Настоящее изобретение относится к применению в медицине лектина Robinia pseudoacacia (RPA), в частности, для получения выделенного гомополипептида лектина Robinia pseudoacacia, составов, содержащих лектин Robinia pseudoacacia, к применению лектина Robinia pseudoacacia для получения медикамента, предназначенного для уменьшения и/или лечения заболевания, к способу регулирования, уменьшения и/или лечения заболевания, а также к диетическому продукту или к диетической добавке, которые содержат лектин Robinia pseudoacacia.
Лектины представляют собой белки или гликопротеины, которые отличаются способностью распознавать специфические глико-сопряженные структуры (Pusztai, 1991). Некоторые перорально принимаемые лектины обладают устойчивостью к перевариванию в желудке и поступают в кишечник в исходном состоянии. В кишечнике лектины могут присоединяться к углеводным структурам, содержащимся на поверхности различных клеток слизистой оболочки кишечника (Pusztai et al. , 1995). Присоединение лектина к клеткам кишечника может иметь различные последствия. Так, например, биологическая реакция может зависеть от введенной дозы. При высоких дозах лектин фасоли обыкновенной (РНА) вызывает обратимое расстройство ворсинок эпителиальных клеток. Оно быстро восстанавливается с помощью эндогенных процессов. Аналогично этому в присутствии большого количества РНА в тонкой кишке наблюдается чрезмерный рост эндогенных Escherichia соli. Кроме того, увеличиваются липидная мобилизация и окисление глюкозы, а синтез белка в скелетных мышцах уменьшается. Однако при более низких дозах РНА наблюдается повышенная скорость образования клеток крипты, вызывающая гиперпластичные новообразования в кишечнике (Bardocz et al. , 1995), но без вредных воздействий, которые проявляются при высоких дозах.
Robinia pseudoacacia (черная псевдоакация) представляет собой растение из семейства бобовых, встречающееся в Северной Америке и Центральной Европе. Robinia pseudoacacia вырабатывает лектины в коре, корнях, корневых клубнях, флоэме древесине и листьях (Geitl and Ziegler, 1980), а также в семенах (Van Damme et al. , 1995b). Функция лектинов точно не известна, однако, предполагается, что лектины могут использоваться для сохранения азота в периоды покоя (Yoshida et al., 1994). Известно также, что зимой содержание лектина в коре повышается. Учитывая известную токсичность лектинов Robinia для млекопитающих (Nishiguchi et al., 1997), возможно также, что лектины коры действуют зимой в качестве защитного механизма от травоядных, в частности, от кроликов.
Лектины коры и семян Robinia pseudoacacia описаны как на биохимическом, так и на молекулярном уровне (Van Damme et al., 1995a, 1995b). Лектин корней также был выделен и описан (Duverger et al., 1997). Лектины Robinia pseudoacacia (полученные главным образом из семян) широко применяются в основном для диагностических и исследовательских целей. Специфическое свойство RPA связывать углеводы (N-ацетил-галактозамин) используется для исследования состава углеводов в биологических тканях (Raedler et al., 1997). Митогенные свойства RHA используются в лабораторных биологических исследованиях выделенных лимфоцитов (Sabeur et al., 1986, Sharif et al., 1978 & 1977). Banach et al. (1983) показали, что интраперитональные дозы RPA вызывают у мышей гепатоксический эффект, включая быстрое падение гликогена в печени. Pusztai (1993) также показал, что RPA прочно связывается со стенками кишечника крыс, вызывая увеличение поджелудочной железы, и предположил, что RPA может повреждать стенки кишечника, способствуя чрезмерному разрастанию бактерий кишечной группы и вызывая панкреатит.
Лектины коры Robinia pseudoacacia можно исследовать, используя ряд методик гелевой сепарации, определения последовательности оснований в ДНК и последовательности аминокислотных остатков в белках (Van Damme et al., 1995a). Природный лектин коры, извлеченный вымыванием из колонны, состоит из двух лектинов, RPbAl и RPbAll, которые совместно очищаются с кажущейся молекулярной массой 120 кДа. Анализ на геле SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле) указывает на то, что он состоит из двух подгрупп, полипептида а и полипептида b, с молекулярной массой 31,5 и 29 кДа, соответственно. RPbAl является тетрамером, который включает всевозможные сочетания полипептидных мономеров а и b. Полипептиды а и b дополнительно исследовали с помощью клонирования кДНК и определения последовательности оснований, используя стандартные методики. Прогнозированные последовательности полипептидов а и b в белках показаны на фиг. 1.
RPbAll является тетрамером, состоящим из одинарного мономерного полипептида с (подгруппа) с молекулярной массой 26 кДа. Полипетид с исследовали дополнительно, при этом последовательность оснований в кДНК и прогнозированная последовательность аминокислотных остатков в белках также показана на фиг. 1.
Семена Robinia pseudoacacia содержат два лектина RPsAl и RPsAll, которые совместно очищаются с кажущейся молекулярной массой 120 кДа (Van Damme et al. , 1995b). Анализ SDS PAGE обоих лектинов указывает на то, что каждый из них состоит из одной мономерной подгруппы (34 и 29 кДа, соответственно). Лектины семян исследовали с помощью методик клонирования кДНК и определения последовательности оснований, при этом прогнозированная последовательность аминокислотных остатков в белках показана на фиг. 2. В опубликованной недавно работе о лектинах корней показано, что они состоят из двух лектинов (Duverger et al., 1997). Лектины корней отличаются от лектинов семян и коры тем, что представляют собой двумерные молекулы, обозначаемые как RPrAl и RPrAll, с молекулярной массой 58 и 63 кДа, соответственно. RPrAl является гетеродимером, который состоит из двух подгрупп с молекулярными массами 31 и 29 кДа, а RPrAll - гомодимер, состоящий из одной подгруппы с молекулярной массой 30 кДа.
Исследования лектинов Robinia pseudoacacia привели к некоторому расхождению результатов, касающихся точной молекулярной массы и состава подгрупп отдельных лектинов. Wantyghem et al. (1986) определили два лектина семян - димер RPA 1 и тетрамер RPA 3. Однако в том же году Fleischman et al. (1986) описали выделение двух тетрамерных лектинов, обозначенных RPA 1 и RPA 2, с аналогичными молекулярными массами подгрупп. Таким образом, оказалось, что лектины могут существовать в формах мономера, димера, тримера и тетрамера.
Мукоциты образуют слизистую оболочку, которая представляет собой влажную оболочку, покрывающую многие трубчатые структуры и полости живого организма. Они включают слизистое покрытие кишечника, рта, носового хода, пищевода, желудка, легких, тонкой кишки и толстой кишки (включая прямую кишку). Важность слизистых оболочек для жизнедеятельности организма давно установлена. Однако регулирование пролиферации мукоцитов и не-мукоцитов никогда прежде не рассматривалось в качестве подхода к множеству физиологических проблем, включая больные и поврежденные клетки и/или ткани. Известен ряд заболеваний мукоцитов, в том числе, когда деление клеток ускоряется или замедляется, когда мукоциты повреждены или когда отсутствует защитный наружный слой, в частности, слизистая оболочка. Состояния, которые относятся к аномальному регулированию роста мукоцитов, могут включать рак кожи, псориаз, синдром раздраженной толстой кишки, воспалительные заболевания и воспаление слизистой оболочки.
Воспаление слизистой оболочки - болезненное и ослабленное состояние, при котором быстро растущие эпителиальные и слизистые клетки оказываются пораженными, а наружный слизистый слой удаляется и/или не замещается достаточно быстро. Воспаление слизистой оболочки может явиться следствием инфекции микроорганизмов, которые присутствуют, например, в ротовой полости или в кишечнике. В данном тексте термин воспаление слизистой оболочки включает все поражения кишечника (которые могут проявиться как следствие поражения слизистой оболочки). Это состояние наблюдается как основной побочный эффект при лечении рака. Распространение и тяжесть воспаления слизистой оболочки может возрастать при увеличении циклов терапии раковых заболеваний и в конечном счете может оказывать влияние на эффективность лечения и на выживание пациента. Решение, которое предлагает настоящее изобретение, использует защитные свойства тканей и метаболическое влияние лектинов на биологический материал.
Больные и пораженные клетки, которые не могут восстанавливаться или регенерировать достаточно быстро, могут представлять собой серьезную опасность для здоровья и потенциальную угрозу жизни. Нарушения обмена веществ, в частности, ожирение, гипергликемия, сердечно-сосудистые заболевания, удары и желудочно-кишечные заболевания, включая слизистый колит, воспаление кишечника и заболевания брюшной полости также представляют собой проблему поддержания нормальных функций клеток.
Существует множество причин заболеваний и повреждений клеток и тканей. К агентам, повреждающим клетки, относятся: химиотерапевтические агенты, радиотерапия, химикаты (органические и неорганические), токсины, кислоты, щелочи, источники излучения, свободные радикалы, которые могут вызывать нарушения вследствие попытки хирургического или терпевтического лечения альтернативного, более проблематичного заболевания. Лечение рака является классическим примером поражения клеток и/или тканей организма в качестве побочного эффекта других процедур. Лечение рака основано главным образом на применении химиотерапии или радиотерапии отдельно или в сочетании с оперативным вмешательством. Химиотерапия использует цитотоксичный агент для непосредственного поражения ДНК клетки-мишени. Если в ткань-мишень, т.е. в опухоль, поступает достаточная доза цитотоксичного агента, то неправильное восстановление ДНК может привести к накоплению мутаций ДНК, паталогическим изменениям и хромосомным аберрациям, которые в конечном итоге вызывают смерть клетки. Радиотерапия использует радиоактивное излучение либо для непосредственного поражения ДНК клетки-мишени, либо использует потенциал ионизирующего излучения для получения свободных радикалов, которые могут разрушить цепи ДНК (Steel, 1996). Таким образом, применение химиотерапии или радиотерапии является компромиссной попыткой нанести максимальное повреждение раковым клеткам путем направленного излучения, не вызывая необратимого разрушения нормальной ткани.
Химиотерапия и радиотерапия являются наиболее широко применяемыми способами лечения рака, при этом коэффициенты выживания ограничены рядом факторов. Ключевой фактор заключается в том, что цитотоксический препарат или излучение не делает различия между нормальной и раковой тканью. В большинстве случаев невозможно дать достаточную дозу цитотоксического препарата или излучения, чтобы надежно убить все злокачественные ткани, поскольку это оказалось бы летальным для пациента. Обычные побочные эффекты для существующих терапевтических режимов включают потерю волос, подавление костного мозга, тошноту, рвоту и диарею (Paulsen et al., 1996). Кроме того, имеется множество случаев, когда применение радиотерапии, в особенности в области таза, вызывало изменения желудочно-кишечной функции (Yeoh et al., 1993) и долговременные нарушения кишечника, которые требуют оперативного вмешательства (van Halteren et al., 1993).
Основной прорыв был сделан в течение последних 10 лет с появлением факторов кроветворного роста. Сейчас стало возможным вводить более высокие дозы цитотоксичных препаратов, а затем спасать ткани, в частности костный мозг и белые кровяные тельца, путем введения рекомбинантных факторов роста, в частности, гранулоцитмакрофагоцитного колониестимулирующего фактора (Erkisis et al. , 1996). Такой подход позволил усовершенствовать прогнозируемые и достигаемые коэффициенты выживаемости. Эпидермально-специфические факторы роста, в частности, эпидермальный фактор роста, известны, однако, сложность природы регулирования кишечных культур затрудняет развитие методик интенсивного "спасения" кишечника (Podolsky, 1993). Поскольку в настоящее время не существует соответствующих факторов роста для кишечника, поражение желудочно-кишечного тракта цитотоксическими препаратами и излучением стало ограничивать их дозы.
Настоящее изобретение решает поставленные задачи путем обеспечения новым и эффективным продуктом и его применения, что позволяет реализовать положительное и регулируемое культивирование в биологическом материале, а также самого биологического материала.
Согласно первой задаче изобретение предлагает лектин Robinia pseudoacacia для применения в медицине. Область применения в медицине является весьма широкой. Она включает регулирование пролиферации мукоцитов, уменьшение и/или лечение нарушений, вызываемых агентом, поражающим клетки, уменьшение и/или лечение нарушений обмена веществ или сочетание двух или нескольких из перечисленных выше факторов. Применяемый в настоящем тексте термин "уменьшение" означает любой эффект, который в некоторой степени смягчает какое-либо нарушение или медицинское расстройство, и включает предотвращающее воздействие (профилактическое применение). Применяемый в настоящем тексте термин "лечение" означает любое ослабление нарушения, заболевания, синдрома, состояния, боли или сочетания двух или нескольких из перечисленных выше факторов. Лечение согласно настоящему изобретению (или применение препаратов) может проводиться во время дополнительного "лечения", в частности химиотерапии и радиотерапии.
Лектин Robinia pseudoacacia особенно полезен для регулирования пролиферации мукоцитов, поскольку он обеспечивает уменьшение и/или лечение воспаления слизистой оболочки, включая поражение кишечника. Регулирование пролиферации мукоцитов особенно полезно для уменьшения и/или лечения нарушений, которые вызываются агентом, поражающим клетки. Типичные агенты, поражающие клетки, во всех задачах настоящего изобретения включают радиотерапию, химиотерапию или их сочетание. В настоящей заявке термины "излучение" и "радиотерапия" используются в одном и том же смысле и означают применение источника излучения (облучения), которое может использоваться в качестве терапевтической методики.
Изобретение особенно применимо для уменьшения и/или лечения нарушений ткани млекопитающих, более конкретно - ткани человека. Настоящее изобретение представляет собой особую важность для ткани человека в связи с существенной потребностью в радиотерапии и/или химиотерапии для лечения рака. Однако настоящее изобретение может также применяться для других живых огранизмов и биологических веществ, в частности, в ветеринарии, в том числе для сельскохозяйственных и домашних животных.
Применение в медицине Robinia pseudoacacia касается всех клеток и/или тканей и включает как клетки и ткани во всем организме, так и вне организма, в том числе изолированные клетки и ткани. Это относится ко всем биологическим объектам, включая как организмы в целом, так и их части. Изобретение относится также к веществу, которое умышленно или неумышленно подвергают воздействию какого-либо агента, поражающего клетки.
Изобретение особенно полезно для биологических веществ, которые являются чрезвычайно чувствительными для агентов, повреждающих клетки, в частности, радио- и химиотерапевтических агентов. Такие биологические вещества включают слизистые оболочки, в частности, слизистые покрытия кишечника, рта, носового хода, пищевода, желудка, легких, тонкой кишки и толстой кишки (включая ободочную и прямую кишку), эпителиальную ткань (например, покрывающую глаз), а также все остальные слизистые клетки и/или ткани и неслизистые клетки и ткани, в частности, костный мозг, селезенку, все кроветворные клетки, кроветворную ткань, тимус, ткань, вырабатывающую волосы, глазную ткань, половые пути, тестикулярно-простатную ткань, или два или несколько из перечисленных выше веществ. Настоящее изобретение в особенности относится к слизистым оболочкам, которые покрывают ткани полых структур организма, включая постоянно влажные ткани, покрывающие глаза. Чувствительность клеток и тканей к нарушению, которое вызывает агент, поражающий клетки, может быть связана с его метаболическим состоянием. Поэтому влияние фактора роста лектина Robinia pseudoacacia, в частности, на кишечник (и в особенности на тонкую кишку) представляется важным для профилактического и/или терапевтического воздействия при предварительном, одновременном или последующем введении агентов, повреждающих клетки.
Лектин Robinia pseudoacacia особенно эффективен для регулирования пролиферации мукоцитов при предварительном, одновременном или последующем применении радиотерапии, химиотерапии или их сочетания. Эффективность изобретения обеспечивается защитными и восстановительными свойствами лектина Robinia pseudoacacia.
Мукоциты представляют собой клетки, образующие все слизистые оболочки (влажные оболочки, которые покрывают многие трубчатые структуры и полости). Многие из них образуют защитный слой между внешней средой и внутренними органами живого организма. Слизистые клетки/ткани включают слизистые покрытия кишечника, рта, носового хода, пищевода, желудка, легких, тонкой кишки, толстой кишки, эпителиальную ткань, половые пути и другие. Первая задача изобретения относится ко всем из них. Другие клетки и ткани, к которым относится первая задача изобретения, включают: костный мозг, селезенку, все кроветворные клетки, кроветворную ткань, тимус, ткань, вырабатывающую волосы, глазную ткань, тестикулярно-простатную ткань, или сочетание двух или нескольких из перечисленных выше.
В соответствии с настоящим изобретением применение лектина Robinia pseudoacacia в медицинских целях может осуществляться в сочетании с агентом, защищающим клетки, - цитопротектором. В качестве цитопротектора предпочтительно использовать радиосенсибилизатор, химиопротектор (включая свободные раскислители), фактор роста или сочетание двух или нескольких перечисленных выше веществ. Из приведенного выше списка цитопротекторов предпочтительными являются следующие примеры: радиосенсибилизаторы - модификации витамина К, в частности, Синкавит или Менадион, тексаферин гадолиния или иобенгуан (([[3-иодо-13311)фенил] метил] гуанидин), химиопротекторы - Сулькрафат, цистеин, цистеамин, этиол, балазипон, раскислители со свбодными радикалами - WR 3689 дигидрофосфатный эфир (2-[[3-метиламино)пропил]амино)этандиола, AD 20 (2-[[2-метоксифенил)ацетил] амино] -2-акриловая кислота или нитроксидный антиоксидант, факторы роста - гранулоцит колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитмакрофагоцитный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), Эритропойэтин (ЕРО), эпидермальный фактор роста (EGF), кератиноцитный фактор роста (KGF), трансформативный фактор роста (TGF α и β), все интерлейкины, включая IL-11 и IL-15, инсулиноподобный фактор роста (IGF), нервный фактор роста (NGF), фактор роста производных тромбоцитов (PDGR), Бомбезин, Релаксин, Кальцитонин, фактор роста производных молозива (CDGF), амлексанокс или амоксанокс, протегрин, гидрохлорид пилокарпина, фактор стволовых клеток (STF), тромбопойэтин, steel-фактор (STF), все интерфероны, включая интерферон или любой цитокин.
Кроме цитопротектора лектин может применяться в сочетании с одним или несколькими другими соединениями/агентами (предпочтительно фармацевтическими). В частности, могут быть включены противомикробные агенты. Такие агенты могут быть включены для поражения вторичных инфекций, например, вторичных инфекций, связанных с воспалением слизистой оболочки.
Применение лектина Robinia pseudoacacia в медицинских целях особенно полезно по отношению к клеткам желудочно-кишечного тракта (как для уменьшения и для излечения нарушения, так и в отношении болезней обмена веществ). Регулирование может обеспечивать повышение функциональности и/или длины желудочно-кишечного тракта или природы и/или плотности желудочно-кишечных клеток, выделяемых поверхностными гликопротеинами. Другие области применения регулирования пролиферации мукоцитов включают снижение и/или лечение нарушения пищеварительного тракта, в частности, воспаление кишечника и синдром раздраженной толстой кишки, а также снижение и/или лечение патологических изменений кишечника и восстановление и замену мукоцитов при предварительном, одновременном или последующем проведении радиотерапии, химиотерапии или в сочетании двух или нескольких из приведенных выше факторов.
Применение указанных характеристик регулирования включает:
а) пролиферацию кишечных клеток, которая приводит к увеличению функциональной зоны кишечника и длины, что может быть полезным лечением в случае нарушения кишечной функции вследствие, например, хирургического вмешательства или травмы, и/или
б) регулирование скорости оборота кишечных клеток, которое может обеспечить регулирование природы и плотности выделяемых поверхностных соединений гликогенов, поскольку они становятся все более сложными по мере старения клеток. В связи с тем, что соединения гликогенов оказывают влияние на некоторые свойства кишечника, в частности, на склонность к присоединению бактерий, прием лектина можно рассматривать как терапевтическую или профилактическую регуляцию этих свойств.
Регулирование пролиферации клеток можно использовать, в частности, для повышения проводимости питательных веществ тонкой кишкой и/или регулирования выделения кишечных клеток соединениями гликогенов. Такие явления не обязательно являются медицинскими нарушениями, а могут быть лишь косметическими или функциональными отклонениями с более высокими или более низкими значениями относительно удовлетворительного медицинского уровня.
Такие явления могут быть также полезными для применения лектина Robinia pseudoacacia с целью уменьшения и/или лечения нарушений обмена веществ.
Нарушения обмена веществ включают все нарушения, которые связаны и/или являются результатом обмена веществ организма, в частности, ожирение и нарушения, связанные с ожирением, в том числе гипергликемия (диабет типа II), сердечно-сосудистые, удары, желудочно-кишечные и связанные с желудочно-кишечными нарушения. Нарушение обмена веществ может потребовать регулирования пролиферации мукоцитов, в альтерантивном случае регулирование пролиферации мукоцитов может быть независимым от нарушения обмена веществ. Сюда относится также снижение массы, не связанное с медицинскими показателями, которое может быть чисто косметическим.
Согласно настоящему изобретению более высокая концентрация лектина может приводить к более быстрому уменьшению и/или лечению внутренних болезней или иных немедицинских симптомов. Однако различные факторы могут оказывать влияние на предпочтительную концентрацию дозировки лектина, как поясняется ниже.
Согласно настоящему изобретению лектин Robinia pseudoacacia может находиться либо в виде природных соединений, либо очищенным от них, быть химически синтезированным или полученным по технологии рекомбинации. Лектин может быть модифицирован или представлять собой производное (природное или синтетическое). Известны способы получения лектинов как путем очистки из природных источников, так и по технологии рекомбинации (Pusztai and Palmer, 1977, Carvalho, 1993 и патент США 4889842). Лектины согласно изобретению предпочтительно являются функциональными эквивалентами "оригинальных" выделенных лектинов Robinia pseudoacacia. Функциональность любого лектина Robinia pseudoacacia можно определить в соответствии с его способностью присоединяться к специфическим гликогенным структурам. Наиболее предпочтителен полипептид лектина Robinia pseudoacacia в том случае, если он является эквивалентным (или вариантом лектина, как определено ниже), т.е. идентичным на 40%, предпочтительно на 50%, предпочтительно на 60%, более предпочтительно на 70% и еще более предпочтительно на 80% и более, по уровню аминокислот или уровню последовательности оснований в ДНК в каком-либо известном лектине Robinia pseudoacacia, например, в лектинах, представленных на фиг. 1 или 2.
Термин "вариант лектина", употребляемый в настоящем тексте, означает полипептид, который является практически гомологичным природному лектину, но имеет последовательность аминокислот, отличную от природного лектина (человека, мышей или иных млекопитающих) вследствие одного или нескольких удалений, вставок или замещений. Вариантная последовательность аминокислот предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот в природном лектине, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%. Процентное отношение идентичности можно определить, например, путем сравнения информации о последовательностях, используя компьютерную программу GAP, версия 6.0, описанную Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) и поставляемую Компьютерной группой по генетике университета штата Висконсин (UWGSG). Программа GAP использует метод выравнивания, разработанный Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970) и усовершенствованный Smith и Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981).
Поскольку лектины являются белками, они определенно подвержены дестабилизации/денатурации при воздействии ряда факторов, в частности, теплоты, кислоты, щелочи и т. п. В связи с тем, что применение лектинов согласно настоящему изобретению требует (постоянного) сохранения их белковых свойств, важно, чтобы лектины не разрушались или денатурировались полностью, предварительно или во время их применения (например, в сильно кислотной среде желудка или в слабо щелочной среде нижней кишки). В соответствии с этим, для применения лектинов согласно настоящему изобретению может потребоваться предварительный контроль их характеристик в процессе обработки и/или приема. Такой контроль проводится по стандартной методике и может быть легко выполнен любым специалистом в данной области. Концентрация лектина, необходимая для выполнения задач настоящего изобретения, будет изменяться, если лектин денатурирован или дестабилизирован каким-либо образом.
Концентрации лектинов Robinia pseudoacacia, указанные в настоящем тексте, основаны на природных свойствах лектинов при отсутствии снижения их активности за счет денатурации или дестабилизации. Таким образом, указанные концентрации не являются абсолютными, но отражают активность лектина. В соответствии с этим состав, содержащий лектин, активность которого уменьшена, например, на половину, но концентрация которого удвоена, эквивалентен составу, содержание лектина в котором уменьшено в два раза, но активность лектина не изменена. Кроме того, активность лектина можно повысить путем его модификации, например, при получении способом рекомбинации и/или путем получения усеченных мутантов, которые имеют повышенную активность. Приведенные соотношения между концентрацией и активностью лектина применимы также к лектинам с повышенной активностью. Все модифицированные лектины Robinia pseudoacacia или их производные включены в настоящее изобретениее, в том числе те из них, которые имеют увеличенную или уменьшенную активность, а также, включая, например, усеченные лектиновые подгруппы и/или различные гликозильные варианты с полной или модифицированной активностью. Кроме того, в изобретение включены последовательности остатков аминокислот белков, которые содержат одну или несколько критических аминокислот, участвующих в биологической активности лектина (предпочтительно - все указанные аминокислоты и вся биологическая активность). Так, например, последовательность аминокислот активных зон полипептида b RPA описана Nishiguchi et al., 1997 и включает (аминокислота: позиция): соль аспарагиновой кислоты: 87; дифениламин: 130; треонин: 215; лейцин: 217; серин: 218.
Лектин Robinia pseudoacacia согласно решению первой задачи настоящего изобретения может быть получен из любой части растения Robinia pseudoacacia, предпочтительно - из коры, семян, корней, корневых клубней, флоэмы, древесины или сочетания из двух или нескольких указанных частей, или быть эквивалентным лектину, полученному из этих частей. В соответствии с настоящим изобретением лектин Robinia pseudoacacia может содержать только одну полипептидную подгруппу. Такая полипептидная подгруппа может быть либо одной из известных (например, RPbAl (а или b), RPbAll (с), RPsAl или RPsAll, RPrAl или RPrAl) или их эквивалентом, либо полипептидной подгруппой, ранее не идентифицированной. Предпочтительно лектин Robinia pseudoacacia согласно первой задаче настоящего изобретения содержит мономер, димер, тример и тетрамер указанных подгрупп или сочетание из двух или нескольких указанных структур. Это позволяет имитировать полипептидные группы аналогично их природной структуре. При этом мономер, димер, тример и тетрамер могут представлять собой одинаковые или различные типы полимерных подгрупп. Тетрамер предпочтительно содержит четыре подгруппы полипептида а коры, четыре подгруппы полипептида b коры или промежуточную смесь подгрупп а и b. Полипептиды лектина могут содержать или соответствовать одной или нескольким последовательностям аминокислот, как показано на фиг. 1 или фиг. 2, предпочтительно не менее чем на 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% быть гомологичными им (как вариант лектина, описанный выше).
Решение второй задачи настоящего изобретения обеспечивает выделение лектина Robinia pseudoacacia, который представляет собой гомотетрамер, гомотример, гомодимер или мономерную подгруппу, предпочтительно очищенную до уровня 60% или более. В данном тексте термин "очищенный" означает "практически не содержащий загрязнений". Лектин Robinia pseudoacacia такого уровня чистоты предпочтительно использовать в фармацевтических составах и применять в медицине. Лектин Robinia pseudoacacia предпочтительно очищают до уровня 70, 80, 90% или выше, наиболее предпочтительно до 95, 99 или 100%. Предпочтительные характеристики, описанные выше для первой задачи изобретения, относятся также ко второй задаче.
Решение третьей задачи настоящего изобретения обеспечивает состав, содержащий лектин Robinia pseudoacacia, предпочтительно очищенный до уровня 60% (предпочтительно 70, 80, 90, 95 или 100%), или лектин RPA согласно второй задаче изобретения в сочетании с допустимым фармацевтическим наполнителем. Предпочтительно состав представляет собой фармацевтический препарат, который содержит допустимый фармацевтический наполнитель. Ряд пригодных наполнителей включает фармацевтически чистые крахмал, желатин, масло, сахар, спирт или воду (предпочтительно стерильные). Состав может представлять собой препарат, смешанный для введения, или может быть комбинированным препаратом для одновременного, раздельного или последовательного употребления (или введения). В случае комбинированного препарата лектин и все остальные компоненты могут быть раздельными и вводиться в любом порядке. Основные и предпочтительные характеристики, описанные выше для первой и второй задач изобретения, относятся также к третьей задаче. Так, например, состав может содержать лектин Robinia pseudoacacia в сочетании с цитопротектором, как описано выше.
Решение четвертой задачи настоящего изобретения обеспечивает способ получения состава согласно третьей задаче изобретения, который содержит смесь лектина с допустимым фармацевтическим наполнителем. Предпочтительные характеристики для четвертой задачи - такие же, как описаны для трех первых задач.
Решение пятой задачи настоящего изобретения обеспечивает способ применения лектина Robinia pseudoacacia для получения медикамента, предназначенного для регулирования пролиферации мукоцитов, для уменьшения и/или лечения нарушения, вызванного агентом, поражающим клетки, для уменьшения и/или лечения нарушения обмена веществ или сочетания указанных нарушений. Основные и предпочтительные характеристики, описанные выше для первых четырех задач изобретения, относятся также к пятой задаче.
Решение шестой задачи настоящего изобретения обеспечивает способ регулирования пролиферации мукоцитов, уменьшения и/или лечения нарушения, вызванного агентом, поражающим клетки, уменьшения и/или лечения нарушения обмена веществ или сочетания указанных нарушений у пациента, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение пациенту эффективного количества лектина Robinia pseudoacacia. Основные и предпочтительные характеристики, описанные выше для первых пяти задач изобретения, относятся также к шестой задаче. Предполагается, что пациенту требуется указанная методика лечения, в частности, если он будет подвергаться, подвергается или подвергался ранее радио- и/или химиотерпии, и в особенности, если он страдает раковым заболеванием.
Решение шестой задачи настоящего изобретения обеспечивает диетический продукт или диетическую добавку, включающую лектин Robinia pseudoacacia. Указанные диетический продукт и/или диетическая добавка могут применяться для решения первой задачи изобретения. Указанные диетический продукт и/или диетическая добавка могут также применяться для снижения массы, не связанного с медицинскими показаниями. Указанные диетический продукт и/или диетическая добавка могут применяться для любого живого организма, включая организм человека.
Диетический продукт и/или диетическая добавка согласно седьмой задаче изобретения предпочтительно рассчитаны на период от 2 до 5 дней или на неопределенный (длительный период). Характеристики, описанные выше для первых шести задач изобретения, относятся также к седьмой задаче.
Диетический продукт и/или диетическая добавка предпочтительно включают суммарное содержание лектина до 0,3 г, предпочтительно 0,2 г на кг массы тела в день. По меньшей мере часть лектина должна быть из Robinia pseudoacacia (предпочтительно от 1 до 100% содержания лектина в диетическом продукте или диетической добавке). Лектин Robinia pseudoacacia может быть одним из вышеописанных лектинов или сочетанием из этих двух или нескольких лектинов согласно первой задаче изобретения. Такие диетический продукт и/или диетическая добавка являются полезными в медицине, в частности, для регулирования пролиферации мукоцитов, для уменьшения и/или лечения нарушения, вызванного агентом, поражающим клетки, для уменьшения и/или лечения нарушения обмена веществ или сочетания указанных нарушений.
Диетический продукт и/или диетическая добавка согласно седьмой задаче изобретения в особенности полезны в тех случаях, когда после них следует период, в течение которого прописана высококачественная диета. Высококачественную диету согласно настоящему изобретению можно определить как диету, которая обеспечивает получение всех основных белков, жиров, углеводов, минералов и витаминов, необходимых для нормального роста живого организма. Основные компоненты предпочтительно содержатся в высококачественной диете в оптимальном соотношении. Высококачественная диета не должна содержать компонентов, которые замедляют или подавляют рост и развитие живого организма. Предпочтительной характеристикой высококачественной диеты является положительное превращение поглощенной пищи в нежирную массу тела.
Высококачественная диета предпочтительно незамедлительно или, спустя короткий период (до 2 дней), следует за циклом приема лектинового диетического продукта и/или диетической добавки согласно седьмой задаче изобретения. Высококачественная диета наиболее полезна в период до 7 дней, предпочтительно в период до 5 дней. Диетический продукт и/или диетическая добавка могут также оказаться полезными в случае применения длительного (более одного месяца, предпочтительно более одного года) лечения нарушений обмена веществ или косметического снижения массы.
При использовании в сочетании с агентом, поражающим клетки (хотя одновременный прием не является необходимым), лектиновую часть диеты лучше всего ограничить периодом до 5 дней, поскольку 48 - 72 ч могут оказаться недостаточными для завершения полного цикла работы кишечника, и при этом обеспечить достоинства более высокой степени поглощения питательных веществ и усвоения регулирующей части диеты. Часть цикла высококачественной диеты лучше всего ограничить примерно 5 днями, чтобы обеспечить максимальную эффективность переваривания пищи.
Предпочтительно повторять по меньшей мере дважды в форме циклической диеты период приема диетического продукта и/или диетической добавки, которые содержат лектин Robinia pseudoacacia, с последующим приемом высококачественной диеты. Циклы можно повторять до 20 раз, предпочтительно до 10 раз, наиболее предпочтительно до 6 раз.
Описанная циклическая диета обеспечивает временное увеличение эффективности усвоения, которое регулирует прием лектина Robinia pseudoacacia. Таким образом, за счет циклического чередования диет, содержащей и не содержащей лектин, можно стимулировать зависимость условий от питательной среды. Так, например, при соответствующем графике диет спортсмен может оптимизировать деятельность определенных функций для наиболее важных соревнований.
Диетический продукт и/или диетическая добавка согласно седьмой задаче изобретения в особенности полезны до или после лечения методами облучения и/или химиотерапии. В таких случаях диеты могут быть еще более эффективны в сочетании с одним из цитопротекторов, в частности, описанных для первой задачи изобретения. Основные и предпочтительные характеристики, описанные выше для первых шести задач изобретения, относятся также к седьмой задаче.
Решение восьмой задачи настоящего изобретения обеспечивает способы получения веществ, описанных выше во второй, четвертой и седьмой задачах изобретения. Получение очищенного лектина согласно второй задаче включает либо выделение и очистку лектина Robinia pseudoacacia из Robinia pseudoacacia (например, из растения или ткани культуры), либо синтез (например, по технологии рекомбинации). Получение состава согласно четвертой задаче включает комбинирование лектина с одним или несколькими ингредиентами препарата. Получение диетического продукта и/или диетической добавки включает получение лектина Robinia pseudoacacia и возможное комбинирование с одним или несколькими ингредиентами диетического продукта и/или диетической добавки. Предпочтительные характеристики для первых семи задач изобретения относятся также к восьмой задаче.
Для каждой из задач изобретения, где оно может быть использовано для консервативного лечения или для ввода в биологическую ткань, специальный режим дозировки в конечном итоге выбирает лечащий врач с учетом таких факторов, как применяемый лектин или лектины, тип живого организма, возраст, масса, тяжесть симптомов и/или тяжесть применявшегося или будущего лечения, способ приема, побочные реакции и/или другие противопоказания. Специфические пределы дозировки можно определить с помощью клинических исследований, выполняемых по стандартным моделям и сопровождаемых полным мониторингом хода болезни и выздоровления пациента. Такие исследования могут использовать план эскалации дозировки, принимая низкий процент максимально допустимой дозы для животных в качестве начальной дозы для человека. Предварительные указания о диапазонах дозировки можно получить из результатов, приведенных в экспериментальной части настоящего текста, а также следующими диапазонами, которые были экстраполированы для человека.
Соответствующий верхний предел представляет собой концентрацию лектина примерно до 0,3 г на кг массы тела в день. Содержание 0,3 г на кг массы тела в день может вызывать расстройство желудочно-кишечного тракта у пацента, однако, эти симптомы могут быть приемлемыми с учетом того, что пациент получает дополнительные шансы выживания при таком заболевании, как, например, раковое. Соответствующий нижний предел представляет собой концентрацию лектина около 0,0001 мг (0,1 мкг) на кг массы тела в день. Предпочтительные промежуточные концентрации доз включают содержание лектина приблизительно до 0,2, 0,15 и 0,05 г на кг массы тела в день и, соответственно, концентрации приблизительно 1, 0,5, 0,1, 0,01 и 0,005 мг на кг массы тела в день.
Медикаменты для решения всех задач настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы обеспечить требуемую концентрацию лектина за один или несколько "приемов" в день (термин "прием" включает любую форму введения препарата, а также описывает единицу дозировки). Некоторые задачи изобретения могут быть решены с помощью однократного приема при высокой концентрации лектина, в то время как другие - могут потребовать нескольких приемов, равномерно или неравномерно распределенных в пределах одного и того же периода, однако, с более низкой концентрацией лектина на один прием.
Применение лектина в каком-либо медикаменте (включая получение медикаментов) согласно настоящему изобретению может происходить в сочетании с соответствующим фармацевтическим носителем и/или наполнителем. Такие носители и/или наполнители хорошо известны (например, см. Handbook of Pharmaceutical Excipients (1994) 2nd Edition, Eds. A. Walde/P. J. Weller, The Pharmaceutical Press, American Pharmaceutical Association). Особое применение согласно настоящему изобретению имеют составы и/или медикаменты, вводимые через толстую кишку, а также жидкость для полоскания рта, крем, паста или капсула.
Медикамент, производимый согласно задачам изобретения, предпочтительно вводят через рот (перорально), назально (например, в виде назального аэрозоля) или ректально (для простоты введения в одну или несколько частей пищеварительного канала), однако, парентеральное или внутривенное введение медикамента также может быть использовано.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение.
Примеры
Получение лектина из коры Robinia pseudoacacia
Лектины коры Robinia можно получить способом, который в основном описан Van Damme et al., (1995 а), из частично очищенных экстрактов коры на иммобилизованном фетуине.
Ткань коры гомогенизировали в 20 мМ уксусной кислоты, содержащей 200 мг/л аскорбиновой кислоты (10 мл/г свежей массы), используя смеситель. Гомогенную массу продавили через марлю, откорректировали рН до 5,0 (с помощью 1М NaOH) и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Полученный плавающий сверху слой профильтровали через стекловату для удаления плавающих частиц. После добавления 1,5 г/л CaCl2 откорректировали рН экстракта до 9,0 (с помощью 1М NaOH) и выдержали с вечера до утра при 4oС. Полученный осадок удалили путем центрифугирования и откорректировали рН очищенного экстракта до 3,8 с помощью 1 М HCl. После выдержки также с вечера до утра при 4oС экстракт очистили путем центрифугирования, откорректировали рН до 7,0 с помощью 1М NaOH и довели концентрацию сульфата аммония до 1М, добавляя твердую соль. Затем раствор обезгазили и снова отцентрифугировали. Чистый плавающий сверху слой поместили в колонну с фетуином и агарозой, откорректировав 1 М сульфатом аммония (рН 7.0). После пропускания экстракта колонну промывали сульфатом аммония до тех пор, пока значение А280 не стало меньшим 0,01. После этого десорбировали лектин с помощью 20 мМ диаминпропана (рН 11). рН десорбированного лектина откорректировали до 7,0 с помощью 1 М HCl и довели концентрацию сульфата аммония до 1М, добавляя твердую соль. После центрифугирвания при 15000 g в течение 20 мин слой, плавающий сверху, поместили в колонну с фенилсефарозой, откорректировав 1 М сульфатом аммония. Загрязнения удалили промывкой 1 М сульфатом аммония и десорбировали лектин, используя линейный градиент 1 М сульфата аммония в воде. Собрали фракции и определили значение A280 для идентификации тех из них, которые содержат лектин.
Известно, что Robinia pseudoacacia вырабатывает лектин в коре как реакцию на сокращение продолжительности дня, т.е. на наступление зимы. Используя материал коры, полученной зимой, можно обеспечить выход лектина около 10 мг/г.
Получение изотипов лектина коры RPA А4 и В4
Гомотетрамерные изотипы RPA А4 и В4 можно получить, используя метод ионообменной хроматографии со ступенчатым градиентом. 100 мл колонну Hyper-D S (BioSepra) откорректировали пятью объемами 50 мМ ацетата натрия до рН 4,75. Лектин RPA, полученный описанным выше способом и высушенный при температуре менее 0oС, растворили в ацетатном буфере (50 мМ ацетата натрия, рН 4,75) и отцентрифугировали в течение 10 мин при 20000 g. Очищенный верхний слой поместили в колонну и затем промыли колонну ацетатным буфером при скорости потока 3 мл/мин. Ступенчатый градиент получали с помощью 50 мМ ацетата натрия с рН 4,75+NaCl. Добавляли NaCl с увеличением концентрации, получая ступенчатые градиенты 5, 7, 9, 12 и 100%. Фракции, содержащие лектин, отобрали путем измерения поглощения при 280 нМ. Тетрамер А4 извлекли из адсорбента в 5,7%-ной фракции соли, а тетрамер В4 - в 9-12%-ной фракции соли.
Фракции, содержащие чистый А4 или В4 проверили, используя обычные методики PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле) или SDS-PAGE.
Определение характеристик лектинов, полученных из коры Robinia pseudoacacia
Характеристики лектинов, полученных из коры Robinia pseudoacacia, можно определить, используя ионообменную хроматографию, гель-хроматографию и лабораторные исследования агглютинации клеток. Такие методики широко известны и описаны в литературе Van Damme et al., 1995a и b.
Опыты с животными
Тридцать пять молодых самцов крыс Hooded Lister (Rowett Strain) (возраст 19 дней, масса - 30-40 г) содержали отдельно в клетках с сетчатым дном. Животных кормили высококачественным полусинтетическим диетическим продуктом, содержащим 10% белка лактальбумина (таблица 1 в конце описания).
О составе смесей витаминов и минеральных веществ см. Carvalho (1992).
Диетический продукт и воду предоставляли без ограничений в любое время за исключением 19 дня, когда количество пищи ограничили 10 г на одну крысу. В 19 день масса крыс составляла 100 -104 г.
Введение RPA
Животным, которые получали предварительные дозы RPA, вводили через желудочный зонд дозу, эквивалентную 25, 50 или 100 мг RPA, в 0,9% физиологическом растворе на 1 кг массы тела (таблица 2). Предварительные дозы вводили животным в течение трех последовательных дней перед инъекцией 5-FU.
Введение физиологического раствора
Животным, которые не получали предварительных доз RPA, вводили через желудочный зонд 1 мл 0,9% физиологического раствора.
Введение 5-FU
300 мг 5-фтороурацила размешали в 14 мл дистиллированной воды. Медленно добавили 1 М NaOH до растворения 5-FU. Довели раствор до конечного объема 20 мл. Конечная величина рН раствора составляла 8,3. Путем интраперитонеальной инъекции ввели животным дозу 150 мг/кг массы тела. Незамедлительно после инъекции крысам было выдано 15 г контрольного диетического продукта.
Способность лектинов Robinia pseudoacacia при пероральном приеме защищать крыс от высокой дозы химотерапии и, в частности, их защитное влияние на ткани кишечника
Пять групп, каждая из которых включала по 5 крыс, кормили стандартным диетическим продуктом, содержащим лактальбумин (таблица 1). Одной группе крыс давали 8 г в день стандартного диетического продукта в течение трех дней, а затем ввели 5-FU в количестве 150 мг/кг массы тела (таблица 2 в конце описания).
В течение первых трех дней крыс кормили попарно, а затем - в свободном режиме, после инъекции 5-FU.
Трем группам животных ежедневно в течение трех дней вводили через желудочный зонд по 25, 50 или 100 мг лектина Robinia pseudoacacia (RPA) в день на 1 кг массы тела, а затем на следующий день ввели 5-FU в количестве 150 мг/кг. Последней группе животных предварительно вводили дозу RPA 100 мг/кг массы тела, а затем снова давали диетический продукт, содержащий лактальбумин без инъекции 5-FU. После инъекции 5-FU животным снова давали в свободном режиме диетический продукт, содержащий лактальбумин. Через 7 дней после начала эксперимента животных умертвили, вскрыли тушки и определили влажную массу тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки. Результаты представлены в таблице 3 (см. в конце описания).
Результаты показывают зависимое от дозы увеличение влажной массы всех контролируемых тканей при увеличении дозы RPA. Таким образом, предварительное введение доз RPA обеспечило защиту тканей тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки от поражения, вызываемого 5-FU. Предварительное введение доз 100 мг/кг RPA (группа 4) обеспечило наибольшую защиту тканей по сравнению с животными, которым давали только лактальбумин (группа 1). Животные, которым вводили предварительные дозы 100 мг/кг RPA с последующей инъекцией 5-FU (группа 4), имели аналогичную влажную массу тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки с теми животными, которым вводили только 100 мг/кг RPA (группа 5).
Визуальный контроль тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки показал, что слизистый слой на кишечной ткани у животных, которым вводили только 5-FU (группа 1), отсутствовал или был очень тонким. При этом кишечная ткань животных, которым вводили 5-FU и RPA, имела здоровый внешний вид и нормальный слизистый слой.
Этот пример показывает, что пероральный прием лектина Robinia pseudoacacia (RPA) перед инъекцией 5-FU обеспечил существенный защитный эффект для ткани тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки.
Способность гомотетрамеров А4 и В4 лектинов Robinia pseudoacacia при пероральном приеме защищать крыс от высокой дозы химотерапии и, в частности, их защитное влияние на ткани кишечника
Пять групп, каждая из которых включала по 5 крыс, кормили стандартным диетическим продуктом, содержащим лактальбумин (таблица 1), в следующем режиме диетического питания (таблица 4, см. в конце описания).
Одну группу крыс (группа 1) на протяжении всего эксперимента кормили стандартным диетическим продуктом. Второй группе ежедневно в течение трех дней вводили через желудочный зонд физиологический раствор, а затем ввели 5-FU в количестве 150 мг/кг массы тела (группа 2).
Остальным двум группам (группы 3 и 4) ежедневно в течение трех дней вводили через желудочный зонд гомотетрамер А4 или В4 RPA, а затем ввели 5-FU в количестве 150 мг/кг массы тела. После инъекции 5-FU группы 2-4 снова кормили стандартным диетическим продуктом в течение четырех дней в свободном режиме. Через 7 дней после начала эксперимента животных умертвили, вскрыли тушки и определили сухую массу тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки. Результаты представлены в таблице 5 (см. в конце описания).
Сухие массы приведены к 100 г сухой массы тела.
Результаты показывают, что введение 5-FU оказывает большое влияние на состояние тонкой кишки и в особенности - тощей кишки. У животных, которым вводили 5-FU, наблюдалось значительное уменьшение сухой массы ткани по сравнению с контрольной группой (группы 1 и 2). При этом предварительное введение гомотетрамера А4 или В4 лектина обеспечивало существенный защитный эффект ткани (группы 3 и 4). В частности, животные, которым вводили гомотетрамер А4, имели практически такую же сухую массу ткани, как животные из контрольной группы.
Визуальный контроль тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки показал, что животные, которым вводили только 5-FU, имели обширное поражение слизистой оболочки ткани кишечника. При этом слизистый слой ткани кишечника у животных, которым вводили гомотетрамер А4 или В4 лектина, имел практически нормальный внешний вид.
Этот пример показывает, что введение гомотетрамеров А4 и В4 лектина Robinia pseudoacacia перед инъекцией 5-FU способно обеспечить существенную защиту кишечника.
Источники информации
1. Banach M., Zaremba S., Sadouska M. (1983). Disturbances of liver and muscle glycogen level as well as blood glucose level in mice following administration of lectin extracted from Robinia pseudoacacia. Folia Biol. (Krakow) Vol. 31, pp. 177-186.
2. Bardocz, S., Grant, G., Ewen, S.W.B., Duguid, T.J., Brown, D.S., Englyst, К. & Pusztai, A. (1995). Reversible effect of Phytohaemagglutinin on the growth and metabolism of the rat gastrointestinal tract. Gut, 37, 353-360.
3. Carvalho, A. F. F.U. de, (1992). Dietary kidney bean lectins affect insulin levels, change gene expression and modulate metabolism. PhD thesis; University of Aberdeen.
4. Denekamp, J. (1996). The broad spectrum of preclinical radiobiology: British contributions. International Journal of Radiation Oncology, Biology & Physics, 36, 497-509.
5. Duverger, E. and Delmotte, F. M. Purification of lectins from Robinia pseudoacacia L. root-tips. Plant Science 123.9-18, (1997).
6. Erkisi, M., Erkurt, E., Ozbarlas, S., Burgut, R., Doran, F. & Seyrek, E. (1996). The use of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in combination with single or fractionated doses of isofamide and doxorubicin in patients with soft tissue sarcoma. Journal of chemotherapy, 8, 224-228.
7. Fleischmann, G. and Rudiger, H. (1986). Isolation, resolution and partial characterisation of two Robinia pseudoacacia seed lectins. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, 27-32.
8. Gietl, С. and Ziegler H. , Biochem, Physiol. Planzen 175, 58-66 (1080).
9. Lehninger, A.L., Nelson, D.L. & Сох, М.С. (1997). Principles of biochemistry, Worth Publishers, New York.
10. Nishiguchi, M. , Yoshida, К. , Sumizono, Т. & Tazaki, T. (1997). Studies by site directed mutagenesis of the carbohydrate binding properties of a bark lectin from Robinia pseudoacacia. FEBS Letters, 403, 294-298.
11. Paulsen, F., Hoffmann, W., Kortmann, R.D., Porschen, R. & Bamberg, M. (1996). Akute gastrointestinal Nebenwirkungen in der Radio-onkologie - Was ist gesichert in der Therapie?. Strahlenther. Onkol. 172, 53-56 (Nr 2).
12. Podolsky, D.K (1993). Regulation of intestinal epithelial proliferation: a few answers, many questions.
13. Pusztai, A. (1991). Plant Lectins. Cambridge: Cambridge University Press.
14. Pusztai, A. (1993) Dietary lectins are metabolic signals for the gut and modulate immune and hormone functions. Eur. J. of Clin Nut, 47, 691-699.
15. Pusztai, A., Ewan, S.W.B., Grant G., Peumans, W.J., Van Damme, E.J. M. , Coates, M.E. and Bardocz, S. (1995). Lectins and also bacteria modify the glycosylation of gut receptors in the rat. Glycoconjugate Journal, 12, 22-35.
16. Raedler, A., Boehle A., Otto, U. & Raedler, E. (1982). Differences of glycoconjugate exposed on hypernephroma and normal kidney cells. Journal of Urology, 128, 1109-1113.
17. Sabeur, G., Wantyghem, J & Schuller, E. (1986). Stimulation of 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase in human lymphocytes by Robinia pseudoacacia lectin. Biochemie, 68, 581-585.
18. Sharif, A., Brochier, J. & Bourrillon, R. (1977). Specific activation of Human T lyphocytes by Robinia pseudoacacia seeds lectin. Cellular Immunology, 31, 302-310.
19. Sharif, A., Lethibichthuy, J., Brochier, J., Goussalt, Y. & Bourrillon, R. (1978). Activation of human В lymphocytes induced by Robinia pseudoacacia lectin in the presence of Т cells. Immunology, 35, 643-649.
20. Steel, G. G. (1996). From targets to genes: a brief history of radiosensitivity. Phys Med.Biol, 41, 205-222.
21. Van Damme, E.J.M., Barre, A., Smeets, K., Torrekens, S., Van Leuven, F. , Rouge, P. & Peumans, W.J. (1995a). The bark of Robinia pseudoacacia contains a complex mixture of lectins. Plant Physiol, 107, 833-843.
22. Van Damme, E.J.M., Barre, A., Rouge, P., Van Leuven, F., and Peumaas, W. (1995b). The seed lectins of black locust (Robinia pseudoacacia) are encoded by two genes which differ from the bark lectin genes. Plant Molecular Biology, 29, 1197-1210.
23. Van Halteren, H.K., Gortzak, E., Taal, B.G., Helmerhorst, Th, J, M., Aleman, B. M. P., Hart, A.A.M. & Zoetmulder, F.A.N. (1993). Surgical intervention for complications caused by late radiation damage of the small bowel: a retrospective analysis. European Journal of Surgical Oncology, 19, 336-341.
24. Wantyghem, J., Goulut, C., Frenoy, J.P., Turpin, E. and Goussault, Y. (1986). Purification and characterisation of Robinia pseudoacacia seed lectins. A reinvestigation. Biochem J., 237, 483-489.
25. Yeoh, E. , Horowitz, M., Russo, A., Muecke, Т., Ahmad, A. & Chatterton, B. (1993). International Journal of Radiation Oncology, Biology & Physics, 26, 229-237.
26. Yoshida, К., Baba, К., Yamamoto, N. & Tazaki, К (1994). Cloning of a lectin cDNA and seasonal changes in levels of the lectin and its mRNA in the inner bark of Robinia pseudoacacia. Plant Mol. Biol. (1994), 25, 845-853.
Изобретение относится к применению в медицине лектина Robinia pseudoacacia (RPA), в частности для получения отдельного гомополипептида лектина Robinia pseudoacacia и составов, содержащих лектин Robinia pseudoacacia, к применению лектина Robinia pseudoacacia для получения медикамента, предназначенного для уменьшения и/или лечения заболевания, к способу регулирования, уменьшения и/или лечения заболевания. Изобретение позволяет обеспечивать существенную защиту кишечника при химио- и/или радиотерапии, в частности, пациенту, страдающему раковым заболеванием. 4 с. и 21 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 ил.
| Fleischman G | |||
| et | |||
| al., 1986, Biol | |||
| Chem | |||
| Hoppe-Seyler, 367, p.27-32 | |||
| Способ получения лектина | 1990 |
|
SU1799599A1 |
| Радиопротекторное средство от цезия-137 | 1990 |
|
SU1795891A3 |
| Josiane Wantyghem et al | |||
| The Biological Journal, v.237, №2, 15 Jyly, 1986, p.483-489. | |||
