ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ШИЗОФРЕНИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Область техники
Настоящее изобретение касается диагностического набора для определения шизофрении. В частности, настоящее изобретение касается диагностического набора для определения шизофрении, включающего антитело против фактора роста эпидермиса (EGF).

Предшествующий уровень техники
Шизофрения возникает и в юности и в зрелом возрасте и имеет характерные симптомы, касающиеся восприятия, деятельности головного мозга, эмоций и поведения. Во многих случаях шизофрения развивается как хронический процесс, сопровождающийся различными затруднениями в социальной адаптации. Существуют симптомы положительной классификации шизофрении (галлюцинации, бред, ухудшение деятельности головного мозга, напряженность, необычное поведение и т. д. ) и отрицательной классификации (притупление эмоций, уменьшение волевых качеств, уход в себя и т.д.). Как указано выше, в настоящее время диагностика шизофрении основывается только на психологических симптомах пациента. Следовательно, она сильно зависит от субъективного мнения врача, устанавливающего диагноз. Именно поэтому неоднократно поднималась проблема объективности диагноза. Вследствие специфической патологии этого заболевания существует общественная потребность в установлении последовательной и всеобъемлющей системы лечения шизофрении, включая раннее выявление болезни, лечение и социальную реабилитацию на ранней стадии и предупреждение рецидивов. При лечении шизофрении нельзя обойтись без лекарственной терапии (во многих случаях длительного приема лекарств в течение нескольких лет). При этом пациентам назначают фенотиазин, производные тиоксантена, бутирофенона, бензамида, антагонисты серотонина и дофамина.

Если при шизофрении есть какие-то биохимические изменения, в основе которых лежит генетика, то как можно это доказать? В случае дефекта по ферменту, распространенному по всему организму, например, при врожденном нарушении аминокислотного или углеводного обмена, такой фермент легко выявляется в крови или моче. По уровню аминокислоты или ее метаболита в крови можно определить, какому ферменту присущ этот дефект. Более того, с помощью клеток крови, культуры ткани кожи или материалов аутопсии во многих случаях можно установить этот дефектный фермент. Проводилось много исследований жидкостей организма больных шизофренией, однако до сих пор не было обнаружено явных аномалий. В некоторых сообщениях были описаны специфические вещества, обнаруженные в крови или моче больных шизофренией. Однако почти все они не подтверждались в последующих экспериментах.

С другой стороны, фактор роста эпидермиса (EGF) исследовали как раковый фактор, участвующий в развитии злокачественных и доброкачественных опухолей. Однако ничего не было известно о роли EGF в шизофрении, которая является психическим заболеванием. В настоящем изобретении было впервые исследовано соотношение между концентрацией EGF в сыворотке крови и шизофренией.

Сущность изобретения
Шизофрения отмечается у 0,7-1,0% населения, причем она является серьезным заболеванием, составляющим около 40% от всех психических заболеваний. Несмотря на это, еще нет биохимических методов диагностики шизофрении. Поэтому в области медицины существует потребность в разработке диагностического набора для обнаружения биохимических изменений при шизофрении. Исходя из этого, целью настоящего изобретения является получение такого диагностического набора для шизофрении.

Авторы настоящего изобретения провели серьезные исследования для достижения указанной цели. При этом авторы обнаружили, что при хронической и острой шизофрении уровень EGF в сыворотке больных снижается по сравнению с нормой, а при хронической шизофрении содержание EGF в мозге больных значительно уменьшается, судя по анализам образцов мозга при аутопсии, это соответствует критериям "изобретательский уровень" и "новизна".

Далее следует подробное раскрытие настоящего изобретения, однако эти подробные объяснения и примеры не ограничивают сферу действия настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - график, показывающий содержание EGF в сыворотке крови человека по двум группам: контрольной группе добровольцев и группе хронических шизофреников.

Фиг. 2 - график, показывающий содержание EGF в сыворотке крови крыс по двум группам: контрольной группе и группе, получавшей галоперидол.

Фиг.3 - график, показывающий статистическое распределение содержания EGF в сыворотке крови человека в логарифмических единицах по двум группам: контрольной группе добровольцев и группе хронических шизофреников.

Фиг. 4 - график, показывающий содержание EGF в сыворотке крови человека по двум группам: контрольной группе добровольцев и группе хронических шизофреников, не получавших лекарственных средств.

Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение касается диагностического набора для определения шизофрении, для чего из крови человека получают сыворотку и измеряют содержание EGF. В настоящем изобретении EGF предпочтительно определяют методом "сэндвич"-ELISA (ферментного иммуносорбционного анализа), который обладает высокой специфичностью к EGF. В сыворотке больных шизофренией концентрация EGF значительно снижена по сравнению с нормой, и метод основан на этой информации.

В частности, настоящее изобретение предусматривает диагностический набор для определения шизофрении, включающий твердую фазу, иммобилизованное на ней антитело против фактора роста эпидермиса (EGF) и меченое антитело к EGF. В настоящем изобретении для мечения антител к EGF применяются ферменты, флуоресцентные метки или радиоизотопные метки и т.п. При этом применяются такие ферменты, как пероксидаза, β-D-галактозидаза, щелочная фосфатаза или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. При необходимости диагностический набор для шизофрении может также включать специальный реагент для обнаружения меченых антител к EGF.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает диагностический набор для определения шизофрении, включающий твердую фазу, иммобилизованное на ней антитело к EGF, модифицированное биотином антитело к EGF и меченый авидин, который реагирует с биотином. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает диагностический набор для определения шизофрении, включающий твердую фазу, иммобилизованное на ней антитело к EGF, модифицированное 2,4-динитрофенолом антитело к EGF и меченое антитело к 2,4-динитрофенолу, которое реагирует с 2,4-динитрофенолом. При необходимости диагностический набор реактивов настоящего изобретения может также включать специальный реагент для обнаружения меченого авидина или меченых антител к 2,4-динитрофенолу. Как указано выше, диагностический набор настоящего изобретения отличается тем, что с помощью антител к EGF измеряется концентрация EGF в сыворотке пациента. Набор реактивов для определения шизофрении по настоящему изобретению эффективен при диагностике острой или хронической шизофрении.

Далее следует описание значений или дается определение терминов, употребляемых в настоящем изобретении.

"Антитело против фактора роста эпидермиса" означает антитело, полученное с использованием фактора роста эпидермиса (сокращенно EGF) в качестве антигена. Таким антителом может быть любое антитело, если оно связывается с EGF, как поликлональное, так и моноклональное. Предпочтительны поликлональные и моноклональные антитела, специфически связывающиеся с EGF.

"Меченое антитело к EGF" означает антитело к EGF, которое помечено с помощью фермента типа пероксидазы, β-D-галактозидазы, щелочной фосфатазы или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы либо флуоресцентной метки типа дельфиния или с помощью радиоизотопа. Мечение антител к EGF дает возможность измерить их количество. При мечении с помощью фермента связавшиеся с EGF антитела можно обнаружить по реакции этого фермента с соответствующим субстратом, используя продукт реакции фермента в качестве маркера. Кроме того, в случае флуоресцентной или радиоизотопной метки связавшиеся с EGF антитела можно обнаружить по их флуоресценции или радиоактивности.

Кроме того, "меченое антитело к EGF" также включает антитела к EGF, меченые биотином, 2,4-динитрофенолом и т.п. Биотин специфически связывается с авидином, а 2,4-динитрофенол специфически связывается антителами к 2,4-динитрофенолу. Таким образом, указанные выше антитела к EGF можно количественно определить по авидину, меченому ферментом типа пероксидазы, β-D-галактозидазы, щелочной фосфатазы или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и т.п., или по антителам к 2,4-динитрофенолу.

"Шизофрения" означает эндогенное психическое заболевание, которое в основном возникает в юношеском возрасте и является серьезньм заболеванием, так как многие случаи переходят в хроническую патологию и личность больного постепенно разрушается, а некоторые больные доходят до уровня морального разложения, проявляя широкий спектр характерных нарушений деятельности головного мозга, восприятия, самосознания, эмоций и желаний.

В качестве примера специфического метода измерения содержания EGF в сыворотке можно привести метод, включающий следующие стадии:
(1) иммобилизация антитела к EGF на твердой фазе типа полистерола, нейлона, стекла, силиконового каучука или сефарозы,
(2) добавление или нанесение сыворотки диагностируемого пациента на твердую фазу,
(3) отмывка твердой фазы,
(4) добавление или нанесение меченого антитела к EGF на твердую фазу,
(5) измерение количества EGF по указанной метке.

В качестве другого примера специфического метода измерения содержания EGF в сыворотке можно привести метод, включающий следующие стадии:
(1) иммобилизация антитела к EGF на твердой фазе типа полистерола, нейлона, стекла, силиконового каучука или сефарозы,
(2) добавление или нанесение сыворотки диагностируемого пациента на твердую фазу,
(3) отмывка твердой фазы,
(4) добавление или нанесение модифицированного биотином антитела к EGF на твердую фазу,
(5) добавление или нанесение меченого авидина на твердую фазу,
(6) измерение количества EGF по указанной метке.

В качестве еще одного примера специфического метода измерения содержания EGF в сыворотке можно привести метод, включающий следующие стадии:
(1) иммобилизация антитела к EGF на твердой фазе типа полистерола, нейлона, стекла, силиконового каучука или сефарозы,
(2) добавление или нанесение сыворотки диагностируемого пациента на твердую фазу,
(3) отмывка твердой фазы,
(4) добавление или нанесение модифицированного 2,4-динитрофенолом антитела к EGF на твердую фазу,
(5) добавление или нанесение меченого антитела к 2,4-динитрофенолу на твердую фазу,
(6) измерение количества EGF по указанной метке.

В качестве твердой фазы можно использовать микросферы, микропланшеты, пробирки.

EGF, используемый в качестве антигена или стандарта для ELISA, можно приобрести коммерческим путем или получить следующим способом.

Когда применяются методы генной инженерии, кодирующий EGF ген встраивают в соответствующий вектор и вводят в клетки хозяина, проводя трансформацию. Затем искомый рекомбинантный EGF можно получить из трансформированных клеток или культуральной среды (например, Biotechnol. Appl. Biochem., 2000, Jun; 31 (Pt 3): 245-248). Этим методом можно добиться равномерной и массивной продукции EGF. Указанные клетки хозяина конкретно не лимитируются, ими могут быть различные виды клеток, обычно применяемых в методах генной инженерии, например, Escherichia coli. Bacillus subtilis, дрожжевые, растительные или животные клетки.

Антитела к EGF можно получить, используя в качестве антигена EGF или его неполный пептид для иммунизации кролика, цыпленка или индейки. В случае индейки готовят смесь для подкожного введения из очищенного EGF (200 мкг) и полного адьюванта Фрейнда. Иммунизацию проводят каждый месяц и повторяют до тех пор, пока не будет достигнут соответствующий титр. В этот момент получают сыворотку данного животного.

Меченые антитела к EGF можно получить, подвергая антитела к EGF реакции с биотинилирующим реагентом (NHS-LC-Biotin фирмы Pierce Co.) или с помощью коммерчески доступного набора из пероксидазы, присоединенной к поперечно-сшивающему реагенту (Maleimide activated HRP фирмы Pierce Co.).

При этом набор реактивов настоящего изобретения позволяет проводить диагностику шизофрении, а именно из крови человека получают сыворотку и определяют в ней концентрацию EGF различными методами. Диагноз шизофрении можно установить, определяя, попадает ли определенное значение в интервал значений EGF нормального контроля или нет. Как показано в Примерах, приведенных ниже, содержание EGF в сыворотке больных шизофренией значительно ниже, чем в контрольной группе. Таким образом, сфера действия настоящего изобретения охватывает способ диагностики шизофрении, включающий стадии взятия крови у человека и измерения содержания EGF в сыворотке, после чего диагноз шизофрении ставится в случае, если содержание EGF в сыворотке составляет 1/2 или меньше от среднего содержания EGF в сыворотке нормальной контрольной группы, измеренного таким же образом, а диагноз отсутствия шизофрении ставится в случае, если содержание EGF в сыворотке в два или больше раз превышает среднее содержание EGF в сыворотке группы шизофрении. Как указано ниже в Примерах, содержание EGF в сыворотке больных шизофренией преимущественно составляет 200 пг/мл или меньше. В частности, сфера действия настоящего изобретения охватывает и способ диагностики шизофрении, включающий стадии взятия крови у человека и измерения содержания EGF в сыворотке с помощью диагностического набора настоящего изобретения, в состав которого входит реакционный сосуд с фиксированным антителом к EGF и меченое антитело к EGF, причем диагноз шизофрении ставится в случае, если содержание EGF в сыворотке составляет 1/2 или меньше от среднего содержания EGF в сыворотке нормальной контрольной группы, измеренного таким же образом, а диагноз отсутствия шизофрении ставится в случае, если содержание EGF в сыворотке в два или больше раз превышает среднее содержание EGF в сыворотке группы шизофрении.

С помощью набора реактивов настоящего изобретения можно измерить содержание EGF в сыворотке не только человека, но и животных, используемых как модель шизофрении. Сфера действия настоящего изобретения охватывает и способ диагностики шизофрении путем измерения содержания EGF в сыворотке с помощью набора настоящего изобретения, причем не только у человека, но и у животных. Кроме того, применение таких модельных животных позволит разрабатывать лекарственные средства против шизофрении и оценивать лечебное действие лекарств. Таким образом, набор реактивов настоящего изобретения становится мощным инструментом для разработки лекарственных средств против шизофрении или изучения лечебного действия лекарств, поскольку он дает возможность разрабатывать и оценивать лечебное действие препаратов против шизофрении in vivo.

ПРИМЕРЫ
Далее следует раскрытие настоящего изобретения с помощью Примеров.

Пример 1. Кровь брали с согласия самих пациентов или их семей. Сыворотку необязательно разбавляли фосфатным буфером, содержащим ингибитор протеаз, в соответствии с общепринятым методом. Пробы вносили в микропланшету на 96 лунок, покрытых антителом к EGF (100 нг/лунку). Добавляли EGF в концентрации от 1 до 30 пг/лунку, и эти пробы служили стандартом для количественного определения. Пробы оставляли при комнатной температуре на ночь, после чего содержимое удаляли и лунки отмывали тем же буфером. Добавляли биотинилированное антитело к EGF (30 нг/мл) и оставляли смесь при комнатной температуре на ночь. Это вторичное антитело удаляли и отмывали лунки, добавляли стрептавидин-галактозидазу в соответствующем разведении указанным буфером (обычно от нескольких сот раз до нескольких десятков тысяч раз) и оставляли смесь при комнатной температуре на несколько часов. Это третичное антитело удаляли, отмывали лунки и добавляли субстрат для цветной реакции галактозидазы (200 мкМ 4-метилумбеллиферил-D-галактозид в 50 мМ фосфате натрия, рН 7,3, 10 мМ MgCl₂). После развития окраски составляли стандартную кривую. В случае флуоресцентного субстрата, каковым является данный субстрат, измеряли интенсивность флуоресценции при 448 нм и возбуждающем свете при 364 нм в считывающем приборе для планшет. Ставили по несколько проб из одного образца и концентрацию EGF в образцах рассчитывали по стандартной кривой.

В группе хронических шизофреников (45 человек) и контрольной группе добровольцев (45 человек), подобранных по полу и среднему возрасту, измеряли уровень EGF в свежей сыворотке двухслойным методом ELISA. В группе хронических шизофреников средний уровень EGF составил 136 пг/мл при стандартном отклонении (S. D. ) в 111 пг/мл. В то же время в контрольной группе добровольцев среднее значение равнялось 392 пг/мл при S.D. 343 пг/мл. При сравнении уровней EGF в сыворотке этих двух групп оказалось, что уровень EGF был значительно ниже (р<0,001) в группе шизофреников (фиг.1). На фиг.1 уровень EGF в сыворотке контрольной группы представлен слева, а уровень EGF в сыворотке группы шизофреников представлен справа соответственно. Для исследования влияния лекарства на уровень EGF в сыворотке были подготовлены крысы, получавшие галоперидол (0,5 мг/кг) на протяжении 2 недель. Брали кровь из этих крыс и контрольных крыс и измеряли уровень EGF в сыворотке двухслойным методом ELISA, таким же образом, как в сыворотке человека. При сравнении этих двух групп не было обнаружено значительных отличий (р>0,05). На фиг.2 уровень EGF в сыворотке контрольной группы представлен слева, а его уровень в группе, получавшей галоперидол, представлен справа соответственно. Представленные на фиг. 2 результаты свидетельствуют, что снижение уровня EGF в группе хронических шизофреников не является следствием хронического приема лекарственного препарата.

Проверка статистики. Значения EGF в этих трех группах не подчиняются нормальному распределению, поэтому невозможно проверить, какие из индивидуальных значений EGF отклоняются от нормального распределения. Логарифмы этих значений EGF подчиняются нормальному распределению. На фиг.3 эти данные представлены в виде диаграммы. Среднее логарифмическое значение EGF в контрольной группе равно 2,43 при стандартном отклонении 0,41. Для этого распределения расчетный предел абнормальности (отклонения от нормального распределения), то есть уровень меньше 5%-ного нижнего предела, равен 2,43-(0,41•1,9)= 1,64, или 44 пг/мл. Следовательно, 5 из 45 больных хронической шизофренией следует считать "выходящими за пределы нормальных значений". Кроме того, среднее логарифмическое значение EGF в группе шизофреников равно 2,01 при стандартном отклонении 0,275. Для этого распределения расчетный предел абнормальности, то есть уровень больше 5%-ного верхнего предела, равен 2,01+(0,275•1,9)=2,53, или 339 пг/мл. Следовательно, 21 из 45 человек контрольной группы следует считать "выходящими за пределы абнормальных значений". При этом остальные лица являются ложно-положительными и не могут быть оценены.

Результаты фиг.1 были получены на пациентах, принимавших лекарства. Поэтому для исследования влияния лекарств на уровень EGF измеряли уровень EGF в сыворотке контрольной группы добровольцев и не принимавших лекарств хронических больных шизофренией (группа свободных от лекарств пациентов). Уровень EGF измеряли у 14 человек из контрольной группы (пустые кружочки) и группы свободных от лекарств пациентов (сплошные треугольники) уже описанным методом, и результаты представлены на фиг.4. По вертикальной оси на фиг.4 отложены уровни EGF в сыворотке каждого из представителей контрольной группы добровольцев и группы свободных от лекарств пациентов, при этом средний уровень EGF в сыворотке контрольной группы принимали за 100. При сравнении уровней EGF в сыворотке этих двух групп уровень EGF в группе свободных от лекарств пациентов оказался значительно ниже (р<0,001), аналогично результатам на фиг.1. Тем самым подтверждается, что пониженный уровень EGF в сыворотке хронических больных шизофренией не является следствием приема лекарств.

В соответствии с настоящим изобретением предусматривается диагностический набор для определения шизофрении, включающий измерение уровня EGF в сыворотке с помощью антитела к EGF.

Изобретение относится к медицине и касается диагностического набора для определения шизофрении. Диагностический набор для определения шизофрении включает измерение содержания фактора роста эпидермиса в сыворотке с помощью антитела против фактора роста эпидермиса. Диагностический набор настоящего изобретения применяется для диагностики шизофрении, острой и хронической шизофрении. Преимущество изобретения заключается в выявлении нового маркера, который можно использовать для диагностики шизофрении. 5 с. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Диагностический набор для определения шизофрении, включающий иммобилизованное на твердой фазе антитело против фактора роста эпидермиса (EGF) и меченое антитело к EGF. 2. Диагностический набор по п. 1, в котором для мечения антитела применяется фермент, флуоресцентная метка или радиоизотопная метка. 3. Диагностический набор по п. 2, в котором для мечения антитела применяется фермент из числа пероксидазы, β-D-галактозидазы, щелочной фосфатазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. 4. Диагностический набор для определения шизофрении, включающий иммобилизованное на твердой фазе антитело к EGF, модифицированное биотином антитело к EGF и меченый авидин, который реагирует с биотином. 5. Диагностический набор для определения шизофрении, включающий иммобилизованное на твердой фазе антитело к EGF, модифицированное 2,4-динитрофенолом антитело к EGF и меченое антитело к 2,4-динитрофенолу, которое реагирует с 2,4-динитрофенолом. 6. Диагностический набор для определения шизофрении по любому из пп. 1-5, в котором концентрацию EGF в сыворотке измеряют с помощью антитела к EGF. 7. Диагностический набор для определения шизофрении по любому из пп. 1-6, в котором шизофрения представляет собой острую шизофрению или хроническую шизофрению. 8. Способ диагностики шизофрении у испытуемого, включающий следующие стадии: (1) взятие крови у испытуемого и в нормальной контрольной группе, а затем получения сыворотки каждого субъекта из крови каждого субъекта, (2) измерение концентрации EGF в сыворотке каждого субъекта с помощью антитела к EGF, (3) постановка диагноза шизофрении испытуемому в случае, если концентрация EGF в сыворотке испытуемого составляет 1/2 или меньше от средней концентрации EGF в нормальной контрольной группе. 9. Способ диагностики шизофрении у испытуемого, включающий следующие стадии: (1) взятие крови у испытуемого и в группе шизофрении, а затем получения сыворотки каждого субъекта из крови каждого субъекта, (2) измерение концентрации EGF в сыворотке каждого субъекта с помощью антитела к EGF, (3) постановка диагноза отсутствия шизофрении у испытуемого в случае, если концентрация EGF в сыворотке испытуемого в два или больше раз превышает среднюю концентрацию EGF в группе шизофрении. 10. Способ диагностики шизофрении по п. 8 или 9, включающий измерение концентрации EGF в сыворотке крови с помощью диагностического набора по п. 1. 11. Способ диагностики шизофрении по п. 8 или 9, в котором шизофрения представляется собой острую шизофрению или хроническую шизофрению.