F-713 из расчета 0,001 г конидий на 1 см³ среды. Длительность выращивания инокулюма составляла 24 ч. На стадии ферментации 50 см³ питательной среды засевали 10 см³ инокулюма. В процессе ферментации проводили подпитку культуры в два этапа: первую через 24 ч, вторую через 30 ч ферментации от начала посева, вводя по 10 см³ питательной среды на каждом этапе.

В качестве контроля взят штамм Aspergillus niger ВКПМ F-326, условия культивирования аналогичны условиям культивирования селекционированного штамма F-713. Результаты эксперимента представлены в табл. 1. Сравнительные данные таблицы показывают, что селекционированный штамм F-713 формирует примерно в 5 раз больше мицелиальных гранул на 1 см³ среды, чем штамм-прототип. Мицелиальные гранулы штамма F-713 более мелкие и площадь их поверхности в 2 раза больше. Это вновь приобретенное свойство штамма способствует лучшему контакту мицелия с питательной средой, улучшает условия аэрации и повышает продуктивность единицы биомассы. Кроме того, у селекционированного штамма возрастает на 12,7% содержание лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот. Все выше изложенные преимущества штамма F-713 позволили повысить продуктивность процесса по лимонной кислоте на 21,4% а конверсию сахаров на 12,1% по сравнению с показателями, достигнутыми в этих же условиях штаммом прототипа.

Пример 2. Условия проведения эксперимента как в примере 1. Отличие состоит в том, что в процессе ферментации исключается дополнительная подпитка культуры мелассным раствором, а вместо этого в ферментационную среду перед засевом инокулюм вводят 20 см³ раствора пищевого кристаллического сахара с концентрацией 250 г/дм³. Это позволяет упростить технологию ведения процесса и исключить возможность инфицирования культуры при подпитке. Кроме того, замена части мелассы на пищевой кристаллический сахар ведет к значительной активации процесса. Так, по данным, представленным в табл.1 (пример 2) при таком способе ведения процесса сохраняются все преимущества штамма F-713 по сравнению со штаммом F-326 и значительно возрастают абсолютные показатели процесса по сравнению с достигнутыми в примере 1. Масса лимонной кислоты, полученная за цикл, возрастает у штамма F-713 с 4,09 до 5,70 г, а конверсия сахаров с 62,9 до 83,8% Эти же показатели при использовании прототипа возросли с 3,39 до 5,22 г и с 50,8 до 76,8% соответственно.

Пример 3. Условия проведения эксперимента как в примере 2. Отличие состоит в том, что вместо пищевого сахара использовали сахар-сырец. Результаты эксперимента представлены в табл.1. Преимущества предлагаемого штамма также очевидны и не уступают результатам примера 2.

Пример 4. Условия проведения эксперимента как в примере 1. Отличие состоит в том, что вместо свекловичной мелассы использовали тростниковую. Образец тростниковой мелассы содержал, г/100 г: ферментируемый сахар 37,6 кальций в пересчете на CaO 1,3; pH 5,2.

Полученные результаты, представленные в табл. 1, показывают, что при ферментации тростниковой мелассы биосинтетическая активность штаммов снижается по сравнению с показателями, полученными при применении свекловичной мелассы. Тем не менее и в этих условиях новый штамм продуцирует за цикл на 20,7% больше лимонной кислоты, чем известный штамм и на 7,4% повышает конверсию сахаров за счет вновь приобретенных полезных свойств.

Пример 5. Условия проведения эксперимента как в примере 2. Отличие состоит в том, что вместо свекловичной мелассы использовали тростниковую. При таком способе ведения процесса массовая доля лимонной кислоты в сумме синтезированных кислот возросла у штамма F-713 с 70,6% (пример 4) до 83,1% (пример 5), конверсия сахаров с 43,3 до 58,2% соответственно (табл.1). Удельная продуктивность предлагаемого штамма по лимонной кислоте в этих условиях составила 11,8 мг/см³•сут), что превышает продуктивность прототипа на 16,8
Пример 6. Условия опыта как в примере 5. Отличие в замене пищевого сахара на сахар-сырец полупродукт в производстве сахара из тростника. В данном примере показатели снижаются по сравнению с предыдущим примером, однако они значительно выше показателей, полученных при ферментации только тростниковой мелассы (пример 4) и сравнимы с показателями при применении в качестве сырья свекловичной мелассы (пример 1).

Таким образом, селекционированный штамм F-713 позволяет получать высокие технико-экономические показатели при ферментации различных сахарсодержащих сред, что делает его перспективным продуцентом не только для отечественной промышленности, но и для стран, обладающих большими запасами тростниковой мелассы, но не использующих ее для производства лимонной кислоты из-за отсутствия высокопродуктивного штамма.

Пример 7. Ферментацию проводили в условиях поверхностного культивирования в химических стаканах с площадь дна 0,4 дм². Высота слоя ферментируемого раствора 9 см (объем 330 см³). Длительность ферментации 8 сут. Температура окружающего воздуха в период ферментации 32-1^oC. Наряду со штаммами F-236 и F-713 испытывали штамм F-204 [3] применяемый в промышленности при поверхностном культивировании.

Состав ферментируемых сред г/дм³ (табл.1).

Результаты ферментации этих сред, оптимальных по составу для максимального проявления кислотообразующей способности прототипа, предлагаемого штамма и штамма F-204, представлены в табл.2 (пример 7). Показано, что селекционированный штамм F-713 превосходит штаммы F-326 и F-204 как по удельной продуктивности, так и по способности к конверсии сахаров в лимонную кислоту, причем при меньшей биомассе у предлагаемого штамма. Таким образом, штамм F-713 эффективен и при поверхностном культивировании, что подтверждается последующими примерами.

Пример 8. Условия ферментации как в примере 7. Отличие в замене пищевого сахара на глюкозу. Это привело к снижению кислотообразования у обоих штаммов, но и в условиях примера 8 предлагаемый штамм активнее прототипа на 20,1% при этом выход кислоты от сахара у нового штамма повысился на 9,6% (абсолютных). У обоих продуцентов наблюдалось замедление роста биомассы в первые сутки ферментации.

Пример 9. Условия ферментации как в примере 8. Отличие в том, что с целью ликвидации замедленного роста мицелиальной пленки в первые сутки ферментации часть глюкозы в количестве 30 г/дм³ заменена на пищевой кристаллический сахар. Эта замена способствовала нормальному формированию мицелиальной пленки и привела к увеличению удельной продуктивности по лимонной кислоте с 908 (пример 8) до 1000 (пример 9) у прототипа и с 1091 до 1293 мг/м³•сут соответственно у предлагаемого штамма, т.е. новый штамм оказался продуктивнее прототипа на 29,3%
Пример 10. Условия ферментации как в примере 7. Отличие состоит в том, что в качестве сахарсодержащего сырья использовалась свекловичная меласса образца примера 1 для штаммов F-236 и F-713 и образца мелассы для штамма F-204, на которых они проявляли максимум активности.

Состав ферментационной среды для штаммов F-236 и F-713, г/дм³:
Свекловичная меласса 300,0
Гексацианоферроат калия гидрат 1,0
Оксалат аммония, гидрат 11,7
Трилон Б 0,2
Сульфат цинка, гидрат 0,005
Дигидроортофосфат калия 0,1
Вода водопроводная до 1 дм³
pH 6,8
Состав образца мелассы для штамма F-204, г/100 г: ферментируемый сахар 48,5, в т.ч. инвертный 1,4; CaO 0,85; pH 6,0.

Состав ферментационной среды, г/дм³:
Меласса свекловичная 310
Гексацианоферроат калия гидрат 1,2
Трилон Б 0,2
Дигидроортофосфат калия 0,1
Сульфат цинка, гидрат до 0,005
pH 7,0
Длительность ферментации для всех трех штаммов 7 сут.

Результаты, представленные в табл.2, показывают, что вновь селекционированный штамм в этих условиях уступает штамму F-204, используемому при промышленном производстве лимонной кислоты из свекловичной мелассы поверхностным способом ферментации, по массовой доле лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот. Однако, за счет значительного повышения биосинтетической активности у нового штамма увеличивается продуктивность по лимонной кислоте на 21,1% и на 14,2% (абсолютных) возрастает конверсия сахаров в лимонную кислоту. По этим же показателям штамм F-713 превосходит и прототип.

Пример 11. Условия ферментации как в примере 10. Отличие в том, что в качестве сахарсодержащего сырья использована тростниковая меласса, характеристика образца которой дана в примере 4.

Состав ферментационной среды, г/дм³:
Меласса тростниковая 400,0
Гексацианоферроат калия гидрат 2,03
Оксалат аммония, гидрат 11,1
Трилон Б 0,075
Сульфат цинка, гидрат 0,005
Дигидроортофосфат калия 0,08
Вода водопроводная до 1 дм³
pH 7,0
Результаты ферментации, представленные в табл.2, показывают, что селекционированный штамм F-713 эффективно ферментирует тростниковую мелассу, причем показатели по продуктивности сравнимы с полученными при ферментации свекловичной мелассы.

В данном примере и во всех выше приведенных штамм F-713 по окончании ферментации имеет более высокую массовую долю лимонной кислоты в общей сумме синтезируемых кислот. К концу ферментации предлагаемый штамм, как правило, накапливал меньшую или равную биомассу по сравнению с прототипом, что способствовало снижению затрат на сырье.

Таким образом, приведенные примеры 1-11 показывают, что новый штамм эффективен как в условиях глубинного, так и поверхностного культивирования при ферментации свекловичной и тростниковой меласс, пищевого сахара, сахара-сырца, глюкозы и их смесей.

Пример 12. Выращивание посевного инокулюма и ферментацию мелассных сред осуществляли методом погруженной культуры в производственных условиях. Питательные среды приготавливали на основе свекловичной мелассы по рецептам примера 1.

Инокулюм выращивали в посевных ферментаторах емкостью 5 м³. Объем мелассной среды 3 м³, длительность выращивания 24 ч. Подготовленный инокулюм переводили в ферментатор емкостью 50 м³ с 27 м³ ферментационной мелассной среды. Через 24 ч ферментации начинали основную подпитку культуры, вводя по 1 м³ среды через каждые 1,5 ч. Суммарное количество сахара, введенное в ферментатор с подпиткой, 2000 кг. На пятые-шестые сутки ферментации производили отъем сферментированного раствора в объеме 5 м³, а для подпитки культуры и продления цикла вводили концентрированный по сахару 200 г/дм³ мелассный раствор в том же объеме. Длительность ферментации 8,7 9 сут.

Результаты испытаний, отображенные в табл.3, показывают, что предлагаемый производству штамм F-713 обладает рядом преимуществ: при практически одинаковой длительности процесса ферментации удельная продуктивность превышает прототип на 14,7% причем снижается удельный расход сырья на 10,9% конверсия сахаров в лимонную кислоту увеличивается на 8,6% В условиях производства, как и в лабораторных новый штамм синтезировал мицелий, отличающийся по своей структуре от прототипа, в виде очень мелких гранул. Штамм F-326 в условиях производства образовывал диффузный мицелий.

Таким образом, новый штамм за счет существенных отличительных морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков имеет преимущество перед производственным. Штамм F-713 универсален, эффективно синтезирует лимонную кислоту из свекловичной и тростниковой меласс, пищевого сахара, сахар-сырца, глюкозы и их смесей. Предлагаемый штамм одинаково продуктивен как при глубинном, так и при поверхностном способах ферментации. Высокие технико-экономические показатели его при ферментации различных сахарсодержащих субстратов делает предлагаемый штамм перспективным не только для отечественной промышленности, но и зарубежной, в частности для стран, обладающих большими запасами тростниковой мелассы, отходов сельскохозяйственной и пищевой промышленности и не использующих их из-за отсутствия высокорентабельного продуцента.

Использование: микробиологическая промышленность, производство лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм Aspergillus niger ВКПМ F-713 - продуцент лимонной кислоты, способный ферментировать сахарсодержащее сырье как в условиях поверхностного, так и глубинного культивирования. Штамм синтезирует лимонную кислоту как из мелассы, пищевого сахара, сахара-сырца глюкозы, так и их смесей. Новый штамм превосходит родительский штамм по продуктивности на 9 - 41% в зависимости от используемого сырья и способа ферментации. 4 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F 713 продуцент лимонной кислоты.