Способ измерения массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот в биологических средах методом газожидкостной хроматографии Российский патент 2021 года по МПК G01N33/487 G01N33/483 G01N33/12 G01N33/49 G01N30/02 

Изобретение относится к различным областям народного хозяйства (медицине, химической и фармацевтической промышленности), где есть потребность в измерении массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах, в том числе животных и растительных тканях методом газожидкостной хроматографии.

Уровни жирных кислот отражают функциональное состояние организма, характеризуя взаимосвязь между потреблением жирных кислот с пищей и содержанием их в крови, в различных органах и тканях. Изучение данной проблемы является актуальным, так как в настоящее время возрос интерес к изучению роли жирных кислот в различных физиологических процессах в связи с их участием в формировании фосфолипидов биологических мембран всех органов и тканей, а также их участием в синтезе тканевых гормонов - эйкозаноидов: простациклинов (ПЦ), простагландинов (ПГ), лейкотриенов (ЛТ) и тромбоксанов (ТК). Высокое содержание насыщенных жирных кислот при низких уровнях ненасыщенных в крови является одним из факторов риска метаболически обусловленных заболеваний (сахарного диабета 2 типа, сердечнососудистых, атеросклероза).

В связи с вышесказанным существует потребность в надежном способе количественного измерения содержания жирных кислот в различных биологических жидкостях и тканях при малых дозах биологического материала (0,1 г и менее), низком содержании жирных кислот в образцах, при котором время и потери жирных кислот в процессе пробоподготовки к количественному измерению сведены к минимуму. Определение абсолютных концентраций жирных кислот в биологических средах для клинической биохимии оказывается предпочтительным. Наиболее широкий спектр жирных кислот хроматографическим методом разделяют и количественно определяют в виде эфиров. Количественный расчет газохроматографического измерения МЭЖК методом внутреннего стандарта сводит к минимуму зависимость от потерь целевых компонентов при многоэтапной подготовке образцов к анализу, а также компенсирует инструментальный уход и отклонения от количества вводимых образцов.

Определение массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме (%) методом газожидкостной хроматографии регламентируют стандарты для жиров и растительных масел для пищевой промышленности с ограниченным спектром определяемых жирных кислот: ГОСТ 30418-96 «Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава»; ГОСТ 31663-2012 «Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров жирных кислот (ISO 5508:1990, NEQ)»; ГОСТ 31665-2012 «Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот (ISO 12966-2:2011, NEQ)». В документах указано, что методы применимы в диапазоне массовых долей жирных кислот 0,1-И 00%. Однако для измерения массовой концентрации МЭЖК в биологических средах, а также растительных и животных тканях чувствительность данных методов недостаточна.

Известен способ (Патент РФ № 2220755 / Ардатская М.Д., Иконников Н.С., Минушкин О.Н.; заявл. 3.07.2002, опубл. 10.01.2004) разделения короткоцепочечных жирных кислот фракции С2÷С6 методом газожидкостной хроматографии. Способ позволяет проводить выделение, разделение, определение состава и содержания кислот при малых пробах (менее 2,0 г) и в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах. Предложена хроматографическая обработка проб биологического субстрата на колонке, где неподвижная фаза - сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой. Разделение проводят на кварцевой капиллярной колонке длиной 32÷40 м, диаметром 0,28÷0,35 мм с толщиной неподвижной фазы 0,26÷0,35 мкм при температуре от 145 до 155°С. Недостатком указанного способа разделения смеси жирных кислот является определение спектра только короткоцепочечных жирных кислот C2÷C6.

Аналогом изобретения является способ стабилизации жирных кислот, присутствующих в образце, например, в крови, слюне, грудном молоке, моче, сперме, плазме и сыворотке крови (Патент РФ 2639455 / Гибсон Р., Гэ Л.; заявл. 27.02.2016, опубл. 21.12.2017). Способ предусматривает нанесение жирных кислот или образца, содержащего жирные кислоты, на твердый носитель, который содержит твердую подложку, хелатообразующее средство и антиоксидант. Данное изобретение дополнительно относится к способу определения состава жирных кислот в образце, сорбированном на твердой подложке, осуществляемым путем дериватизации жирных кислот в высушенном сорбированном образце и анализа полученных в результате дериватизированных соединений при помощи газовой хроматографии. В одном варианте жирные кислоты в высушенном сорбированном образце превращают в сложные метиловые эфиры жирных кислот путем прямого трансметилирования, например, путем нагревания при 70°С в растворе 1% H₂SO₄ в метаноле в течение 3 часов. Затем сложные метиловые эфиры экстрагируют в органический растворитель (такой как гептан) и гептан, содержащий сложные метиловые эфиры жирных кислот, вводят в газовый хроматограф GC (Hewlett-Packard 6890; Пало-Альто, Калифорния, США). Для идентификации и количественного определения сложных метиловых эфиров жирных кислот предложено сравнение значений времени удерживания и значений площади пика неизвестных образцов с таковыми у коммерческих стандартов липидов (Nu Chek Prep Inc., Элизайан, Миннесота, США) с использованием системы обработки данных Hewlett-Packard Chemstation. Способ предусматривает определение количества жирных кислот одного или нескольких классов (предпочтительно ненасыщенных жирных кислот) в образце в виде доли (например, процентного содержания) от общего содержания липидов, присутствующих в образце, или в виде доли от общего содержания жирных кислот, присутствующих в образце. Предложенный способ является близким, но не предусматривает абсолютного количественного измерения этерифицированных жирных кислот (лишь в относительном выражении) путем введения внутреннего стандарта в пробу до всех этапов пробоподготовки, что является ограничивающим фактором для использования.

Самым близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, изложенный в «Методике измерений массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии» (разработана Институтом физиологии природных адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Российской академии наук, внесена в реестр методик измерений УрО РАН за № 88-16365-001-2019, внесена в Федеральный информационный фонд по обеспечению единства измерений за № ФР.1.31.2019.33472, свидетельство об аттестации методики измерений за № 88-16365-004-RA.RU.310657-2019, дата выдачи свидетельства 21 февраля 2019 г.). Методика предусматривает экстракцию липидов сыворотки крови, метилирование жирных кислот путем переэтерификации липидов в присутствии кислотного катализатора, экстракцию метиловых эфиров жирных кислот. Концентрирование экстрактов липидов и метиловых эфиров жирных кислот выполняют упариванием двумя вариантами: под атмосферным давлением или под вакуумом. Определение МЭЖК выполняют на газожидкостном хроматографе «Agilent 7890А» (фирма Agilent Technologies Inc, США) с пламенно-ионизационным детектором при использовании кварцевой капиллярной колонки размером 60 м×0,25 мм с толщиной фазы 0,15 мкм, с неподвижной жидкой фазой DB 23 (50% цианопропилметилполисилоксан) фирмы «Agilent Technologies)), США. Регистрация сигнала и количественные расчеты выполняют с помощью системы обработки данных «Agilent ChemStation» В.04.03. Rus. Идентификацию и измерение массовой концентрации метиловых эфиров 43 жирных кислот в диапазоне 0,3÷1000 мкг/см³ выполняют методом внутреннего стандарта с использованием градуировочного стандарта МЭЖК Nu Chek Prep Inc 569B GLC reference standart (США) с внутренним стандартом метиловым эфиром нонадекановой кислоты МЭ С19:0 и внутреннего стандарта, добавляемого в исследуемые образцы нонадекановой кислоты С19:0 производства фирмы Nu Chek Prep Inc (США). Данная методика взята в качестве прототипа.

Нужно отметить, что хотя рассматриваемый прототип и является современным и востребованным способом измерения массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот, наиболее близким по достигаемому техническому результату, однако прототип предусматривает измерение МЭЖК только в одном виде биологической жидкости - сыворотке крови. Предложенное нами изобретение устраняет указанный недостаток и расширяет спектр исследуемых биологических образцов, а также повышает прецизионность результатов измерений путем взвешивания гомогената проб с точностью до 0,0002 г и введения в формулу количественного расчета коэффициента приведения результата измерения МЭЖК в пробах тканей к мкг/г. Таким образом, мы расширяем возможности прототипа и включаем в «Способ измерений массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах методом газожидкостной хроматографии» исследование различных жидких биологических сред, в том числе животных и растительных тканей.

Поставленная цель достигается введением в процедуру подготовки проб для количественного измерения МЭЖК этапа гомогенизации проб тканей с целью разрушения тканевой структуры и клеточных стенок. Также в программу обработки данных «Agilen ChemStation» В.04.03. Rus для количественного расчета хроматограмм измерения МЭЖК вводится коэффициент К для приведения результата измерения каждой пробы ткани к 1 г, исходя из массы навески гомогената ткани на анализ, взятой взвешиванием с точностью до 0,0002 г, и коэффициента разбавления для приведения количества жидкой биологической пробы к 1 см³, исходя из объема биологической жидкости, отобранной на анализ.

В способе используется вакуумное оборудования для концентрирования (упаривания) экстрактов липидов и экстрактов метиловых эфиров жирных кислот в процедуре подготовки проб для измерения, что позволяет сократить время упаривания в 7 раз и повысить количественный выход измерения МЭЖК по сравнению с использованием при подготовке проб оборудования под атмосферным давлением в 1,2÷1,7 раза. Это важно при малых дозах биологического материала и низком содержании жирных кислот в образцах, так как повышается чувствительность и достоверность способа. Особенно актуальным это становится при использовании изобретения в области медицины в целях разработки профилактических мероприятий и научно-практических рекомендаций для предотвращения метаболически обусловленных заболеваний, в частности, сахарного диабета 2 типа, сердечно-сосудистых, атеросклероза.

При подготовке проб используют известные процедуры экстракционного извлечения липидов из биологического материала и получения метиловых эфиров жирных кислот из липидов для газожидкостной хроматографии: Folch J., Laes М., Sloane-Stanley G.H. // J. Biol. Chem.-1957.-Vol / 226. - P. 497-505, Peisker K.V. - J. Amer. Oil Chem. Soc, 1964, vol. 41, p. 87-88.

МЭЖК определяют на газожидкостном хроматографе «Agilent 7890А» (фирма Agilent Technologies Inc, США) с пламенно-ионизационным детектором при использовании кварцевой капиллярной колонки DB-23 размером 60 м×0,25 мм×0,15 мкм с неподвижной жидкой фазой DB 23 (50% цианопропилметилполисилоксан) фирмы «Agilent Technologies)). Регистрацию сигнала и количественные расчеты осуществляют системой обработки данных «Agilent ChemStation» В.04.03. Rus. Количественное измерение МЭЖК в пробах выполняют методом внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют нонадекановую кислоту С 19:0 для газожидкостной хроматографии производства фирмы Nu Chek Prep Inc (США), расчетное количество которой вводят в каждую пробу биологического материала на стадии экстрагирования липидов. Для идентификации и определения калибровочных коэффициентов используют аттестованную смесь 43 метиловых эфиров жирных кислот Nu Chek Prep Inc 569 В reference standard и метиловый эфир нонадекановой кислоты МЭ С19:0 в качестве внутреннего стандарта для газожидкостной хроматографии фирмы Nu Chek Prep Inc (США). Вычисление времени удерживания и калибровочных коэффициентов для каждого компонента выполняют по хроматограммам четырех-пяти количественных калибровочных уровней аттестованной смеси Nu Chek Prep Inc 569 В системой обработки данных «Agilen ChemStation» В.04.03. Rus. Для приготовления калибровочных растворов в виалы с точностью до 0,000005 г взвешивают от 1 до 6,5 мкл смеси Nu Chek Prep, Inc 569 В, добавляют рассчитанное количество раствора МЭ С19:0 в гексане, содержащее 0,2 мг МЭ С 19:0, объем смеси доводят до 0,2 см³ гексаном и выполняют измерения. Для расширения спектра короткоцепочечных жирных кислот в каждый калибровочный раствор добавляют рассчитанное количество (мм³) стандартного образца метилового эфира нонановой кислоты Nu Chek Prep N9M (США). Условия количественного расчета указаны в прототипе. Калибровочный коэффициент для каждого компонента рассчитывается системой обработки данных равным отношению количеств компонента и внутреннего стандарта (мкг) к отношению откликов детектора (площади пиков в условных единицах) компонента и внутреннего стандарта.

Условия выполнения измерений: температура детектора 280°С; температура испарителя 270°С; температура колонки с программированием с начальной температуры 130°С до конечной 230°С со скоростью подъема от 1,5 до 10°С со ступенчатым температурным градиентом; поток газа-носителя в колонку от 0,7 до 1,15 см³/мин с программированием со ступенчатым градиентом; деление потока 1:45; поток водорода 30 см³/мин; поток воздуха 400 см³/мин; обдув септы испарителя 3 см³/мин; поддув в детектор 15 см³/мин; поток газа-носителя 35 см³/мин; время анализа 42 минуты; продувка колонки после анализа 35 минут при температуре 230°С при потоке газа 2,3145 см³/мин. Используется: газ-носитель азот по ГОСТ 3022 с объемной долей азота не менее 99,995%; воздух сжатый по ГОСТ 17433 класса 0; водород электролизный с генератора водорода по ГОСТ 3022 марки А. Объем вводимой в хроматограф пробы для анализа 1 мм³ с делением потока 1:45, дозирование пробы автоматическое.

Для работы под атмосферным давлением применяют термостат ТС-1/80 СП (Россия). Вакуум обеспечивают прибором для параллельного вакуумного упаривания 12 проб «Multivapor PI 2» фирмы «BUCHI» (Швейцария). Прибор снабжен 12 индивидуальными емкостями с водой в качестве теплоносителя, расположенными на платформе с регулируемым подогревом с отводом паров растворителя по индивидуальным каналам через вакуумные адаптеры в общий коллектор-крышку и далее через насос на конденсатор. Платформа работает как горизонтальный орбитальный встряхиватель с вращением до 485 об/мин. Прибор укомплектован вакуумным диафрагменным насосом V 700, обеспечивающим вакуум-давление менее 10 мбар и вакуум-контроллером V 850, который имеет библиотеку растворителей, разветвленные градиентные функции, автоматический алгоритм управления вакуумом. Перемешивание проб на стадии экстракции липидов выполняется на встряхивателе «Vortex Genius» IKA (Латвия) с орбитальной скоростью вращения 5÷3400 об/мин и на встряхивателе лабораторном АВУ-6С с частотой колебаний 100÷120 ед/мин (Россия).

Биологические образцы сохраняют в обработанном и замороженном виде при температуре от -20 до -18°С. Обработка ткани заключается в промывании образца ткани физиологическим раствором, просушивании фильтровальной бумагой, удалении кровеносных сосудов и, по необходимости, измельчении в чашке Петри лезвием или ножницами. Процедуру гомогенизации замороженной ткани проводят растиранием 2-3 г образца в охлажденной фарфоровой ступке пестиком в течение 3-5 минут до однородной пластичной массы при поддержании температуры от 0 до +4°С. Навески ткани на анализ отбирают в количестве 0,1÷1,5 г взвешиванием с точностью до 0,0002 г, размороженные жидкие биологические образцы отбирают в количестве 0,1÷2 см³ дозатором.

Предлагаемый способ реализуют следующим образом.

Экстракцию липидов из жидких биологических проб (сыворотка крови, слюна и др.) и проб гомогенизированных тканей в вариантах под атмосферным давлением и под вакуумом выполняют по этапам.

1 этап. В коническую колбу вносят экстрагирующую смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1 и при постоянном перемешивании (на встряхивателе «Vortex») добавляют объем, см³, отобранной дозатором жидкой пробы. К навеске гомогенизированной ткани, взвешенной с точностью до 0,0002 г, добавляют смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1 при перемешивании. В колбы вносят рассчитанное количество см³ раствора внутреннего стандарта в хлороформе, содержащее 0,2 мг С 19:0, колбу встряхивают на любом встряхивателе в течение 30 мин. Далее экстракцию продолжают в течение 10÷12 часов в термостате при температуре 25°С.

2 этап. Раствор с осадком фильтруют через обезжиренный фильтр. Затем смесью хлороформа с метанол в соотношении 2:1 доводят количество фильтрованного экстракта до 15 см³, добавляют 3 см³ 0,74% (масса/объем) водного раствора СаСl₂, перемешивают на встряхивателе «Vortex» и оставляют до расслоения в холодильнике до следующего дня.

3 этап. Верхний, водно-спиртовый слой, составляет 40% и содержит водорастворимые вещества, нижний, хлороформный слой, составляет около 60% и содержит липиды. Верхний слой отбрасывают, пограничный слой промывают смесью «верхняя фаза», удаляя таким образом все нелипидные примеси, затем добавляют метанол в количестве 0,5÷1,0 см³ с перемешиванием на встряхивателе «Vortex» до исчезновения мути. Далее подготовку проб для измерения выполняют в двух вариантах.

Вариант 1. Экстракт липидов проб упаривают под атмосферным давлением в суховоздушном термостате с температурой 25°С до постоянной массы. Следующий этап пробоподготовки - получение метиловых эфиров жирных кислот реакцией переэтерификации липидов. При проведении метилирования в термостате упаренный экстракт липидов растворяют в 0,2 см³ смеси хлороформа с метанолом в соотношении 2:1 и добавляют 2 см³ метилирующей смеси - 1,5% раствора H₂SO₄ в метаноле, герметично закрывают пробирки и ставят в термостат на 30 минут при температуре 80°С. По окончании инкубации к пробам добавляют 1,5 см³ смеси гексана с диэтиловым эфиром в соотношении 1:1, затем 0,8 см³ дистиллированной воды, перемешивают в течение 1 минуты на встряхивателе «Vortex» и оставляют до расслоения и исчезновения мути в нижней фазе. Верхний слой, содержащий метиловые эфиры жирных кислот, отбирают в виалы и проводят экстракцию в пробирке второй раз таким же количеством см³ смеси гексана с диэтиловым эфиром в соотношении 1:1, экстракты объединяют. Для концентрирования проб до объема 0,2 см для выполнения хроматографического измерения пробы выдерживают при температуре 25°С под атмосферным давлением в термостате. Процесс длится не менее 10 часов.

Вариант 2. Для упаривания под вакуумом экстракты липидов в смеси хлороформ-метанол, которые прошли 3 этапа, сливают в пробирки прибора «Multivapor P12». По данным библиотеки контроллера по растворителю хлороформ устанавливают режим упаривания растворителей: температура воды в водяной бане 50°С; остаточное давление 318 mbar, что соответствует температуре испарения растворителя в пробирках 30°С; температура охлаждающей воды 10°С. Упаривание проводят при перемешивании с горизонтальным вращательным движением платформы 145-200 об/мин. Контроллер поддерживает заданный режим вакуума во время цикла. После упаривания растворителей в каждую пробирку добавляют по 2-3 см³ хлороформа для удаления следов воды азеотропной отгонкой и продолжают упаривать содержимое до образования желтоватого налета липидов на дне пробирок. Этот этап длится 2 часа. Для получения метиловых эфиров жирных кислот упаренный экстракт в пробирках прибора «Multivapor P12» растворяют в 0,2 см³ смеси хлороформ-метанол (2:1), добавляют 2 см³ метилирующей смеси - 1,5% раствора H₂SO₄ в метаноле. Пробирки закрывают переходниками с герметичной септой, устанавливают на платформу «Multivapor P12» для инкубации при температуре водяной бани 90°С при постоянном перемешивании 145÷200 об/мин. на 30 минут. По окончании инкубации пробы количественно переносят в пробирки с притертой пробкой, смывая остатки пробы 1,5 см³ гексан-эфирной смеси и далее обрабатывают пробу для выделения экстракта метиловых эфиров жирных кислот аналогично варианту 1. Для концентрирования экстракта метиловых эфиров жирных кислот до объема 0,2 см³ виалы с гексан-эфирным экстрактом устанавливают на платформу «Multivapor P12», задают режим упаривания, подобранный в библиотеке контроллера по растворителю гексан: температура воды в бане 45°С, остаточное давление 195 mbar, температура испарения 25°С, температура охлаждающей воды 5°С, задают режим перемешивания 120 об/мин. Продолжительность подготовки пробы для измерения составляет 1÷1,1 часа.

Выполнение измерений проводят при вышеуказанных условиях хроматографирования. Качественную идентификацию и порядок выхода МЭЖК проводят по совпадению времени удерживания с данными, полученными для стандартной смеси МЭЖК Nu Chek Prep Inc 569B GLC reference standart (США), количественное измерение массовой концентрации МЭЖК выполняют с использованием площадей пиков компонентов, внутреннего стандарта и калибровочного коэффициента для компонента, равного отношению количеств компонента и внутреннего стандарта (мкг) к отношению откликов детектора (площади пиков в условных единицах) компонента и внутреннего стандарта. Если содержание МЭЖК в анализируемой пробе выходит за верхний предел диапазона градуировочной характеристики, определение повторяют с меньшим количеством пробы, при низком содержании МЭЖК количество пробы увеличивают. В программу обработки Agilent ChemStation» В.04.03. Rus при расчете хроматограммы каждой исследуемой пробы вводят количества внутреннего стандарта С 19:0 в мкг и коэффициент приведения количества биологической жидкости к 1 см³ или количества пробы ткани к 1 г.

Результат измерений в пробе биологической жидкости (мкг/см³) в программе получают расчетом массовой концентрации каждого МЭЖК по формуле:

где: X - массовая концентрация каждого МЭЖК в пробе биологической жидкости, мкг/см³;

А - отношение площадей откликов детектора для данного МЭЖК к стандарту; В - калибровочный коэффициент для данного МЭЖК;

С - количество внутреннего стандарта, добавленного в пробу биологической жидкости, мкг;

V - объем пробы биологической жидкости, взятой для анализа, см³.

Результат измерений в пробе биологической ткани или растительной ткани (мкг/г) получают расчетом массовой концентрации каждого МЭЖК по формуле:

где: X - массовая концентрация каждого МЭЖК в пробе биологической ткани или растительной ткани, мкг/г;

А - отношение площадей откликов детектора для данного МЭЖК к стандарту; В - калибровочный коэффициент для данного МЭЖК;

С - количество внутреннего стандарта, добавленного к навеске пробы биологической или растительной ткани, мкг;

К - коэффициент приведения результата измерения к 1 г (K=1/масса навески на анализ, г).

Ниже приведены частные примеры измерений массовой концентрации МЭЖК в различных биологических средах, что подтверждает возможность осуществления способа, приемлемость двух вариантов пробоподготовки, преимущество варианта с использованием вакуумного оборудования.

Пример 1. В 2015-2018 гг. обследовано взрослое население Севера России: 623 человека - жители арктического региона (АР): Ямало-Ненецкий АО, пос. Антипаюта, пос. Красный Селькуп, пос. Тазовский, с. Газ-Сале, пос. Гыда, пос. Ныда, с. Нори, с. Толька. Критерий включения: мужчины и женщины зрелого возраста, постоянно проживающие в АР, вне периода обострения их хронических заболеваний. С участниками обследования проводилось анкетирование, включающее вопросы о возрасте, весе, росте, месте проживания. Исследование проводилось с согласия обследуемых и в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта исследования» (с изменениями и дополнениями 2013 г). Забор крови осуществлялся в вакутайнеры «Весктоп Diskinson ВР» из локтевой вены утром с 8:00 до 10:00 часов натощак. Пробирку с активатором свертывания и образцом крови центрифугировали в течение 10÷15 минут при скорости 1500 об/мин, отбирали сыворотку, фасовали в пробирки эппендорф, замораживали в жидком азоте и сохраняли ее при температуре от -20 до -18°С до начала анализов. Для реализации способа размороженные пробы сыворотки отбирали в количестве 0,5 см³, к ним добавляли раствор внутреннего стандарта и выполняли подготовку двумя вариантами для количественного измерения. Условия хроматографического измерения и количественного расчета указаны выше.

Доброволец (проба сыворотки № 60): мужчина С, возраст 58 лет, вес 60 кг, рост 1,55 м, проживает пос. Антипаюта (Ямало-Ненецкий АО), ИМТ 34,97.

Доброволец (проба сыворотки № 55): женщина Т., возраст 42 года, вес 78 кг, рост 1,54 м., проживает пос. Красный Селькуп (Ямало-Ненецкий АО), ИМТ 31,62.

Доброволец (проба сыворотки № 43): мужчина К., возраст 32 года, вес 75 кг, рост 1,82 м., проживает пос. Толька (Ямало-Ненецкий АО), ИМТ 22,64.

Результаты по трем пробам представлены в таблице 1.

Пример 2. В 2019 г. обследовано взрослое население г. Архангельска от 20 до 25 лет в количестве 30 человек, постоянно проживающих в г. Архангельске, вне периода обострения их хронических заболеваний. С участниками обследования проведено анкетирование, включающее вопросы о возрасте, весе, росте, месте проживания. Исследование проводилось с согласия обследуемых и в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта» (с изменениями и дополнениями 2013 г). Забор слюны производился утром с 8:00 до 10:00 часов натощак в стеклянные бюксы с последующим отбором проб в пробирки типа Эппендорф и замораживанием при температуре от -20 до -18°С до выполнения анализа. Для исследования пробы отбирали слюну в объеме 1,0÷2,0 см³, добавляли раствор внутреннего стандарта и выполняли пробоподготовку для количественного измерения МЭЖК двумя вариантами. Условия хроматографического измерения и количественного расчета указаны выше.

Доброволец (проба слюны № 2): мужчина Л., возраст 21 год, вес 70 кг, рост 1,78 м, проживает в г. Архангельск, ИМТ 22,08.

Доброволец (проба слюны № 10): мужчина Т., возраст 23 года, вес 68 кг, рост 1,81 м, проживает в г. Архангельск, ИМТ 20,8.

Доброволец (проба слюны № 27): мужчина И., возраст 21 год, вес 68 кг, рост 1,74 м, проживает в г. Архангельск, ИМТ 22,44. Результат по трем пробам представлен в таблице 2.

Пример 3. Вылов рыб как продуктов питания произведен на территории Ямало-Ненецкого АО в марте 2018 г. Образцы тканей рыб отобраны и заморожены при температуре от -20 до -18°С для последующего выполнения анализа. Исследуемый образец в количестве 2÷3 г гомогенизировали в фарфоровой ступке путем растирания пестиком в течение 3÷5 минут до состояния пластичной однородной массы. Температуру гомогенизации поддерживали в интервале от 0 до +4°С. К навеске гомогената ткани рыбы 0,2÷0,5 г, взвешенной с точностью до 0,0002 г, добавляли раствор внутреннего стандарта и выполняли подготовку для количественного измерения двумя вариантами. Условия хроматографического измерения указаны выше. Количественный расчет выполняли с использованием коэффициента приведения результата к 1 г в программе обработки хроматограмм. Пример результата измерения МЭЖК по трем наименованиям рыб различными вариантами подготовки проб приведен в таблице 3.

Пример 4. В июле 2015 и 2016 гг. производился отлов камчатского краба, обитающего в прибрежье Баренцева моря в губе Дальнезеленецкая, с глубин 8÷38 метров. После вскрытия животного проводили отбор образцов органов (10÷30 г), замораживали их и сохраняли до анализа при температуре от -20 до -18°С. В ходе экспедиций отобрано 375 образцов тканей (гепатопанкреас, икра, гемолимфа, гонады, сердце, мышцы). Образцы в количестве 2+3 г гомогенизировали в фарфоровай ступке путем растирания пестиком в течение 5 минут до состояния пластичной однородной массы. Температуру гомогенизации поддерживали в интервале от 0 до +4°С. К навеске гомогената ткани краба 0,1÷0,6 г, взвешенной с точностью до 0,0002 г, добавляли раствор внутреннего стандарта и выполняли подготовку проб для количественного измерения двумя вариантами. Условия хроматографического измерения указаны выше. Количественный расчет выполняли с использованием коэффициента приведения результата к 1 г в программе обработки хроматограмм. Пример результата измерения МЭЖК по трем пробам ткани и органов краба двумя вариантами подготовки проб приведен в таблице 4.

Пример 5. Отбор образцов традиционных продуктов питания проведен на территории Ямало-Ненецкого АО в марте 2018 г. Образцы тканей северного оленя, отобранные в количестве 8-10 г., отмытые физиологическим раствором, с удаленными кровеносными сосудами, измельченные ножницами и замороженные при температуре от -20 до -18°С, сохранялись до анализа. Образцы в количестве 2-3 г гомогенизировали в фарфоровой ступке путем растирания пестиком в течение 5 минут до состояния пластичной однородной массы. Температуру гомогенизации поддерживали в интервале от 0 до +4°С. К навеске гомогената ткани 0,1÷0,5 г, взвешенной с точностью до 0,0002 г, добавляли раствор внутреннего стандарта и выполняли подготовку для количественного измерения двумя вариантами. Условия хроматографического измерения указаны выше. Количественный расчет выполнен с применением коэффициента приведения результата к 1 г в программе обработки хроматограмм. Пример результата измерения МЭЖК по трем пробам биологических тканей оленя двумя вариантами подготовки проб приведен в таблице 5.

Пример 6. Образцы растительной ткани предоставлены Федеральным государственным унитарным предприятием «Котласское» Приморского филиала ФИЦКИА РАН в количестве 25 проб размола зерна (результаты работы по селекции и семеноводству сельскохозяйственных культур 2017, 2018 г.). Предварительно определяли влажность представленных образцов. Гомогенизацию выполняли растиранием размола в ступке пестиком до однородной массы (муки), время обработки 5 минут. К навеске гомогената зерна 0,1÷0,5 г, взвешенной с точностью до 0,0002 г, добавляли раствор внутреннего стандарта и выполняли подготовку для количественного измерения двумя вариантами. Условия хроматографического измерения указаны выше. Количественный расчет выполняли с применением коэффициента приведения результата к 1 г. в программе обработки хроматограмм. Конечный результат пересчитывали на абсолютно сухое вещество. Результат по трем образцам размола зерна приведен в таблице 6.

Изобретение относится к различным областям народного хозяйства (медицине, химической и фармацевтической промышленности), где есть потребность в измерении массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах, в том числе животных и растительных тканях методом газожидкостной хроматографии. Способ измерений массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах методом газожидкостной хроматографии включает экстракцию липидов, метилирование жирных кислот путем переэтерификации липидов в присутствии кислотного катализатора, экстракцию МЭЖК, упаривание экстрактов липидов и МЭЖК вариантами под атмосферным давлением или под вакуумом, идентификацию и измерение массовой концентрации метиловых эфиров 43 жирных кислот в диапазоне 0,3-1000 мкг/см³ с помощью газожидкостной хроматографии методом внутреннего стандарта, где в качестве биологических сред используются жидкие среды слюны, гемолимфы, ткани растений, рыб или животных; в процессе подготовки проб выполняется гомогенизация образцов тканей и их взвешивание с точностью до 0,0002 г, с последующим расчетом массовой концентрации каждого МЭЖК в мкг/г по формуле:

где: Х - массовая концентрация каждого МЭЖК в пробе, мкг/г; А - отношение площадей откликов детектора для данного МЭЖК к стандарту; В - калибровочный коэффициент для данного МЭЖК; С - количество внутреннего стандарта, добавленного к навеске пробы, мкг; К - коэффициент приведения результата измерения к 1 г (К=1 / масса навески на анализ, г). Изобретение позволяет выделить и количественно измерить МЭЖК даже в малых дозах биологических образцов, низком содержании жирных кислот в образце. Это достигается путем применения вакуумного оборудования, что увеличивает количественный выход МЭЖК в 1,2÷1,7 раза, повышая тем самым чувствительность и достоверность способа. 6 табл., 6 пр.

Способ измерений массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах методом газожидкостной хроматографии, включающий экстракцию липидов, метилирование жирных кислот путем переэтерификации липидов в присутствии кислотного катализатора, экстракцию МЭЖК, упаривание экстрактов липидов и МЭЖК вариантами под атмосферным давлением или под вакуумом, идентификацию и измерение массовой концентрации метиловых эфиров 43 жирных кислот в диапазоне 0,3-1000 мкг/см³ с помощью газожидкостной хроматографии методом внутреннего стандарта, отличающийся тем, что в качестве биологических сред используются жидкие среды слюны, гемолимфы, ткани растений, рыб или животных; в процессе подготовки проб выполняется гомогенизация образцов тканей и их взвешивание с точностью до 0,0002 г, с последующим расчетом массовой концентрации каждого МЭЖК в мкг/г по формуле:

где: Х - массовая концентрация каждого МЭЖК в пробе, мкг/г;

А - отношение площадей откликов детектора для данного МЭЖК к стандарту;

В - калибровочный коэффициент для данного МЭЖК;

С - количество внутреннего стандарта, добавленного к навеске пробы, мкг;

К - коэффициент приведения результата измерения к 1 г (К=1 / масса навески на анализ, г).