СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА Российский патент 2004 года по МПК B01J20/22 G01N33/72 G01N30/48 

Изобретение относится к области получения сорбентов для отделения и определения гликопротеинов. Сорбенты могут быть использованы, например, для хроматографического определения гликозилированного гемоглобина в крови.

Известен сорбент, представляющий собой привитую аминофенилборную кислоту на кремнеземном носителе, используемый для определения гликозилированного гемоглобина, и способ его получения, включающий модификацию кремнезема γ-глицидооксипропилтриэтоксисиланом и прививку активных групп аминофенилборной кислоты в количестве 80-100 ммоль на 1 грамм сорбента (RU, патент 2040963, В 01 J 20/10, 1995).

Известен способ получения сорбента на основе агарозных производных аминофенилборной кислоты общей формулы

(US, патент 4562251, 1985).

Вышеуказанный способ является трудоемким из-за его многостадийности, при этом активность полученных производных оценивается от 5 до 20 экв/мл.

Известен способ получения сорбента для гликопротеинов, включающий обработку агарозного носителя диглицидиловым эфиром двухатомных спиртов жирного ряда, промывку обработку раствором, содержащим м-аминофенилборную кислоту и промывку (US, патент 4269605, 1981).

Недостатками способа являются сравнительно невысокая емкость и стабильность сорбента получаемого по этому способу.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбента, используемого для выделения гликопротеинов, включающий обработку агарозного носителя диглицидиловым эфиром этиленгликоля, промывку, обработку раствором, содержащим м-аминофенилборную кислоту, промывку привитого сорбента и обработку раствором нитрита натрия в хлористоводородной кислоте (RU, патент 2125907, кл. В 01 J 20/26).

Полученный продукт можно представить формулой

Недостатками сорбента, получаемого по этому способа, являются сравнительно невысокая селективность по данным за счет препаративного выделения и электрофоретического разделения гликированной фракции гемоглобина и нестабильность при хранении (потемнение за счет окисления и, как следствие, искажение результатов определения).

Задача изобретения - способ получения сорбента, обладающего более выраженной селективностью по отношению к гликированной фракции гемоглобина и более стабильного при хранении.

Поставленная задача решается способом получения сорбента путем взаимодействия агарозного носителя с диглицидиловым эфиром этиленгликоля, промывки, обработки раствором 4-аминометилфенилборной кислоты

и промывки привитого сорбента.

Пример получения.

Сефарозу 6В (агарозный гель) (1 мл) промывают дистиллированной водой и фильтруют под вакуумом. Промытый гель суспендируют в щелочном растворе 1 мл диглицидилового эфира этиленгликоля при комнатной температуре. Затем гель отфильтровывают и промывают дистиллированной водой при 5-10^oС. Промытый продукт подвергают обработке раствором (40 мг в 1 мл) 4-аминометилфенилборной кислоты при рН 8-10 в течение 24 часов при 35-40^oС, получают целевой сорбент.

Для подтверждения более выраженной селективности выделения HbA1c сорбентом с привитой 4-аминометилфенилбороновой кислотой (заявляемый способ) по сравнению с сорбентом с привитой 3-аминофенилборной кислотой (прототип) были проведены эксперименты по препаративному выделению и электрофоретическому разделению гликированной фракции гемоглобина.

Гемолизат крови с высоким содержанием гликированного гемоглобина путем инкубации с глюкозой многократно фракционировался с использованием микроколонок с заявляемым и прототипным сорбентом.

Около 100 мл собранной гликированной фракции каждого из примененных сорбентов подвергались концентрированию на ячейках для ультрофильтрации фирмы "Амикон" с использованием фильтров РМ 30, фирмы "Амикон" (США), до конечного объема 1 мл. Содержание гемоглобина гликированной фракции для первого и второго сорбента составило по 3,2 ммол/л.

Электрофорез гликированной фракции гемоглобина проводили с использованием наборов "BECKMAN Paragon HbAlc Cel"
На электрофореграммах выявляются две доминирующие фракции: а) фракция, соответствующая электрофоретической подвижности НbАо, и б) фракция HbA1c.

Сканирование электрофореграмм на денситометре "Эпрайз" фирмы "Бекман" (США) показало, что содержание HbA1c, выделенного с помощью сорбента с 4-аминометилфенилборной кислотой, составило 64,9%, или 2,08 ммол/л, что существенно превалировало по сравнению с содержанием HbA1c, выделенного на сорбенте с 3-аминофенилборной кислотой - 52,6%, или 1,68 ммол/л. Преимущество выделения HbAlc заявляемым способом по сравнению с прототипом составило 24%.

Таким образом, экспериментально показано, что сорбент с привитой 4-аминометилфенилборной кислотой за счет стереохимического расположения акцептирующего участка обладает более выраженной селективной способностью связывания HbA1c по сравнению с сорбентом, содержащим 3-аминофенилборную кислоту.

Кроме того, как показало наблюдение за сорбентом, получаемым в соответствии с изобретением, он не меняет окраски в течение 6 месяцев, тогда как известный сорбент темнеет уже в течение первых двух месяцев после синтеза.

Изобретение относится к сорбентам для определения гликопротеинов. Предложен способ получения сорбента для отделения и определения гликопротеинов путем взаимодействия агарозного носителя с диглицидиловым эфиром этиленгликоля и последующей обработки полученного продукта 4-аминометилфенилборной кислотой. Сорбент, получаемый по заявляемому способу, обладает более выраженной селективностью и более устойчив при хранении.

Способ получения сорбента, используемого для выделения гликопротеинов, включающий обработку агарозного носителя диглицидиловым эфиром этиленгликоля, промывку, обработку раствором, содержащим производное фенилборной кислоты и промывку сорбента с привитым производным фенилборной кислоты, отличающийся тем, что в качестве производного фенилборной кислоты используют 4-аминометилфенилборную кислоту.