Способ получения лектина Советский патент 1993 года по МПК A61K35/78 

чИзобретение относится к получению биологически активных веществ, в частности, к способам получения лектина из коры Robinia pseudoacacia L, Этот лектин может использоваться для проведения исследований в биохимии и медицине, а именно, в гистохимических и цитохимических исследованиях, биотехнологии.

Цель изобретения - повышение чистоты получаемого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что очистку проводят на аффинном сорбенте овомуцин, полученном из нерастворимых гликопротеидов куриного яйца, высалива- ние проводят хлоридом натрия, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,07 М фосфатном буфере.

Способ получения аффинного сорбента овомуцин для очистки лектинов опубликован 07.04.90., бюлл. Ms 13. А.С. № 1554961.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для очистки используют аффинный сорбент овомуцин. обладающий более высокой химической и механической прочностью, а также лучшими гидродинамическими свойствами, который к тому же обладает высоким средством к лектину коры Robinia pseudoacacia L.

Пример. Кору Robinia pseudoacacia L собирают в момент распускания почек, когда активность лектинов максимальна. 1 кг измельченной коры экстрагируют 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении коры к экстрагенту 1:10 на протяжении 1-3 часа при непрерывном перемешивании. Полученный экстракт отжимают через плотную ткань и центрифугируют при 2500 g на протяжении 10 мин. Затем рН раствора доводят до 3,0 и добавляют NaCI из расчета 320 г/л. Осадок собирают центрифугированием 15 мин при 3000 д. Супернатант сливают, а

Ё

VI

Ч)

о ел о о

осадок размешивают в пятикратном количестве воды и рН раствора доводят до 8,0 ±0,5. Нерастворившийся осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость, полученную на предыдущей стадии, диализируют против 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН 7,5±0,5 с 0,5 М натрия хлорида. После диализа наносят на колонну, заполненную аффинным сорбентом. Для очистки лектина, получаемого из 1 кг коры Robinia pseudoacacia L собранной в момент распускания почек, достаточно 2,2±0,3 л сорбента. Колонку предварительно отмывают от консерванта и уравновешивают 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,5±0,5. После нанесения раствора лектина колонку промывают тем же буферным раствором до тех пор, пока светопоглощение при 280 нм не станет ниже 0,05, затем лектин снимают с колонки путем промывки ее 1 % раствором ацетатной кислоты.

Фракции, содержащие лектин, объединяют и белок высаливают при рН 7,0 320 г/л хлоридом натрия. Осадок собирают центрифугированием, затем растворяют в 5-кратном количестве дистиллированной воды и ставят на диализ против 0,07±0,01 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0 с не менее, чем с трехкратной сменой растворителя с интервалом в 8 часов. Небольшой осадок, нерастворившийся после диализа, отбрасывают.

,й

Отдиализованный раствор лектина наносят на колонку, заполненную ДЭАЭ-цел- люлозой (НПО Биолар, Олайне), уравновешенную тем же буферным раствором. Объем колонки 50 см3. В этих условиях лектин проходит через колонку без задержки, тогда как пигмент и примесные белки при этом задерживаются на колонке.

Контроль выхода лектина проводят с помощью реакции гемагглютинации с эритроцитами человека.

10

15

20

25

30

35

45

40

Фракции, содержащие лектин, объединяют, лектин высаливают хлоридом натрия (320 г/л), осадок растворяют в пятикратном количестве дистиллированной воды и после диализа против воды лиофильно высушивают. Выход - 1,5±0,3 г лектина из 1 кг воздушно-сухой коры, собранной во время распускания почек.

Готовый продукт после лиофильной сушки представляет собой белый аморфный порошок, хорошо растворим в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Минимальная концентрация, агглютинирующая эритроциты человека I/O/ группы - 0,6 мкг/мл. Лучшим ингибитором активности лектина среди моносахаридов является 2-ацетами- до-2-дезоксигалактопиранозид (минимальная концентрация, угнетающая активность 4 гемагглютинирующих единиц лектана - 6,25 мМ). По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в щелочной буферной системе, рН 8,6 в присутствии 0,1 % до- децилсульфата натрия, лектин состоит из двух близко идущих изоформ, которые имеют мол.массу 56±2 кД и 60±2 кД.

Форму л а изо б р е т е ни я Способ получения лектина путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой (Robinia pseudoacacia 1.)0,9%-ным водным раствором хлористого натрия, высаливания, диализа, аффинной хроматографии, элю- ции, повторного диализа и высушивания, отличающийс я тем, что, с целью повышения степени чистоты, используют кору робинии ложноакациевой, собранную в период распускания почек, аффинную хро- матографию проводят на сорбенте овому- , полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элю- цию осуществляют 1%-ным раствором уксусной кислоты, высаливают хлоридом натрия и после диализа очищают на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, а перед лигофилизацией повторно высаливают хлоридом натрия.

Изобретение относится к биохимии и касается способа получения лектина из коры робинии ложноакациевой. Целью изобретения является повышение степени чистоты. Способ осуществляют путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой, собранной в период распускания почек 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия, высаливания, диализа, аффинной хроматографии на сорбенте ово- мукоид, полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элюацию осуществляют 1 %-ным раствором уксусной кислоты, высаливанием хлоридом натрия, повторным диализом, очисткой на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, затем высаливают хлоридом натрия и лиофилизируют. Положительный эффект заключается в повышении степени очистки, по данным диск-электрофореза лектин представлен двумя близко идущими изоформами.