СПОСОБ ФАГОТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2003 года по МПК A61K35/76 A61P31/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии.

В настоящее время эпидситуация по туберкулезу характеризуется резким увеличением частоты лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к вновь создаваемым противотуберкулезным препаратам, что требует поиска принципиально иных способов убийства возбудителя туберкулеза в инфицированном организме. Одним из наиболее перспективных подходов является использование естественных врагов (антагонистов) М. tuberculosis среди представителей микромира, каковыми являются литические микобактериофаги [1].

Микобактериофаги - это специфические вирусы, способные избирательно заражать и интенсивно размножаться в бактерии-хозяине, что приводит к гибели (лизису) вирулентных микобактерий в течение 1-3 часов с момента заражения. Со времени открытия в 1954 г. Форманом специфического для вирулентного штамма М.tuberculosis микобактериофага предпринимались попытки использовать способность бактериальных вирусов к лизису возбудителя туберкулеза в качестве терапевтического воздействия. В ранних исследованиях была установлена достаточно высокая эффективность фаготерапии туберкулеза [2, 3, 4, 5]. Однако открытие микобактериофагов совпало во времени с появлением высокоэффективных противотуберкулезных химиопрепаратов и антибиотиков, что и предотвратило детальную проработку возможности использования микобактериофагов в качестве терапевтического агента.

В известных способах фаготерапии туберкулеза использовано парентеральное (подкожное или внутрибрюшинное) введение суспензии литического микобактериофага в физиологическом растворе.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по методической сущности и достигаемому эффекту является способ лечения генерализованного хронического туберкулеза с использованием многократного (внутрибрюшинного) парентерального введения суспензии микобактериофага DS₆A, представляющей собой фаговый лизат (смесь жизнеспособного фага и разрушенных Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv в питательной среде) [2].

Однако использованному способу фаготерапии свойственен ряд существенных недостатков, препятствующих клиническому использованию его во фтизиатрии. Одной из основных проблем этого плана является развитие гуморального иммунного ответа на парентеральное введение микобактериофага и, как следствие, активная элиминация (разрушение) фага при повторных введениях, что значительно снижает терапевтическую эффективность бактериолизиса [3].

Существенным недостатком описанной в прототипе формы лечебной суспензии микобактериофага является ее токсичность, обусловленная значительной примесью продуктов лизиса микобактерий, использованных для амплификации микобактериофага [1].

Парентеральное введение суспензии микобактериофага сопровождается быстрым неизбирательным захватом фаговых частиц фагоцитирующими элементами ретикулоэндотелия [2-4].

В предлагаемом способе достигнуто существенное повышение терапевтической эффективности фаготерапии за счет использования регионарной лимфогенной доставки липосомальной формы микобактериофага с избирательным накоплением действующего начала в фагоцитах лимфатической системы пораженного органа.

Проблема снижения токсичности фаговых препаратов, представляющих собой взвесь фагов в лизате микобактерий, на сегодняшний день практически решена путем фракционирования лизата микобактерий в градиенте хлористого цезия, что позволяет получить абсолютно нетоксичные препараты микобактериофагов [1].

Феномен активного поглощения микобактериофагов клетками системы мононуклеарных фагоцитов при фаготерапии внутриклеточных инфекций, каковой является туберкулез, следует рассматривать как положительное свойство. Более того, целенаправленная доставка микобактериофагов в фагосомальную систему мононуклеарных фагоцитов, где сосредоточена основная масса размножающихся микобактерий, является обязательным условием взаимодействия микобактериофага и микобактерий туберкулеза и, как следствие, высокоэффективной элиминации наиболее устойчивой к рутинным противотуберкулезным препаратам субпопуляции микобактерий.

Следовательно, для повышения эффективности фаготерапии туберкулеза необходимо соблюдение следующих условий:
а) воспрепятствовать разрушению фага гуморальными антителами в сосудистом русле;
б) повысить вероятность взаимодействия микобактериофага с внутриклеточным пулом микобактерий;
с) создание нетоксичной формы фагового препарата.

Перечисленные требования к реализации высокоэффективной фаготерапии туберкулеза соответствуют основным принципам адресной терапии внутриклеточных инфекций. Исходя из имеющегося опыта использования принципа "контейнерной доставки" действующего начала в очаг поражения [6, 7], нами разработан метод включения микобактериофага в фосфатидилхолиновые липосомы. Включение микобактериофага в фосфолипидные везикулы препятствует взаимодействию циркулирующих гуморальных антител с микобактериофагом и, следовательно, отменяется его разрушение в сосудистом русле на маршруте поступления в очаг поражения. В связи с лифмотропностью липосомальной формы регионарное введение включенной в водную фазу липосом концентрированной суспензии микобактериофагов обеспечивает избирательное поступление и накопление активного фага в лимфатической системе пораженного органа.

Высокая степень экспрессии скевенжер-рецепторов и рецепторов к липопротеидам в инфицированных макрофагах обеспечивает избирательное поступление содержащих микобактериофага липосом в микроокружение внутриклеточных микобактерий в высоколитическом титре.

Способ осуществляется следующим образом.

Обогащенную суспензию (10⁹ бляшкообразующих единиц/мл) литического микобактериофага D29 включают в водную фазу фосфатидилхолиновых липосом и с помощью специального катетера по 0,2 мл полученной липосомальной суспензии вводят ректально зараженным туберкулезом мышам. Лечение осуществляют в течение одного месяца с трехдневными интервалами между введениями липосомальной суспензии фага.

В качестве примера высокой эффективности регионарной лимфотропной фаготерапии с использованием липосомальной формы микобактериофага D29 приводим данные одного из экспериментов.

Исследование проведено на модели генерализованного туберкулеза мышей с преимущественно внелегочной локализацией специфического процесса (селезенка, мезентериальные лимфоузлы). Липосомальная форма препарата получена путем механического диспергирования 1 г высушенной под вакуумом фосфолипидной пленки в 10 мл очищенной суспензии литического микобактериофага D29 в физиологическом растворе (10⁹ БОЕ/мл). После интенсивного 30-минутного встряхивания получают стабильную суспензию включенного в фосфолипидные везикулы микобактериофага. По 0,2 мл полученной суспензии липосомального фага (опытная группа) или суспензии свободного фага в физиологическом растворе (контрольная группа) с помощью специального катетера вводили ректально двум группам зараженных туберкулезом мышей. Лечение осуществляли в течение одного месяца с трехдневными интервалами между введениями фага. Эффективность лечения оценивали по Першину Г.Н. и Макеевой O.O. [8].

Максимальный терапевтический эффект отмечен в группе животных, леченных с использованием липосомальной формы фага, индекс поражения легочной ткани в этой группе составил 0,65 ± 0,20 при 2,14 ± 0,28 (Р<0,01) в контроле и 1,61 ± 0,26 (Р<0,05) в группе мышей, леченных свободным фагом. Аналогичная тенденция отмечена и в остальных изученных органах (селезенка - 1,35 ± 0,32 и 2,11 ± 0,39; лимфоузлы - 1,25 ± 0,34 и 2,22 ± 0,49 соответственно липосомальной и свободной форм фага). (чертеж).

Представленные результаты свидетельствуют, что регионарное введение липосомальной формы микобактериофага D29 обеспечивает высокую эффективность адресной фаготерапии туберкулеза. Положительный эффект лечения обусловлен тем, что включение фага в фосфолипидные везикулы препятствует взаимодействию циркулирующих гуморальных антител с микобактериофагом и, следовательно, отменяет его инактивацию в сосудистом русле на маршруте поступления в очаг поражения. В связи с лимфотропностью липосомальной лекарственной формы регионарное введение включенной в водную фазу липосом концентрированной суспензии микобактериофагов обеспечивает избирательное поступление и кумуляцию действующего начала в лимфатической системе пораженного органа. Высокая степень экспрессии скевенжер-рецепторов и рецепторов к липопротеидам в инфицированных макрофагах обеспечивает избирательное поступление содержащих микобактериофага липосом в микроокружение внутриклеточных микобактерий в высоколитическом титре. Перечисленные условия высокой эффективности регионарной лимфотропной фаготерапии туберкулеза соответствуют основным принципам адресной терапии внутриклеточных инфекций.

Литература
1. Sambrook J. , Fritsch E.F., Maniatis T. /Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Springer Harbor, NY, 1989.

2. Земскова З.С., Дорожкова И.Р. // Патоморфологическая оценка лечебного действия микобактериофагов при туберкулезе. Проблемы туберкулеза -1991.- 11.-С.63-66.

3. Козьмин-Соколов Б.Н. Биологическая характеристика микобактериофагов и их активность in vivo. Автореферат дис.... д-ра мед. наук. Л., 1975.

4. Козьмин-Соколов Б. Н., Вавилин Г.И., Эртевциан Л.Н., Васильев А.В., Габер И. Э. // Влияние микобактериофагов на течение экспериментальной туберкулезной инфекции у белых мышей. - Проблемы туберкулеза 1975. - 4. С. 75-79.

5. Sula L. , Sulova J., Stolcpartova // Csl. Med. 1981. Vol.4, 4. P. 209-214.

6. Курунов Ю.Н., Урсов И.Г., Краснов В.А., Петренко Т.И., Яковченко Н.Н. , Свистельник А.В., Филимонов П.Н. Эффективность липосомальной лекарственной формы антибактериальных препаратов в ингаляционной терапии экспериментального туберкулеза. // Проблемы туберкулеза, 1995, 1. - С.38-40.

7. Курунов Ю.Н., Яковченко Н.Н., Свистельник А.В., Петренко Т.И., Филимонов П.Н. Эффективность различных способов введения липосомальной формы рифампицина при химиотерапии экспериментального туберкулеза. //Пульмонология: (приложение). Сборник-резюме 5-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. Москва, 1996. Реферат 437.

8. Финкель Е.А., Михайлова Л.В. Биологический метод исследования при туберкулезе. - Фрунзе, 1976, 556 с.

Изобретение относится к медицине, к фтизиатрии и может быть использовано для фаготерапии туберкулеза. Используют регионарную лимфогенную доставку липосомальной формы микобактериофага D29. Данное изобретение способствует повышению терапевтического эффекта фаготерапии и снижению токсичности фагового препарата. 1 ил.

Способ фаготерапии туберкулеза, заключающийся в использовании литического микобактериофага, отличающийся тем, что используют регионарную лимфогенную доставку липосомальной формы микобактериофага D29.